高級_生化課件生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用

1、 生物醫(yī)學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室生物醫(yī)學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室(PI) (PI) 蘭文軍蘭文軍第一編第一編 概概 述述第二編第二編 純化方法純化方法第三編第三編 鑒定方法鑒定方法第一章第一章 生命大分子物質(zhì)的制備生命大分子物質(zhì)的制備第一節(jié)第一節(jié) 材料的選擇與處理材料的選擇與處理第二節(jié)第二節(jié) 確定測定方法確定測定方法第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞的破碎細(xì)胞的破碎第四節(jié)第四節(jié) 抽提抽提第五節(jié)第五節(jié) 濃縮濃縮第六節(jié)第六節(jié) 純化方案的設(shè)計(jì)與評價(jià)純化方案的設(shè)計(jì)與評價(jià)第七節(jié)第七節(jié) 有效成分純度和性質(zhì)的分析有效成分純度和性質(zhì)的分析第八節(jié)第八節(jié) 應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例一、材料的選擇一、材料的選擇二、材料的處理二、材料的處理有效成分：指欲純化的某種單一

2、的生命有效成分：指欲純化的某種單一的生命 大分子物質(zhì)。有效成分具有含量少和穩(wěn)定大分子物質(zhì)。有效成分具有含量少和穩(wěn)定性差的特性。性差的特性。材料選擇原則材料選擇原則(1)含量多、穩(wěn)定性好；含量多、穩(wěn)定性好； (2)來源豐富、保持新鮮；來源豐富、保持新鮮； (3)工藝簡單、有利用價(jià)值。工藝簡單、有利用價(jià)值。 1 1、動物臟器：、動物臟器： (1) (1)冰凍：短時(shí)間零下冰凍：短時(shí)間零下1010冰庫或零下冰庫或零下70 70 低溫冰箱（數(shù)月）貯存；低溫冰箱（數(shù)月）貯存； (2) (2)脫脂：人工剝離；有機(jī)溶劑；快冷快熱；脫脂：人工剝離；有機(jī)溶劑；快冷快熱；脂肪分離器；脂肪分離器； (3) (3)干燥

3、：丙酮中脫水；沸水中蒸煮烘干干燥：丙酮中脫水；沸水中蒸煮烘干。2 2、植物組織：、植物組織：(1)(1)葉片：水洗凈或在葉片：水洗凈或在1010小時(shí)內(nèi)置零下小時(shí)內(nèi)置零下4 4 到零下到零下30 30 冰箱貯藏備用冰箱貯藏備用; ;(2)(2)種子：泡脹或粉碎。種子：泡脹或粉碎。3 3、微生物：、微生物： (1)(1)胞內(nèi)活性分子：離心法收集上清液，低溫胞內(nèi)活性分子：離心法收集上清液，低溫下短時(shí)間貯存下短時(shí)間貯存; ;(2)(2)胞外活性分子：經(jīng)破細(xì)胞膜處理后提取，胞外活性分子：經(jīng)破細(xì)胞膜處理后提取，制成凍干粉。制成凍干粉。一、一、目的和要求目的和要求二、二、常用的測定方法常用的測定方法確定的方

4、法簡單、靈敏、需時(shí)少、專一性確定的方法簡單、靈敏、需時(shí)少、專一性 1. 1.光譜法光譜法(1)(1)吸收光譜法吸收光譜法（absorption spectrophotometry)absorption spectrophotometry) 直接測定法：將待測物配制成一定濃度的溶液直接測定法：將待測物配制成一定濃度的溶液 移至分光光度計(jì)，讀取吸光度。移至分光光度計(jì)，讀取吸光度。吸光度與待測物吸光度與待測物 濃度成正比濃度成正比。例如：總蛋白含量的測定。例如：總蛋白含量的測定。 比色法（間接法）：將待測物與相關(guān)試劑或酶的比色法（間接法）：將待測物與相關(guān)試劑或酶的 底物作用后，移至分光光度計(jì)，讀取吸

5、光度。例如：底物作用后，移至分光光度計(jì)，讀取吸光度。例如： 酶活性的測定。酶活性的測定。(2)(2)熒光光譜法熒光光譜法( (fluo-spectrophotometry)fluo-spectrophotometry) 激發(fā)光激發(fā)待測物質(zhì)發(fā)射發(fā)射光，讀取激發(fā)光激發(fā)待測物質(zhì)發(fā)射發(fā)射光，讀取 熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度與待測物質(zhì)濃度成正熒光強(qiáng)度與待測物質(zhì)濃度成正 比比。熒光光譜法的精確性、重復(fù)性和靈敏。熒光光譜法的精確性、重復(fù)性和靈敏 度比吸收光譜法好。度比吸收光譜法好。例如：乙醇中蒽的測定例如：乙醇中蒽的測定。(3)(3)濁度法濁度法 極稀的懸浮液采用此法，測定懸浮液在極稀的懸浮液采用此法，測

6、定懸浮液在不被吸收的波長不被吸收的波長下表現(xiàn)的消光值。下表現(xiàn)的消光值。2.2.電化學(xué)法電化學(xué)法 有些反應(yīng)可放出質(zhì)子氫，可用有些反應(yīng)可放出質(zhì)子氫，可用PHPH計(jì)或計(jì)或NaOHNaOH滴定等方法追蹤變化計(jì)算出待測物的滴定等方法追蹤變化計(jì)算出待測物的含量。含量。3.3.生物活性檢測法生物活性檢測法 細(xì)胞或動物攝入待測物質(zhì)后，待測物質(zhì)細(xì)胞或動物攝入待測物質(zhì)后，待測物質(zhì)攝入量與細(xì)胞或動物的生理指標(biāo)變化有相攝入量與細(xì)胞或動物的生理指標(biāo)變化有相關(guān)性，以此檢測待測物質(zhì)含量。關(guān)性，以此檢測待測物質(zhì)含量。 4.4.免疫分析法免疫分析法 利用抗原與抗體的特異性反應(yīng)，并結(jié)合利用抗原與抗體的特異性反應(yīng)，并結(jié)合生物標(biāo)記，

7、可對待測物質(zhì)進(jìn)行定量定性分生物標(biāo)記，可對待測物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析。析。5.5.生物傳感器生物傳感器 用生物傳感器中的敏感膜與待測物質(zhì)反用生物傳感器中的敏感膜與待測物質(zhì)反應(yīng)，可通過顯示器反映有效成分的含量。應(yīng)，可通過顯示器反映有效成分的含量。/nmlogloglogmax2max11.1.物理方法物理方法 2.2.化學(xué)處理化學(xué)處理 3.3.生物方法生物方法 （1 1）研磨法：研缽，勻漿器）研磨法：研缽，勻漿器（2 2）搗碎法：搗碎器）搗碎法：搗碎器（3 3）超聲波法：超聲儀）超聲波法：超聲儀（4 4）壓榨法）壓榨法: :擠壓擠壓（5 5）凍融法：低溫冷凍迅速取出）凍融法：低溫冷凍迅速取出（1 1

8、）脂溶性溶劑：丙酮；氯仿；甲苯）脂溶性溶劑：丙酮；氯仿；甲苯（2 2）表面活性劑：十二烷甲基黃酸鈉；十）表面活性劑：十二烷甲基黃酸鈉；十 二烷基硫酸鈉二烷基硫酸鈉（1 1）溶脹）溶脹（2 2）自溶）自溶（3 3）生物酶降解：溶菌酶；蛋白水解酶）生物酶降解：溶菌酶；蛋白水解酶K K一一. .抽提的含義抽提的含義二二. .抽提有效成分的影響因子抽提有效成分的影響因子 用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒?，從原料中把用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒ǎ瑥脑现邪延行С煞址蛛x出來的過程。有效成分分離出來的過程。用緩沖液，用緩沖液，稀酸，稀堿或有機(jī)溶劑（丙酮，乙醇）稀酸，稀堿或有機(jī)溶劑（丙酮，乙醇）等抽提，有時(shí)還可以用蒸餾水抽提。等抽提

9、，有時(shí)還可以用蒸餾水抽提。 1.PH1.PH值值2.2.溶劑的極性和離子強(qiáng)度溶劑的極性和離子強(qiáng)度3.3.水解酶水解酶4.4.溫度：選擇合適的抽提溫度溫度：選擇合適的抽提溫度5.5.攪拌：溫和攪拌可增加溶解度攪拌：溫和攪拌可增加溶解度 6.6.氧化氧化7.7.金屬離子金屬離子8.8.抽提液與抽提物的比例抽提液與抽提物的比例:1:5:1:5 1.PH1.PH值值 對蛋白質(zhì)或酶等具有等電點(diǎn)的兩性電對蛋白質(zhì)或酶等具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)物質(zhì)，選擇抽提液的解質(zhì)物質(zhì)，選擇抽提液的PHPH值在偏離等電值在偏離等電點(diǎn)。點(diǎn)。2.2.溶劑的極性和離子強(qiáng)度溶劑的極性和離子強(qiáng)度有些蛋白質(zhì)或酶在極性大、離子強(qiáng)度大的溶液有

10、些蛋白質(zhì)或酶在極性大、離子強(qiáng)度大的溶液中穩(wěn)定，有些則相反中穩(wěn)定，有些則相反加入蔗糖、甘油、加入蔗糖、甘油、DMSODMSO降低溶液極性降低溶液極性加入加入KCLKCL、NaCLNaCL、NH4CLNH4CL升高溶液離子強(qiáng)度升高溶液離子強(qiáng)度3.3.水解酶水解酶 為防止酶與欲抽提的蛋白質(zhì)或核酸發(fā)生為防止酶與欲抽提的蛋白質(zhì)或核酸發(fā)生反應(yīng)，采取以下措施：反應(yīng)，采取以下措施：(1)(1)加入加入PMSFPMSF等酶抑制劑；等酶抑制劑；(2)(2)調(diào)節(jié)抽提液的極性、離子強(qiáng)度和調(diào)節(jié)抽提液的極性、離子強(qiáng)度和PHPH值。值。 6.6.氧化氧化一般蛋白質(zhì)或酶含有必需集團(tuán)巰基，若抽提液一般蛋白質(zhì)或酶含有必需集團(tuán)巰基

11、，若抽提液 中存在氧化劑或氧分子時(shí)，會使巰基形成分子內(nèi)或中存在氧化劑或氧分子時(shí)，會使巰基形成分子內(nèi)或分子間二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。為此，常加入分子間二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。為此，常加入2-2-巰基乙醇、半胱氨酸還原劑。巰基乙醇、半胱氨酸還原劑。植物組織和微生物細(xì)胞中含酚類物質(zhì)，在多酚氧化植物組織和微生物細(xì)胞中含酚類物質(zhì)，在多酚氧化酶作用下，可變?yōu)橛猩孽愇镔|(zhì)。加入苯基硫脲，酶作用下，可變?yōu)橛猩孽愇镔|(zhì)。加入苯基硫脲，可抑制這一反應(yīng)?？梢种七@一反應(yīng)。7.7.金屬離子金屬離子 蛋白質(zhì)的巰基還能與源于緩沖液金屬離子鉛、蛋白質(zhì)的巰基還能與源于緩沖液金屬離子鉛、鐵、銅作用，產(chǎn)生沉淀。解決辦法：鐵、銅

12、作用，產(chǎn)生沉淀。解決辦法： 無離子水配制緩沖液無離子水配制緩沖液 加入加入1-31-3mM EDTAmM EDTA一一. .沉淀法沉淀法二二. .吸附法吸附法三三. .超過濾法超過濾法四四. .透析法透析法五五. .減壓蒸餾法減壓蒸餾法六六. .冰凍干燥法冰凍干燥法 一一. .沉淀法沉淀法 抽提液中加入適量的中性鹽如硫酸氨或抽提液中加入適量的中性鹽如硫酸氨或有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑, ,使有效成分沉淀，離心除去不使有效成分沉淀，離心除去不溶物，獲得上清透析或?qū)游鲋}。溶物，獲得上清透析或?qū)游鲋}。 二二. .吸附法吸附法 干葡聚糖凝膠干葡聚糖凝膠G25G25或吸水棒加入抽提液，或吸水棒加入抽提液，

13、兩者比例一比五，能縮小抽提液體積三兩者比例一比五，能縮小抽提液體積三倍左右倍左右. . 三三. .超過濾法超過濾法 在空氣或氮?dú)鈮毫ο?，使小分子物質(zhì)通在空氣或氮?dú)鈮毫ο?，使小分子物質(zhì)通過半透膜而大分子物質(zhì)留在膜內(nèi)的裝置。過半透膜而大分子物質(zhì)留在膜內(nèi)的裝置。 四四. . 透析法透析法（1 1）把裝透析液的透析袋埋在吸水力強(qiáng)的）把裝透析液的透析袋埋在吸水力強(qiáng)的 聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG或甘油中；或甘油中；（2 2）真空透析。）真空透析。五五. .減壓蒸餾法減壓蒸餾法 簡易減壓蒸餾裝置（降低沸點(diǎn)）簡易減壓蒸餾裝置（降低沸點(diǎn)）. . 六六. . 冰凍干燥法冰凍干燥法 冰凍的抽提液在真空狀態(tài)下，可由

14、固體冰凍的抽提液在真空狀態(tài)下，可由固體直接變?yōu)闅怏w。直接變?yōu)闅怏w。一一. .純化方案的設(shè)計(jì)純化方案的設(shè)計(jì)二二. .純化方案的評價(jià)純化方案的評價(jià)一一. . 純化方案的設(shè)計(jì)純化方案的設(shè)計(jì)純化的總原則：考慮抽提液中有效成分與純化的總原則：考慮抽提液中有效成分與雜質(zhì)的理化性質(zhì)差異，幾種方法組成一個(gè)雜質(zhì)的理化性質(zhì)差異，幾種方法組成一個(gè)科學(xué)合理的純化方案科學(xué)合理的純化方案切忌：一種方法重復(fù)使用切忌：一種方法重復(fù)使用二二. .純化方案的評價(jià)純化方案的評價(jià) 考察比活力、純化倍數(shù)和收得率考察比活力、純化倍數(shù)和收得率第二章第二章 沉淀法沉淀法第三章第三章 吸附層析吸附層析第四章第四章 疏水層析疏水層析第五章第五章

15、 離子交換層析離子交換層析第六章第六章 凝膠過濾凝膠過濾第七章第七章 親和層析親和層析第八章第八章 聚焦層析聚焦層析第九章第九章 高效液相色譜高效液相色譜第十章第十章 固定化的酶與微生物固定化的酶與微生物第一節(jié)第一節(jié) 基本原理與沉淀類型基本原理與沉淀類型第二節(jié)第二節(jié) 應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例一、基本原理一、基本原理二、制備蛋白質(zhì)二、制備蛋白質(zhì)三、制備核酸三、制備核酸 根據(jù)各種物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，改變?nèi)苜|(zhì)的性質(zhì)，根據(jù)各種物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，改變?nèi)苜|(zhì)的性質(zhì)，致使抽提液有效成分溶解度變化。致使抽提液有效成分溶解度變化。1. 1. 鹽析法鹽析法2. 2. 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法3. 3. 蛋白質(zhì)沉淀法蛋白質(zhì)沉淀法4

16、. 4. 聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法5. 5. 選擇性沉淀法選擇性沉淀法6. 6. 結(jié)晶沉淀法結(jié)晶沉淀法(1) (1) 鹽分級沉淀鹽分級沉淀(2) (2) 鹽析曲線制作鹽析曲線制作(3) (3) 鹽析的影響因子鹽析的影響因子(4) (4) 脫鹽脫鹽(1)(1)鹽分級沉淀鹽分級沉淀 鹽的選擇：常選用硫酸銨鹽的選擇：常選用硫酸銨 硫酸銨鹽析硫酸銨鹽析 A.A.固體法：逐步加入固體硫酸銨，當(dāng)加到一定固體法：逐步加入固體硫酸銨，當(dāng)加到一定 的飽和度時(shí)，蛋白質(zhì)便可沉淀出來。的飽和度時(shí)，蛋白質(zhì)便可沉淀出來。 B.B.飽和溶液法：逐步加入預(yù)先調(diào)好飽和溶液法：逐步加入預(yù)先調(diào)好pHpH值的飽和硫酸銨，值的飽和

17、硫酸銨， 蛋白質(zhì)便可沉淀出來。蛋白質(zhì)便可沉淀出來。 C. C.透析法：透析袋放入一定濃度的大體積溶液中，通過透析法：透析袋放入一定濃度的大體積溶液中，通過 透析作用來改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度，沉淀蛋白質(zhì)透析作用來改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度，沉淀蛋白質(zhì) 。(2)(2)鹽析曲線制作鹽析曲線制作 硫酸銨飽和度硫酸銨飽和度% % VS VS 蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)沉淀% % (3)(3)鹽析的影響因子鹽析的影響因子 鹽析常數(shù)鹽析常數(shù) 鹽分級范圍的差異性鹽分級范圍的差異性 PHPH和鹽濃度和鹽濃度 蛋白質(zhì)的純度和濃度蛋白質(zhì)的純度和濃度 其它其它鹽析常數(shù)鹽析常數(shù) lgS=beta-Ks X MlgS=beta-K

18、s X M 其中，其中，S S表示蛋白質(zhì)的溶解度，表示蛋白質(zhì)的溶解度，M M表示溶液中鹽表示溶液中鹽的濃度。的濃度。 鹽析常數(shù)鹽析常數(shù)KsKs值大，意味著蛋白溶解度減低速度值大，意味著蛋白溶解度減低速度隨著鹽濃度增加而快速降低。隨著鹽濃度增加而快速降低。 鹽分級范圍的差異性鹽分級范圍的差異性 當(dāng)分離兩種以上蛋白質(zhì)時(shí)，若每一種蛋當(dāng)分離兩種以上蛋白質(zhì)時(shí)，若每一種蛋 白質(zhì)的的白質(zhì)的的KsKs值都大，而且鹽析范圍差異明顯，值都大，而且鹽析范圍差異明顯，則分離效果好。則分離效果好。 蛋白質(zhì)的純度和濃度蛋白質(zhì)的純度和濃度 一般控制樣品液蛋白質(zhì)濃度在一般控制樣品液蛋白質(zhì)濃度在0.2%-2%0.2%-2%為宜

19、。為宜。其它其它有時(shí)需在溶液中加有時(shí)需在溶液中加1 1mMmM的的EDTAEDTA鹽，除金屬離子鹽，除金屬離子硫酸銨沉淀時(shí)間控制好，一般在硫酸銨沉淀時(shí)間控制好，一般在2 2h h左右左右(4)(4)脫鹽：凝膠過濾法和透析法脫鹽：凝膠過濾法和透析法 透析法注意事項(xiàng)透析法注意事項(xiàng) 透析帶處理：用蒸餾水洗凈，檢查無漏洞透析帶處理：用蒸餾水洗凈，檢查無漏洞 透析液選擇：一般為低離子強(qiáng)度中性緩沖液透析液選擇：一般為低離子強(qiáng)度中性緩沖液 掌握透析時(shí)間：攪拌，樣品液與透析液體積掌握透析時(shí)間：攪拌，樣品液與透析液體積 比為比為1 1：1010，3 3h.h. 基本原理：與鹽溶液一樣具有脫水作用；有機(jī)溶基本原理

20、：與鹽溶液一樣具有脫水作用；有機(jī)溶劑介電常數(shù)比水小，使溶劑極性減小劑介電常數(shù)比水小，使溶劑極性減小注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) (1)低溫下操作低溫下操作 防止有機(jī)溶劑的放熱使蛋白變性防止有機(jī)溶劑的放熱使蛋白變性 (2)中性鹽作用中性鹽作用 增加蛋白質(zhì)溶解度，防變性增加蛋白質(zhì)溶解度，防變性 (3)多價(jià)陽離子作用多價(jià)陽離子作用 結(jié)合蛋白質(zhì)，致其溶解度降低結(jié)合蛋白質(zhì)，致其溶解度降低鹽沉淀法和有機(jī)溶劑沉淀法可以沉淀很多蛋鹽沉淀法和有機(jī)溶劑沉淀法可以沉淀很多蛋白質(zhì)，但是蛋白質(zhì)沉淀法則僅對一類或一種白質(zhì)，但是蛋白質(zhì)沉淀法則僅對一類或一種蛋白質(zhì)起作用。蛋白質(zhì)起作用。常用堿性蛋白質(zhì)、凝集素和重金屬離子。常用堿性蛋白質(zhì)、

21、凝集素和重金屬離子。 聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。離子型聚合物可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。 根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同物理化學(xué)因子作根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同物理化學(xué)因子作用下穩(wěn)定性不同的熱點(diǎn)，用選擇性沉淀法，用下穩(wěn)定性不同的熱點(diǎn)，用選擇性沉淀法，即可使雜蛋白變性沉淀，而欲分離的有效成即可使雜蛋白變性沉淀，而欲分離的有效成分則存在于溶液中，從而達(dá)到純化有效成分分則存在于溶液中，從而達(dá)到純化有效成分的目的。的目的。蛋白質(zhì)沉淀可分為晶體沉淀和無定形沉淀兩類蛋白質(zhì)沉淀可分為晶體沉淀和無定形沉淀兩類 ，前者分子排列有規(guī)則，后者分子排列無規(guī)則，

22、前者分子排列有規(guī)則，后者分子排列無規(guī)則在提純階段，當(dāng)某一蛋白質(zhì)濃度達(dá)到在提純階段，當(dāng)某一蛋白質(zhì)濃度達(dá)到5%- 30%5%- 30%水平時(shí)，只要條件合適，就能產(chǎn)生一一定形狀水平時(shí)，只要條件合適，就能產(chǎn)生一一定形狀的晶體的晶體1.1.DNA/RNPDNA/RNP復(fù)合物的解聚復(fù)合物的解聚2.2.多糖等雜質(zhì)的消除多糖等雜質(zhì)的消除3.3.核酸沉淀核酸沉淀 通常使通常使DNA/RNPDNA/RNP復(fù)合物有效解聚的辦法，主要復(fù)合物有效解聚的辦法，主要是采用加入去污劑、有機(jī)溶劑和蛋白水解酶等是采用加入去污劑、有機(jī)溶劑和蛋白水解酶等試劑加以實(shí)現(xiàn)。試劑加以實(shí)現(xiàn)。(1)(1)去污劑去污劑: :SDSSDS、DOCD

23、OC、NP40NP40、Triton X-100Triton X-100(2)(2)有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑: :苯酚、氯仿（注意事項(xiàng)苯酚、氯仿（注意事項(xiàng)P34P34）(3)(3)蛋白水解酶：溶菌酶、蛋白酶蛋白水解酶：溶菌酶、蛋白酶E/KE/K(1)(1)多糖多糖(2)(2)DNADNA與與RNARNA的分離的分離(1)(1)多糖多糖動物材料分離多糖，處理前饑餓動物材料分離多糖，處理前饑餓1212h h植物材料分離多糖，處理前暗室培養(yǎng)數(shù)天植物材料分離多糖，處理前暗室培養(yǎng)數(shù)天核酸分離液中多糖，使用選擇性沉淀劑核酸分離液中多糖，使用選擇性沉淀劑(2)(2)DNADNA與與RNARNA的分離的分離 鹽析：鹽

24、析：NaCLNaCL分離分離DNADNA和和RNARNA 酶水解法：提取酶水解法：提取DNADNA時(shí)，可用時(shí)，可用RNase;RNase;反之，可反之，可 用用DNaseDNase 在核酸溶液中加入某些有機(jī)溶劑和非離子型在核酸溶液中加入某些有機(jī)溶劑和非離子型聚合物等試劑時(shí)，核酸會被有效沉淀出來。聚合物等試劑時(shí)，核酸會被有效沉淀出來。(1)(1)有機(jī)溶劑：乙醇有機(jī)溶劑：乙醇- -鹽溶液、乙丙醇鹽溶液、乙丙醇(2)(2)聚乙二醇聚乙二醇(3)(3)CTABCTAB一、皮磷酸二酯酶的純化一、皮磷酸二酯酶的純化二、細(xì)菌染色體二、細(xì)菌染色體DNADNA的制備的制備1.1.制備丙酮粉制備丙酮粉2.2.第一

25、次硫酸銨分級第一次硫酸銨分級3.3.第二次硫酸銨分級第二次硫酸銨分級4.4.丙酮分級分離丙酮分級分離 吸附層析又稱色層法或色譜法。按流動相分吸附層析又稱色層法或色譜法。按流動相分類，有液相層析和氣相層析；按固定相床的形式類，有液相層析和氣相層析；按固定相床的形式分類，柱層析、薄層層析、薄膜層析等。按原理分類，柱層析、薄層層析、薄膜層析等。按原理不同可分為：不同可分為： 第一節(jié)第一節(jié) 吸附柱層析吸附柱層析 第二節(jié)第二節(jié) 薄層層析薄層層析 第三節(jié)第三節(jié) 聚酰胺薄層層系聚酰胺薄層層系一、常用術(shù)語一、常用術(shù)語二、基本原理二、基本原理三、吸附劑三、吸附劑四、洗脫劑四、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、

26、層析柱的制備與層析操作六、應(yīng)用與實(shí)例六、應(yīng)用與實(shí)例1.1.固定相固定相 2.2.流動相流動相 3.3.層析層析 4.4.操作容量操作容量 5.5.床體積（床體積（ Vt Vt ） 6.6.洗脫體積（洗脫體積（VeVe）7.7.外水體積外水體積 （VoVo） 8.8.內(nèi)水體積（內(nèi)水體積（ViVi） 9.9.基質(zhì)體積基質(zhì)體積 （VgVg） 10.10.膨脹度膨脹度11.11.分配系數(shù)和遷移率分配系數(shù)和遷移率 固定相是由層析基質(zhì)組成的物質(zhì)，包括固固定相是由層析基質(zhì)組成的物質(zhì)，包括固體物質(zhì)（吸附劑、離子交換劑）和液體物質(zhì)體物質(zhì)（吸附劑、離子交換劑）和液體物質(zhì)（固定在纖維素或硅膠上的溶液）。這些物質(zhì)（固

27、定在纖維素或硅膠上的溶液）。這些物質(zhì)與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換作用。換作用。 在層析過程中推動固定相上的物質(zhì)向一定在層析過程中推動固定相上的物質(zhì)向一定方向移動的液體或氣體稱為流動相。又稱洗方向移動的液體或氣體稱為流動相。又稱洗脫劑或洗滌劑，在薄層層析中稱展層劑。脫劑或洗滌劑，在薄層層析中稱展層劑。 以基質(zhì)為固定相，以液體或氣體為流動以基質(zhì)為固定相，以液體或氣體為流動相，有效成分和雜志在這兩個(gè)相中連續(xù)多次相，有效成分和雜志在這兩個(gè)相中連續(xù)多次地進(jìn)行分配、吸附或交換作用，最終結(jié)果是地進(jìn)行分配、吸附或交換作用，最終結(jié)果是使混合物得到分離。使混合

28、物得到分離。 在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量，一般以每克（或毫升）基質(zhì)結(jié)合某量，一般以每克（或毫升）基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)來表示。數(shù)種成分的毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)來表示。數(shù)值大，結(jié)合力強(qiáng)；數(shù)值小，結(jié)合力弱。值大，結(jié)合力強(qiáng)；數(shù)值小，結(jié)合力弱。 膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積（膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積（ Vt Vt ）：）： Vt= Vo +Vi+ Vg Vt= Vo +Vi+ Vg 某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大時(shí)的流動相體積

29、?，F(xiàn)濃度達(dá)到最大時(shí)的流動相體積。 外水體積指基質(zhì)顆粒之間體積的總和。外水體積指基質(zhì)顆粒之間體積的總和。 內(nèi)水體積是指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和。內(nèi)水體積是指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和。 基質(zhì)體積是指基質(zhì)自身所具有的體積?；|(zhì)體積是指基質(zhì)自身所具有的體積。 Vo Vo 、ViVi、VgVg都是隨著床體積和基質(zhì)性質(zhì)都是隨著床體積和基質(zhì)性質(zhì)變化而變化的。變化而變化的。 每克溶脹基質(zhì)所具有的床體積。一般每克溶脹基質(zhì)所具有的床體積。一般親水性基質(zhì)的膨脹度比疏水性的大。親水性基質(zhì)的膨脹度比疏水性的大。分配系數(shù)：一組分在固定相與流動相中含分配系數(shù)：一組分在固定相與流動相中含量的比值（量的比值（K K）。）。遷移率：

30、一組分在相同時(shí)間內(nèi)，在固定相遷移率：一組分在相同時(shí)間內(nèi)，在固定相移動的距離與流動相移動距離之比。移動的距離與流動相移動距離之比。 K K值大，說明該組分與固定相結(jié)合力大，遷值大，說明該組分與固定相結(jié)合力大，遷移率??；反之則結(jié)合力小，遷移率大。移率??；反之則結(jié)合力小，遷移率大。 在吸附層析法中，使用的固定相基質(zhì)是顆粒狀在吸附層析法中，使用的固定相基質(zhì)是顆粒狀的吸附劑。在吸附劑的表面存在著許多隨機(jī)分布的吸附劑。在吸附劑的表面存在著許多隨機(jī)分布的吸附位點(diǎn)，這些位點(diǎn)通過范德瓦爾力和靜電引的吸附位點(diǎn)，這些位點(diǎn)通過范德瓦爾力和靜電引力與蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子結(jié)合。結(jié)合力大力與蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子結(jié)合

31、。結(jié)合力大小與生物分子結(jié)構(gòu)和和吸附劑的性質(zhì)有密切關(guān)系。小與生物分子結(jié)構(gòu)和和吸附劑的性質(zhì)有密切關(guān)系。1.1.吸附劑的選擇吸附劑的選擇2.2.吸附劑的性質(zhì)吸附劑的性質(zhì)應(yīng)具備：表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、應(yīng)具備：表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低。穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低。極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)，非極性吸極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)。但是為了解吸附，對于附劑易吸附非極性物質(zhì)。但是為了解吸附，對于極性大的分離物，應(yīng)選擇極性小的吸附劑。極性大的分離物，應(yīng)選擇極性小的吸附劑。 使用前預(yù)處理：過篩除去大顆粒，懸浮除使用前預(yù)處理：過篩除去大顆粒，懸浮除

32、去細(xì)小顆粒，酸、堿浸泡，接著沸水煮，清去細(xì)小顆粒，酸、堿浸泡，接著沸水煮，清水洗，末了用有機(jī)溶劑處理。羥基磷灰石和水洗，末了用有機(jī)溶劑處理。羥基磷灰石和硅膠吸附劑的性質(zhì)。硅膠吸附劑的性質(zhì)。 羥基磷灰石（羥基磷灰石（HAHA）：吸附容量高，穩(wěn)定性好，）：吸附容量高，穩(wěn)定性好，主要用于制備及純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒、和主要用于制備及純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒、和其他生命物質(zhì)。其他生命物質(zhì)。 HA HA為干粉，使用前先在蒸餾水中浸泡。為干粉，使用前先在蒸餾水中浸泡。 HA HA懸浮液需要用旋渦振蕩器混合。懸浮液需要用旋渦振蕩器混合。 忌用檸檬酸緩沖液和忌用檸檬酸緩沖液和Ph5.5Ph5.5的緩沖液

33、。的緩沖液。 細(xì)顆粒操作容量比粗的大，分辨率也比粗的好，細(xì)顆粒操作容量比粗的大，分辨率也比粗的好，但用細(xì)顆粒層析時(shí)，宜采用直徑較大的柱子。但用細(xì)顆粒層析時(shí)，宜采用直徑較大的柱子。性質(zhì)性質(zhì) A. A.含水量含水量 B. B.粒度粒度活化活化活性測定活性測定符合條件符合條件：純度較高；純度較高；穩(wěn)定性好；穩(wěn)定性好；能較完全洗脫下所分離的成分能較完全洗脫下所分離的成分粘度小；粘度小；易和所需要的成分分開。易和所需要的成分分開。1.1.層析柱層析柱2.2.吸附劑的用量吸附劑的用量3.3.裝柱和平衡裝柱和平衡4.4.上樣和洗脫上樣和洗脫5.5.吸附劑的再生吸附劑的再生 一般柱的直徑與長度之比為一般柱的直

34、徑與長度之比為1 1：10-110-1：4040。采用極細(xì)顆粒吸附劑裝柱時(shí)，宜用比例采用極細(xì)顆粒吸附劑裝柱時(shí)，宜用比例大的層析柱，反之采用比例小的層析柱。大的層析柱，反之采用比例小的層析柱。這樣有利于節(jié)省時(shí)間和提高分辨率。這樣有利于節(jié)省時(shí)間和提高分辨率。 操作容量高時(shí)，吸附劑用量少。一般操作容量高時(shí)，吸附劑用量少。一般吸附劑用量為被分離樣品的吸附劑用量為被分離樣品的30-5030-50倍。若倍。若樣品成分難分開，應(yīng)加大吸附劑用量。樣品成分難分開，應(yīng)加大吸附劑用量。 裝柱方法有干裝法和濕裝法。裝柱方法有干裝法和濕裝法。干裝法不宜將氣泡排盡。干裝法不宜將氣泡排盡。濕裝法先加適量溶劑到柱內(nèi)，排走空氣

35、，然濕裝法先加適量溶劑到柱內(nèi)，排走空氣，然后把浸泡好的吸附劑攪勻，隨即將此懸浮液后把浸泡好的吸附劑攪勻，隨即將此懸浮液連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至柱高的連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/4-1/31/3時(shí)打開柱下端開口，讓溶劑慢慢流出，使時(shí)打開柱下端開口，讓溶劑慢慢流出，使柱上端懸浮液徐徐下降至需要的高度。柱上端懸浮液徐徐下降至需要的高度。平衡液流至固定相表面時(shí)，關(guān)閉下端螺旋夾；平衡液流至固定相表面時(shí)，關(guān)閉下端螺旋夾；加樣后，打開螺旋夾；加樣后，打開螺旋夾；樣品液向固定相移動；樣品液向固定相移動；樣品液流至固定相表面時(shí)，關(guān)閉下端螺旋夾；樣品液流至固定相表面時(shí)，關(guān)閉下端螺旋夾；用洗滌

36、液沖洗柱壁后，打開螺旋夾；用洗滌液沖洗柱壁后，打開螺旋夾；洗滌液流至固定相表面時(shí)，關(guān)閉下端螺旋夾；洗滌液流至固定相表面時(shí)，關(guān)閉下端螺旋夾；在柱上加緩沖液，并與儲液瓶連通，打開螺旋夾后在柱上加緩沖液，并與儲液瓶連通，打開螺旋夾后進(jìn)行洗滌。進(jìn)行洗滌。 用過的吸附劑經(jīng)過適當(dāng)處理恢復(fù)其原有性能。用過的吸附劑經(jīng)過適當(dāng)處理恢復(fù)其原有性能。1.1.應(yīng)用應(yīng)用2.2.實(shí)例實(shí)例（1 1）純化生命物質(zhì)）純化生命物質(zhì)（2 2）分離蛋白質(zhì)的亞基）分離蛋白質(zhì)的亞基（3 3）濃縮溶液）濃縮溶液（1 1）用）用HAHA層析柱分離胞質(zhì)型多角體病毒雙鏈層析柱分離胞質(zhì)型多角體病毒雙鏈RNARNA（2 2）用硅膠層析柱分離純化紅曲色

37、素）用硅膠層析柱分離純化紅曲色素（3 3）用硅膠層析柱分離銀杏黃酮類物質(zhì)）用硅膠層析柱分離銀杏黃酮類物質(zhì) 薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上基質(zhì)為固薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上基質(zhì)為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。定相，以液體為流動相的一種層析方法。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 1. 1.展層時(shí)間短展層時(shí)間短 2.2.設(shè)備簡單、操作方便，既適用于分析，也適用于制備設(shè)備簡單、操作方便，既適用于分析，也適用于制備 3.3.溫度變化和溶劑飽和程度對溫度變化和溶劑飽和程度對RfRf值影響較小值影響較小 4.4.可使用腐蝕性顯色劑可使用腐蝕性顯色劑 5. 5.靈敏度高靈敏度高 主要應(yīng)用于鑒定小分子

38、物質(zhì)和制備少量物主要應(yīng)用于鑒定小分子物質(zhì)和制備少量物品，有時(shí)也用于鑒定某些大分子物質(zhì)的純度。品，有時(shí)也用于鑒定某些大分子物質(zhì)的純度。 一一 主要操作過程主要操作過程 二、應(yīng)用實(shí)例二、應(yīng)用實(shí)例1.1.薄板制備薄板制備2.2.點(diǎn)樣點(diǎn)樣3.3.展層展層4.4.顯色顯色玻板玻板制板：制板：a.a.玻棒涂布法玻棒涂布法 b.b.有機(jī)玻璃尺涂布法有機(jī)玻璃尺涂布法c.c.半機(jī)械涂布法半機(jī)械涂布法 活化活化活性測定活性測定點(diǎn)樣量不宜太多，否則會降低點(diǎn)樣量不宜太多，否則會降低RfRf值；值；原點(diǎn)直徑要小于原點(diǎn)直徑要小于2mm2mm；薄層板在空氣中放置時(shí)間要盡量短。薄層板在空氣中放置時(shí)間要盡量短。 把點(diǎn)好樣的薄層

39、板放入預(yù)先飽和的展層裝置把點(diǎn)好樣的薄層板放入預(yù)先飽和的展層裝置中，讓點(diǎn)樣一端浸入展層劑中，其深度約為中，讓點(diǎn)樣一端浸入展層劑中，其深度約為0.5cm0.5cm，切忌樣品點(diǎn)浸入展層劑中。當(dāng)展層劑上升到離玻切忌樣品點(diǎn)浸入展層劑中。當(dāng)展層劑上升到離玻璃板的另一端璃板的另一端0.5-1.0cm0.5-1.0cm時(shí)，停止展層，取出玻璃時(shí)，停止展層，取出玻璃板并立即畫出展層劑的前緣，迅速吹干。板并立即畫出展層劑的前緣，迅速吹干。 注意：選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿?；注意：選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿?使用適當(dāng)?shù)恼箤友b置。使用適當(dāng)?shù)恼箤友b置。 薄層可采用噴霧顯色，展層譜可在紫外薄層可采用噴霧顯色，展層譜可在紫外光下檢測。光下檢測

40、。1.1.用薄層法純化和鑒定淀粉中單半乳糖苷用薄層法純化和鑒定淀粉中單半乳糖苷甘油二酯和雙半乳糖苷甘油二酯；甘油二酯和雙半乳糖苷甘油二酯；2.2.用薄層法檢測環(huán)境中殘留的有機(jī)磷藥物。用薄層法檢測環(huán)境中殘留的有機(jī)磷藥物。一、基本原理一、基本原理二、應(yīng)用實(shí)例二、應(yīng)用實(shí)例 聚酰胺對極性物質(zhì)的吸附作用是由于它能和被聚酰胺對極性物質(zhì)的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。氫鍵的強(qiáng)弱決定了被分離物分離物之間形成氫鍵。氫鍵的強(qiáng)弱決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時(shí)，展層與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時(shí)，展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。因此劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形

41、成氫鍵。因此選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿┦狗蛛x物在聚酰胺膜表面發(fā)生吸選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿┦狗蛛x物在聚酰胺膜表面發(fā)生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的連續(xù)過程，就能附、解吸附、再吸附和再解吸附的連續(xù)過程，就能達(dá)到分離的目的。達(dá)到分離的目的。1.用用DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜層析鑒定肽氨基酸的聚酰胺薄膜層析鑒定肽N末端；末端；2.用用DABTH-氨基酸的薄層層析分析蛋白質(zhì)序列。氨基酸的薄層層析分析蛋白質(zhì)序列。 基本原理：疏水層析也稱疏水作用層析，它是基本原理：疏水層析也稱疏水作用層析，它是根據(jù)有效成分和固定相之間相互作用的疏水力差根據(jù)有效成分和固定相之間相互作用的疏水力差異性大小，進(jìn)而設(shè)法將有效成分分離出來。異性大

42、小，進(jìn)而設(shè)法將有效成分分離出來。第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理第二節(jié)第二節(jié) 操作與應(yīng)用操作與應(yīng)用一、疏水作用一、疏水作用二、吸附劑二、吸附劑結(jié)合作用：結(jié)合作用：1.1.蛋白質(zhì)表面的一些疏水補(bǔ)丁蛋白質(zhì)表面的一些疏水補(bǔ)丁2.2.令蛋白質(zhì)變形，暴露其疏水性殘基令蛋白質(zhì)變形，暴露其疏水性殘基3.3.疏水層析的特性所致疏水層析的特性所致 疏水層析過程中，所使用的固定相一般是疏水層析過程中，所使用的固定相一般是由基質(zhì)和配體兩部分構(gòu)成。由基質(zhì)和配體兩部分構(gòu)成。 1.親水性吸附劑：基質(zhì)主要是交聯(lián)瓊脂糖，親水性吸附劑：基質(zhì)主要是交聯(lián)瓊脂糖， 配體是苯基或辛基化合物。配體是苯基或辛基化合物。 2.非親水性吸附劑：

43、基質(zhì)有硅膠和樹脂，配非親水性吸附劑：基質(zhì)有硅膠和樹脂，配體為苯基、辛基和烷基等。體為苯基、辛基和烷基等。一、層析柱的制備一、層析柱的制備二、加樣與洗脫二、加樣與洗脫三、應(yīng)用實(shí)例三、應(yīng)用實(shí)例1.1.層析柱規(guī)格：層析柱規(guī)格：h:dh:d3 3；2.2.固定相：苯基固定相：苯基-Sepharose CL-4B-Sepharose CL-4B吸附劑吸附劑適合分離純化與芳香族化合物具有親和力適合分離純化與芳香族化合物具有親和力的物質(zhì)，而辛基的物質(zhì)，而辛基- Sepharose CL-4B- Sepharose CL-4B則適用則適用于分離純化親脂性較強(qiáng)的物質(zhì)；于分離純化親脂性較強(qiáng)的物質(zhì)；3.3.裝柱。裝

44、柱。 加樣前，在樣品溶液中加適量鹽類，混勻，加樣前，在樣品溶液中加適量鹽類，混勻，放置片刻即可上柱。當(dāng)把樣品溶液徐徐加入固放置片刻即可上柱。當(dāng)把樣品溶液徐徐加入固定相后，先用平衡緩沖液洗滌，再用降低鹽濃定相后，先用平衡緩沖液洗滌，再用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗滌，同時(shí)用部分收集器分段度的平衡緩沖液洗滌，同時(shí)用部分收集器分段收集洗脫下來的溶液，并對其進(jìn)行檢測。收集洗脫下來的溶液，并對其進(jìn)行檢測。1.純化雞胗鈣調(diào)蛋白純化雞胗鈣調(diào)蛋白2.純化苯丙氨酸裂解酶純化苯丙氨酸裂解酶 離子交換層析是常用的層析方法一，它是在以離離子交換層析是常用的層析方法一，它是在以離子交換劑為固定相，以液體為流動相的系統(tǒng)中進(jìn)行

45、的。子交換劑為固定相，以液體為流動相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。 第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理 第二節(jié)第二節(jié) 離子交換劑的分類及性質(zhì)離子交換劑的分類及性質(zhì) 第三節(jié)第三節(jié) 離子交換劑與緩沖液的選擇離子交換劑與緩沖液的選擇 第四節(jié)第四節(jié) 操作操作 第五節(jié)第五節(jié) 應(yīng)用應(yīng)用離子交換劑是由基質(zhì)、電荷集團(tuán)和反離子構(gòu)成離子交換劑是由基質(zhì)、電荷集團(tuán)和反離子構(gòu)成的，它與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主的，它與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或者借助離子交換劑要以離子交換方式進(jìn)行，或者借助離子交換劑上電荷集團(tuán)對溶液中離子或離子化合物的吸附上電荷集團(tuán)對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。作用進(jìn)行。反應(yīng)

46、通式反應(yīng)通式：離子交換劑與各種水合離子的結(jié)合力是與離子離子交換劑與各種水合離子的結(jié)合力是與離子的電荷量成正比，與水合離子半徑平方成反比。的電荷量成正比，與水合離子半徑平方成反比。RA+BRA+BRB+ARB+A各種陰陽離子結(jié)合力大小的排列順序：各種陰陽離子結(jié)合力大小的排列順序： 一價(jià)陽離子：一價(jià)陽離子：LiLi+ +NaNa+ +KK+ +RbRb+ +CsCs+ + 二價(jià)陽離子：二價(jià)陽離子：MgMg2+2+CaCa2+2+SrSr2+2+BaBa2+2+ 一價(jià)陰離子：一價(jià)陰離子：F F- -ClCl- -BrBr- -II- -不同價(jià)陽離子：不同價(jià)陽離子：NaNa+ +CaCa2+2+AlA

47、l3+3+TiTi4+4+上述排列只適用于稀溶液中；對于呈兩性離子上述排列只適用于稀溶液中；對于呈兩性離子 的蛋白質(zhì)、酶類、多肽和核苷酸等物質(zhì)與離子的蛋白質(zhì)、酶類、多肽和核苷酸等物質(zhì)與離子 交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的物理化學(xué)交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的物理化學(xué) 性質(zhì)和在特定性質(zhì)和在特定pHpH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。 常用的離子交換劑應(yīng)滿足下列要求：常用的離子交換劑應(yīng)滿足下列要求：有高度的不溶性；有高度的不溶性；有疏松的多空結(jié)構(gòu)和巨大的表面積，使有疏松的多空結(jié)構(gòu)和巨大的表面積，使交換離子能在交換劑中進(jìn)行自由擴(kuò)散和交換；交換離子能在交換劑中進(jìn)行自由擴(kuò)散和交換；有較多

48、的交換集團(tuán)；有較多的交換集團(tuán)；有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)。一、分類一、分類二、性質(zhì)二、性質(zhì)1.1.疏水性離子交換劑：疏水性離子交換劑中的基疏水性離子交換劑：疏水性離子交換劑中的基質(zhì)是一種人工合成的、與水結(jié)合力較小的樹脂質(zhì)是一種人工合成的、與水結(jié)合力較小的樹脂物質(zhì)。分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。主物質(zhì)。分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。主要應(yīng)用于分離無機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷、核苷要應(yīng)用于分離無機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物質(zhì)。酸和氨基酸等小分子物質(zhì)。2.2.親水性離子交換劑：它是一類天然的或人工合親水性離子交換劑：它是一類天然的或人工合成的、與水結(jié)合力較大的物質(zhì)。常用

49、的有纖維成的、與水結(jié)合力較大的物質(zhì)。常用的有纖維素、交聯(lián)纖維素、交聯(lián)葡聚糖和交聯(lián)瓊脂糖等。素、交聯(lián)纖維素、交聯(lián)葡聚糖和交聯(lián)瓊脂糖等。陽離子交換劑電荷集團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶正電。陽離子交換劑電荷集團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶正電。根據(jù)電荷集團(tuán)的強(qiáng)弱，又可將其分為強(qiáng)酸型根據(jù)電荷集團(tuán)的強(qiáng)弱，又可將其分為強(qiáng)酸型（即帶磺酸基）、中強(qiáng)酸型（即帶磷酸集團(tuán)和（即帶磺酸基）、中強(qiáng)酸型（即帶磷酸集團(tuán)和亞磷酸集團(tuán)）、弱酸型（即帶羧基和酚基）。亞磷酸集團(tuán)）、弱酸型（即帶羧基和酚基）。 陰離子交換劑是在樹脂中分別引入季胺、陰離子交換劑是在樹脂中分別引入季胺、叔胺、仲胺和伯胺集團(tuán)后構(gòu)成的。叔胺、仲胺和伯胺集團(tuán)后構(gòu)成的。 （1）當(dāng)引入

50、季胺和叔胺集團(tuán)時(shí)，分別為強(qiáng)）當(dāng)引入季胺和叔胺集團(tuán)時(shí)，分別為強(qiáng)陰性和中強(qiáng)陰性離子交換劑，陰性和中強(qiáng)陰性離子交換劑， （2）當(dāng)引入仲胺和伯胺集團(tuán)時(shí)，為弱陰性）當(dāng)引入仲胺和伯胺集團(tuán)時(shí)，為弱陰性離子交換劑。離子交換劑。1.1.顏色與形狀顏色與形狀2.2.交聯(lián)度交聯(lián)度3.3.吸水量或膨脹度吸水量或膨脹度4.4.交換容量交換容量5.5.穩(wěn)定性穩(wěn)定性6.6.比重比重7.7.流速流速 離子交換劑在水溶液中吸水量或膨脹度與離子交換劑在水溶液中吸水量或膨脹度與基質(zhì)和電荷集團(tuán)的性質(zhì)，以及溶液的基質(zhì)和電荷集團(tuán)的性質(zhì)，以及溶液的pHpH和離和離子強(qiáng)度密切相關(guān)。子強(qiáng)度密切相關(guān)。交換容量是指離子交換劑與溶液中離子或離交換容

51、量是指離子交換劑與溶液中離子或離子化合物進(jìn)行交換的能力。一般用總交換容子化合物進(jìn)行交換的能力。一般用總交換容量和有效交換容量表示。量和有效交換容量表示。影響交換容量因素：篩孔、離子強(qiáng)度、影響交換容量因素：篩孔、離子強(qiáng)度、pHpH值。值。一、離子交換劑的選擇一、離子交換劑的選擇二、緩沖液的選擇二、緩沖液的選擇三、加樣量的確定三、加樣量的確定1.1.陰、陽離子交換劑的選擇陰、陽離子交換劑的選擇2.2.強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇3.3.不同離子交換劑的選擇不同離子交換劑的選擇4.4.不同基質(zhì)離子交換劑的選擇不同基質(zhì)離子交換劑的選擇如果被分離物質(zhì)帶正電，應(yīng)選擇陽離子交換劑；如果被分離

52、物質(zhì)帶正電，應(yīng)選擇陽離子交換劑；如果被分離物帶負(fù)電，則應(yīng)選擇陰離子交換劑；如果被分離物帶負(fù)電，則應(yīng)選擇陰離子交換劑；如果被分離物質(zhì)為兩性離子，一般根據(jù)其在穩(wěn)定如果被分離物質(zhì)為兩性離子，一般根據(jù)其在穩(wěn)定 pHpH范圍內(nèi)所帶電荷來選擇交換劑。范圍內(nèi)所帶電荷來選擇交換劑。 一般強(qiáng)離子交換劑一般強(qiáng)離子交換劑使用使用pHpH范圍較廣，而范圍較廣，而弱離子交換劑適用范圍較窄，分離生物樣品弱離子交換劑適用范圍較窄，分離生物樣品常采用弱離子交換劑。常采用弱離子交換劑。 為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較小的反離子。小的反離子。 強(qiáng)陽性和強(qiáng)陰性離子交換劑應(yīng)分別選擇強(qiáng)陽性和強(qiáng)

53、陰性離子交換劑應(yīng)分別選擇H H型型和和OHOH型。型。 弱酸性和堿性離子交換劑應(yīng)分別選擇弱酸性和堿性離子交換劑應(yīng)分別選擇NaNa型型和和ClCl型。型。F選用的緩沖液的選用的緩沖液的pHpH值一般比有效成分的值高值一般比有效成分的值高一個(gè)單位或低一個(gè)單位，離子強(qiáng)度為一個(gè)單位或低一個(gè)單位，離子強(qiáng)度為pI0.1pI0.1時(shí)，時(shí)，就能很快把有效成分與雜質(zhì)分開。就能很快把有效成分與雜質(zhì)分開。F選用的洗脫液，其離子強(qiáng)度和選用的洗脫液，其離子強(qiáng)度和pHpH值應(yīng)使有效值應(yīng)使有效成分從離子交換劑上解離下來，一般離子強(qiáng)度成分從離子交換劑上解離下來，一般離子強(qiáng)度要比起始緩沖液高，要比起始緩沖液高，pHpH值隨著離

54、子交換劑性質(zhì)值隨著離子交換劑性質(zhì)變化而變化。變化而變化。一、離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型一、離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型二、分離物質(zhì)的交換二、分離物質(zhì)的交換三、物質(zhì)的洗脫與收集三、物質(zhì)的洗脫與收集四、標(biāo)準(zhǔn)操作四、標(biāo)準(zhǔn)操作 常規(guī)的處理步驟：常規(guī)的處理步驟：（1 1）加過量的水懸浮除去細(xì)顆粒）加過量的水懸浮除去細(xì)顆粒（2 2）然后改用酸堿浸泡，以便除去雜質(zhì)并）然后改用酸堿浸泡，以便除去雜質(zhì)并 使其帶上需要的反離子。使其帶上需要的反離子。（3 3）酸堿處理的次序決定了離子交換劑攜帶）酸堿處理的次序決定了離子交換劑攜帶反離子的類型。反離子的類型。F再生：使用過的離子交換劑，可采用一定的方再生：使用過的

55、離子交換劑，可采用一定的方法令其恢復(fù)原來的性狀。法令其恢復(fù)原來的性狀。F轉(zhuǎn)型：離子交換劑由一種反離子轉(zhuǎn)到另一種反轉(zhuǎn)型：離子交換劑由一種反離子轉(zhuǎn)到另一種反離子的過程。離子的過程。 陽離子交換劑轉(zhuǎn)型：陽離子交換劑轉(zhuǎn)型： A.A.欲使其轉(zhuǎn)成鈉型時(shí)，用欲使其轉(zhuǎn)成鈉型時(shí)，用NaOHNaOH處理；處理； B.B.欲使其轉(zhuǎn)成氫型，則要用欲使其轉(zhuǎn)成氫型，則要用HClHCl處理；處理； C.C.欲使其帶銨離子，則需要用欲使其帶銨離子，則需要用NHNH4 4OHOH或或NHNH4 4ClCl處理。處理。 使用離子交換劑的方法有兩種：使用離子交換劑的方法有兩種： A.A.一種是柱層析法，即將離子交換劑裝入一種是柱層

56、析法，即將離子交換劑裝入層析柱內(nèi)，讓溶液連續(xù)通過，該法交換效率層析柱內(nèi)，讓溶液連續(xù)通過，該法交換效率高，應(yīng)用范圍廣；高，應(yīng)用范圍廣； B.B.另一種是分批法，即將離子交換劑加入另一種是分批法，即將離子交換劑加入盛溶液的容器內(nèi)緩慢地不斷攪拌，該法設(shè)備盛溶液的容器內(nèi)緩慢地不斷攪拌，該法設(shè)備簡單，易操作。簡單，易操作。F在離子交換層析過程中，常用梯度溶液進(jìn)行在離子交換層析過程中，常用梯度溶液進(jìn)行洗脫，而溶液的梯度則是由鹽濃度或酸堿度的洗脫，而溶液的梯度則是由鹽濃度或酸堿度的變化形成的。變化形成的。F梯度溶液按組成來分，一般有兩種：梯度溶液按組成來分，一般有兩種： 一是增加離子強(qiáng)度的梯度溶液；一是增加

57、離子強(qiáng)度的梯度溶液； 二是改變二是改變pHpH值的梯度溶液。值的梯度溶液。 F對于增加離子強(qiáng)度的梯度溶液，不管用于何對于增加離子強(qiáng)度的梯度溶液，不管用于何種類型的離子交換劑，其離子強(qiáng)度絕大部分是種類型的離子交換劑，其離子強(qiáng)度絕大部分是增加的。增加的。F改變改變pHpH值的梯度溶液則不然，如果使用的是值的梯度溶液則不然，如果使用的是陽離子交換劑，陽離子交換劑， pHpH值應(yīng)從低到高遞增；如果值應(yīng)從低到高遞增；如果使用的是陰離子交換劑，使用的是陰離子交換劑， pHpH值應(yīng)從高到底遞值應(yīng)從高到底遞減。減。F當(dāng)被分離物質(zhì)之間的選擇系數(shù)相差較小時(shí)，當(dāng)被分離物質(zhì)之間的選擇系數(shù)相差較小時(shí)，洗脫液的離子強(qiáng)度或

58、酸堿度的變化速率小，這洗脫液的離子強(qiáng)度或酸堿度的變化速率小，這樣有利于分辨率的提高。樣有利于分辨率的提高。一、制備、純化生命物質(zhì)一、制備、純化生命物質(zhì)二、測定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)二、測定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)1.1.用強(qiáng)陽離子交換樹脂用強(qiáng)陽離子交換樹脂732732分離分離4 4中核苷酸中核苷酸2.2.用離子交換法從胰酶水解的腸粘膜中提用離子交換法從胰酶水解的腸粘膜中提取肝素鈉取肝素鈉3.3.用用DEAE-DEAE-纖維素纖維素2222層析法純化鄰苯二酚層析法純化鄰苯二酚- -2 2，3-3-雙加氧酶雙加氧酶4.4.用用SP sephros HPSP sephros HP分離生物堿分離生物堿F特點(diǎn)：設(shè)備簡單、

59、操作方便、重復(fù)性好特點(diǎn)：設(shè)備簡單、操作方便、重復(fù)性好和樣品回收率高。和樣品回收率高。F應(yīng)用：分離純化蛋白質(zhì)、核酸、多糖、應(yīng)用：分離純化蛋白質(zhì)、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等，還可用于測定激素、氨基酸和抗生素等，還可用于測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，樣品的濃縮和脫鹽等。蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，樣品的濃縮和脫鹽等。第一節(jié)第一節(jié) 凝膠的分類及性質(zhì)凝膠的分類及性質(zhì)第二節(jié)第二節(jié) 基本原理基本原理第三節(jié)第三節(jié) 操作操作第四節(jié)第四節(jié) 應(yīng)用應(yīng)用一、葡聚糖凝膠一、葡聚糖凝膠二、瓊脂糖凝膠二、瓊脂糖凝膠三、聚丙烯酰胺凝膠三、聚丙烯酰胺凝膠四、四、SephacrylSephacryl五、五、SuperdexSuperdex1

60、.1.理化性質(zhì)理化性質(zhì)2.2.穩(wěn)定性穩(wěn)定性 3.3.吸附性吸附性F外觀為白色珠狀顆粒，親水性好。型號不同，外觀為白色珠狀顆粒，親水性好。型號不同，交聯(lián)度不同，篩孔的大小和分級范圍也有明顯的交聯(lián)度不同，篩孔的大小和分級范圍也有明顯的差異，其性質(zhì)也不一樣。差異，其性質(zhì)也不一樣。F一般以一般以G G型葡聚糖凝膠作為固定相，以水溶液作型葡聚糖凝膠作為固定相，以水溶液作為流動相，對水溶性物質(zhì)進(jìn)行分離的方法稱葡聚為流動相，對水溶性物質(zhì)進(jìn)行分離的方法稱葡聚糖凝膠過濾層析。糖凝膠過濾層析。F以以LHLH型葡聚糖凝膠為固定劑，以有機(jī)溶劑為流型葡聚糖凝膠為固定劑，以有機(jī)溶劑為流動相，對脂溶性物質(zhì)進(jìn)行分離的層析方法