常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

1、分子生物學(xué)分子生物學(xué) MOLECULAR BIOLOGY常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology第一節(jié)第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization and Blotting Technique一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理DNA變性：變性： 雙鏈雙鏈DNA在各種理化因素作用下變?yōu)閱捂湹倪^(guò)在各種理化因素作用下變?yōu)閱捂湹倪^(guò)程。程。 本質(zhì)是堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂。

2、本質(zhì)是堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂。DNA復(fù)性：復(fù)性： 去除變性條件，變性去除變性條件，變性DNA重新形成雙鏈的過(guò)程。重新形成雙鏈的過(guò)程。常用變性條件：常用變性條件： 加熱加熱分子雜交：分子雜交： 不同來(lái)源的單鏈核苷酸鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)原則形成不同來(lái)源的單鏈核苷酸鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)原則形成雜種雙鏈的過(guò)程。雜種雙鏈的過(guò)程。分子雜交的目的：分子雜交的目的： 檢測(cè)檢測(cè)DNA和和RNA 探針：探針： 分子雜交中和待測(cè)核苷酸鏈堿基互補(bǔ)的被標(biāo)記的分子雜交中和待測(cè)核苷酸鏈堿基互補(bǔ)的被標(biāo)記的核苷酸鏈。核苷酸鏈。堿基對(duì)間氫鍵堿基對(duì)間氫鍵探針探針待測(cè)待測(cè)DNA或或RNA增色效應(yīng)：增色效應(yīng)： DNA變性伴隨變性伴隨260nm吸收值

3、增高吸收值增高減色效應(yīng)：減色效應(yīng)： DNA復(fù)性伴隨復(fù)性伴隨260nm吸收值降低吸收值降低原因：原因： 鹼基中共軛雙鍵的暴露鹼基中共軛雙鍵的暴露Tm值值:分子雜交的方法分子雜交的方法 : （固（固液雜交）液雜交） 1. 斑點(diǎn)雜交：斑點(diǎn)雜交： 提取提取DNA或或RNA，直接點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，和探針雜交，直接點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，和探針雜交 檢查有沒(méi)有你所要的檢查有沒(méi)有你所要的DNA或或RNA硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜待測(cè)待測(cè)DNA或或RNA 雜交液雜交液探針探針1234Slot blotDot blot反向斑點(diǎn)雜交反向斑點(diǎn)雜交 固相：多種探針序列固相：多種探針序列 液相：一種待測(cè)樣品液相：一種待測(cè)樣

4、品(標(biāo)記）標(biāo)記） DNA點(diǎn)陣：點(diǎn)陣： 將多種探針序列成排的點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，檢測(cè)將多種探針序列成排的點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，檢測(cè)DNA或或RNA和那一個(gè)探針雜交。和那一個(gè)探針雜交。 待檢樣品進(jìn)行標(biāo)記待檢樣品進(jìn)行標(biāo)記 一種樣品多種探針一種樣品多種探針多種探針序列多種探針序列標(biāo)記待測(cè)核酸標(biāo)記待測(cè)核酸基因芯片基因芯片： 將更多的探針排列在硅片上，借助計(jì)算機(jī)檢測(cè)將更多的探針排列在硅片上，借助計(jì)算機(jī)檢測(cè)未知的未知的DNA或或RNA和那一個(gè)探針雜交和那一個(gè)探針雜交2.原位雜交原位雜交 組織固定技術(shù)與分子雜交技術(shù)結(jié)合組織固定技術(shù)與分子雜交技術(shù)結(jié)合 組織切片或細(xì)胞涂片原位雜交：組織切片或細(xì)胞涂片原位雜交： 將將

5、DNA或或RNA在組織切片和細(xì)胞涂片中變性和固定，和在組織切片和細(xì)胞涂片中變性和固定，和探針雜交探針雜交 確定確定DNA或或RNA在組織和細(xì)胞中的定位。在組織和細(xì)胞中的定位。 菌落或噬菌斑原位雜交：菌落或噬菌斑原位雜交： 基因工程中篩選陽(yáng)性克隆。基因工程中篩選陽(yáng)性克隆。 3.3.轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)電泳技術(shù)與分子雜交技術(shù)結(jié)合電泳技術(shù)與分子雜交技術(shù)結(jié)合電泳結(jié)果從凝膠轉(zhuǎn)移到固相膜上，稱(chēng)之為電泳結(jié)果從凝膠轉(zhuǎn)移到固相膜上，稱(chēng)之為 blotting blotting 膜上樣品再與探針雜交膜上樣品再與探針雜交 樣品中哪一個(gè)是目標(biāo)或樣品中哪一個(gè)是目標(biāo)或轉(zhuǎn)移印跡實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移印跡實(shí)驗(yàn)放放射射自自顯顯影影照照片片

6、濾紙濾紙凝膠凝膠硝酸纖維膜硝酸纖維膜印跡技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用印跡技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用 Western Blotting常被用來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)常被用來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)1 2 3 41.正常細(xì)胞正常細(xì)胞2.正常細(xì)胞正常細(xì)胞/凋亡素凋亡素3.腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞4.腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞/凋亡素凋亡素細(xì)胞核內(nèi)的熱休克蛋白細(xì)胞核內(nèi)的熱休克蛋白70 1 2 3 4第二節(jié)第二節(jié)核酸序列分析核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysisn核酸序列分析的基本原理：核酸序列分析的基本原理： 化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法 (Maxam-Gillbert(Maxam-Gillbert法法) ) DNADNA鏈的末端合成終

7、止法鏈的末端合成終止法 (Sanger(Sanger法法) )Frederick Sanger蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)獲年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)獲年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)測(cè)序技術(shù)獲年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)測(cè)序技術(shù)獲年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)一、一、DNADNA鏈末端合成終止法鏈末端合成終止法運(yùn)用復(fù)制的原理運(yùn)用復(fù)制的原理 底物中加入雙脫氧核糖核苷酸底物中加入雙脫氧核糖核苷酸合成引物用同位素標(biāo)記合成引物用同位素標(biāo)記n鏈末端合成終止法測(cè)定鏈末端合成終止法測(cè)定DNA序列的原理序列的原理負(fù)極負(fù)極53合成鏈合成鏈模板鏈模板鏈ddG ddA ddT ddCC GG CT AG CT AA TC GC GG CT AT A53正極正極二、二、DN

8、A自動(dòng)測(cè)序自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNADNA序列分序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同顏色熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸用不同顏色熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸合成時(shí)分合成時(shí)分4 4管分別合成，電泳時(shí)管分別合成，電泳時(shí)4 4管產(chǎn)物混合一起管產(chǎn)物混合一起 電泳后，通過(guò)四種激光激發(fā)熒光分子使之發(fā)射出電泳后，通過(guò)四種激光激發(fā)熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNADNA堿基的排堿基的排列順序。列順序。 第三節(jié)第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)Polymerase Chai

9、n ReactionKary Banks Mullis19831983年年 2727歲發(fā)明歲發(fā)明PCRPCR技術(shù)技術(shù) 1993年獲諾貝爾獎(jiǎng)年獲諾貝爾獎(jiǎng)5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技術(shù)的工作原理技術(shù)的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 252530 30 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNADNA的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100100萬(wàn)倍以上萬(wàn)倍以上。 模板模板DNADNA 特異性引物特異性引物 耐熱耐熱DNADN

10、A聚合酶聚合酶 dNTPsdNTPs MgMg2+2+n PCRPCR體系基本組成成分體系基本組成成分n PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性9595C C延伸延伸7272C C退火退火Tm-5Tm-5C CPCRPCR是體外是體外DNADNA復(fù)制過(guò)程，最原始的目的是擴(kuò)增復(fù)制過(guò)程，最原始的目的是擴(kuò)增DNA.DNA.RNARNA可以經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為可以經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為DNA,DNA,再用再用PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增（二）目的基因的克?。ǘ┠康幕虻目寺DNAcDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆基因文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆基因真核基因在原核表達(dá)時(shí)用真核基因在原核表達(dá)時(shí)用RT-PCRRT-PCR擴(kuò)增擴(kuò)增mRNAm

11、RNA二、二、PCR技術(shù)技術(shù)的主要用途的主要用途（一）微量（一）微量DNA和和RNA的擴(kuò)增的擴(kuò)增利用利用PCRPCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。 （三）基因突變（三）基因突變TGC將將PCRPCR技術(shù)引入技術(shù)引入DNADNA序列測(cè)定，使測(cè)序工序列測(cè)定，使測(cè)序工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度；作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度；待測(cè)待測(cè)DNADNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。PCRPCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大

12、提高基與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性因突變檢測(cè)的敏感性 。（四）（四）DNA序列測(cè)定序列測(cè)定（五）基因突變分析（五）基因突變分析逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCRPCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)RT-PCR)是將是將RNARNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCRPCR反應(yīng)聯(lián)合反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCRRT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的以及對(duì)已知序列的RNARNA進(jìn)行定性及半定量分析進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。的

13、最有效方法。 （一）逆轉(zhuǎn)錄（一）逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR技技術(shù)術(shù)三、幾種重要的三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)衍生技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法方案：方案：AAnATTnT 55mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核糖核酸酶核酸酶H HTTnT3DNA poly IcDNA核酸酶核酸酶S1S1雙鏈雙鏈cDNAcDNA35 35 5加熱變性加熱變性加入特異性引物加入特異性引物DNADNA聚合酶聚合酶重復(fù)上述步驟重復(fù)上述步驟擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物PCR用于檢測(cè)在用于檢測(cè)在mRNA 水平上的基因表達(dá)差異水平上的基因表達(dá)差異要防止擴(kuò)增效率不同產(chǎn)生的誤差要防止擴(kuò)增效率不同產(chǎn)生的誤差要管家

14、基因作內(nèi)對(duì)照要管家基因作內(nèi)對(duì)照原位原位PCR(in situ PCR)PCR(in situ PCR)是在組織切片或細(xì)胞涂是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCRPCR反應(yīng)，然后用特異反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè)性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè)DNADNA或或RNARNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位原位PCRPCR方法彌補(bǔ)了方法彌補(bǔ)了PCRPCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。種最佳方法。（二）原位（二）原位PCRPC

15、R技術(shù)技術(shù)固定組織或細(xì)胞固定組織或細(xì)胞蛋白酶蛋白酶K消化處理消化處理PCR擴(kuò)增擴(kuò)增原位雜交原位雜交顯微鏡觀察結(jié)果顯微鏡觀察結(jié)果基本方法基本方法（三）實(shí)時(shí)（三）實(shí)時(shí)PCRPCR技術(shù)技術(shù)實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)PCR(real-time PCR)又稱(chēng)熒光定量又稱(chēng)熒光定量PCRPCR，是指在是指在PCRPCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCRPCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見(jiàn)可見(jiàn)”，最后通過(guò)外標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品中的最后通過(guò)外標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品中的DNA (or cDNA) DNA (or cDNA)

16、 的起的起始濃度進(jìn)行定量的方法。始濃度進(jìn)行定量的方法。5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ定量定量PCRPCR示意圖示意圖535353RQExtension Step531. Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR35

17、4. Detection533QTaqR5lR定量定量PCR示意圖示意圖反向反向PCRPCR逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR原位原位PCRPCR重組重組PCRPCR不對(duì)稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)PCRPCR多重多重PCRPCRPCRPCR衍生技術(shù)衍生技術(shù)錨定錨定PCRPCR巢式巢式PCRPCR免疫免疫PCRPCR連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCRPCR遞減遞減PCR PCR 第四節(jié)第四節(jié)基因文庫(kù)基因文庫(kù)Gene Library 基因組基因組DNADNA文庫(kù)文庫(kù) (genomic DNA library)(genomic DNA library) cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)(cDNA library)(cDNA l

18、ibrary) n基因文庫(kù)基因文庫(kù)( (gene library)是指一個(gè)包含了某一生物體全部是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNADNA序列序列的克隆群體。的克隆群體。一、基因組一、基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)基因組基因組DNADNA文庫(kù)是指生物的基因組文庫(kù)是指生物的基因組DNADNA的信的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNADNA片段片段形式貯存的克隆群體。形式貯存的克隆群體。 用于構(gòu)建基因組文庫(kù)的載體有用于構(gòu)建基因組文庫(kù)的載體有 噬菌體、噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。粘粒和酵母人工染色體等。cDNAcDNA文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一定條文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞

19、在一定條件下所表達(dá)的全部件下所表達(dá)的全部mRNAmRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNAcDNA序列的克隆群體，它以序列的克隆群體，它以cDNAcDNA片段的形式片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。 二、二、cDNA文庫(kù)文庫(kù)n基因組文庫(kù)和基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選文庫(kù)的構(gòu)建和篩選第五節(jié)第五節(jié)生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)Biological Chip Technique一、生物芯片的概念一、生物芯片的概念 指通過(guò)微電子、微加工技術(shù)在平方厘米指通過(guò)微電子、微加工技術(shù)在平方厘米大小的固相介質(zhì)表面構(gòu)建的微型分析系統(tǒng)，大小的固相介質(zhì)表面構(gòu)建的微型分析系

20、統(tǒng)， 以實(shí)現(xiàn)對(duì)組織細(xì)胞中以實(shí)現(xiàn)對(duì)組織細(xì)胞中DNADNA、蛋白質(zhì)及其、蛋白質(zhì)及其他生物組分的快速、高效、敏感地處理與分他生物組分的快速、高效、敏感地處理與分析。析。 生物芯片（生物芯片（biochipbiochip）信息芯片：信息芯片： 將與生命相關(guān)的信息分子高度集成，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因、蛋將與生命相關(guān)的信息分子高度集成，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因、蛋白等生物活性物質(zhì)進(jìn)行高通量的檢測(cè)與分析白等生物活性物質(zhì)進(jìn)行高通量的檢測(cè)與分析 基因芯片（基因芯片（ DNADNA芯片）芯片） 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片 組織芯片組織芯片 細(xì)胞芯片細(xì)胞芯片 功能芯片（微流體芯片功能芯片（微流體芯片） 在芯片上完成生命科學(xué)研究中樣品的分離、擴(kuò)

21、增、生化在芯片上完成生命科學(xué)研究中樣品的分離、擴(kuò)增、生化反應(yīng)等功能反應(yīng)等功能 生物樣品制備芯片生物樣品制備芯片 核酸擴(kuò)增芯片核酸擴(kuò)增芯片 毛細(xì)管電泳芯片毛細(xì)管電泳芯片 將許多特定的將許多特定的DNADNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上的支持物上與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出定性一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱(chēng)作該

22、技術(shù)亦被稱(chēng)作DNADNA微陣列微陣列(DNA microarray(DNA microarray)。 一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)n基因芯片工作流程示意圖基因芯片工作流程示意圖生物戰(zhàn)劑檢測(cè)生物戰(zhàn)劑檢測(cè) 臨床疾病的臨床疾病的 基因診斷基因診斷法醫(yī)學(xué)鑒定法醫(yī)學(xué)鑒定藥物研究開(kāi)發(fā)藥物研究開(kāi)發(fā)動(dòng)植物檢疫動(dòng)植物檢疫 基因組研究基因組研究后基因組計(jì)劃后基因組計(jì)劃生物信息學(xué)生物信息學(xué)基因芯片基因芯片基因芯片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域基因芯片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒏叨让芗帕械牡鞍追肿幼鳛樘结橖c(diǎn)陣固定在將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)

23、，可捕獲樣品中的靶蛋當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(protein chip)n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片作用原理作用原理第六節(jié)第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)生物大分子相互作用研究技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 酵母雙雜交酵母雙雜交 各

24、種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）n常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是基于親和色譜原理的、標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是基于親和色譜原理的、分析分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合子是否存在直接物理結(jié)合分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。 標(biāo)簽融

25、合標(biāo)簽融合蛋白沉淀蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程示意圖示意圖(二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄激酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí)活因子結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí) 真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子DNADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域BDAD組件式：結(jié)構(gòu)可互相分開(kāi)組件式：結(jié)構(gòu)可互相分開(kāi) 功能互相獨(dú)立功能互相獨(dú)立 空間較近時(shí)表現(xiàn)活性空間較近時(shí)表現(xiàn)活性 中間序列對(duì)活性無(wú)影響中間序列對(duì)活性無(wú)影響報(bào)告基因報(bào)告基因 在在GAL4GAL4結(jié)合的順式作用元件下游需連接報(bào)告基因結(jié)合的順式作用元件下游需連接報(bào)告基因。 目前應(yīng)用最

26、多的報(bào)告基因是目前應(yīng)用最多的報(bào)告基因是LacZLacZ基因，表達(dá)后能基因，表達(dá)后能在在X-GalX-Gal培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落。培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落。 其次是其次是HisHis基因，表達(dá)后能使酵母菌在缺少組氨基因，表達(dá)后能使酵母菌在缺少組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。 現(xiàn)在多提倡兩種報(bào)告基因同時(shí)應(yīng)用，顏色篩選和現(xiàn)在多提倡兩種報(bào)告基因同時(shí)應(yīng)用，顏色篩選和營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選同時(shí)進(jìn)行，以降低假陽(yáng)性的出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選同時(shí)進(jìn)行，以降低假陽(yáng)性的出現(xiàn) 表達(dá)表達(dá)電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定(EMSA)(EMSA)或稱(chēng)凝膠遷移變動(dòng)實(shí)或稱(chēng)凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)(gel shift assay)(gel sh

27、ift assay)用于研究用于研究DNADNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNADNA序列間的相互作序列間的相互作用用可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法的經(jīng)典方法也被用于研究也被用于研究RNARNA結(jié)合蛋白和特定結(jié)合蛋白和特定RNARNA序列間的相序列間的相互作用?；プ饔谩６?、二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定（一）電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定放放射射自自顯顯影影未結(jié)合探針未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針標(biāo)記探針1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未標(biāo)

28、記探針未標(biāo)記探針10Xn凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖染 色 質(zhì) 免 疫 沉 淀 技 術(shù)染 色 質(zhì) 免 疫 沉 淀 技 術(shù)( c h r o m a t i n ( c h r o m a t i n immunoprecipitation assay, ChIP)immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究體是目前可以研究體內(nèi)內(nèi)DNADNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法（二）染色質(zhì)免疫沉淀法n染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖遺傳修飾動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用遺傳修飾動(dòng)

29、物模型的建立及應(yīng)用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 第七節(jié)第七節(jié)n轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。宮，使之發(fā)育成個(gè)體。 轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入的目的基因被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenic animal)(transgenic animal)目的基因的受體動(dòng)物目的基因的受體動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)n核轉(zhuǎn)移技術(shù)核

30、轉(zhuǎn)移技術(shù) 即動(dòng)物整體克隆技術(shù)，將動(dòng)物的一即動(dòng)物整體克隆技術(shù)，將動(dòng)物的一個(gè)體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核個(gè)體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核的的激活的卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體，的的激活的卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體，即克隆即克隆(clone)(clone)。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)n基因剔除技術(shù)基因剔除技術(shù)( (gene knock out) 也稱(chēng)基因靶向也稱(chēng)基因靶向(gene targeting)(gene targeting)滅活，滅活，有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)三、基因剔除技術(shù) 基因剔除操作過(guò)程與機(jī)制基因剔除操作過(guò)程與機(jī)制1. 1.

31、 構(gòu)建基因打靶載體構(gòu)建基因打靶載體 2. 2. 將重組載體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞將重組載體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞 將重組載體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞中靶的將重組載體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞中靶的ESES細(xì)胞移入胚泡，胚泡植入子宮，篩選嵌合體小細(xì)胞移入胚泡，胚泡植入子宮，篩選嵌合體小鼠鼠 n建立動(dòng)物模型建立動(dòng)物模型 單基因決定疾病模型單基因決定疾病模型 基因剔除基因剔除獲得性突變獲得性突變(gain-of-function mutation)(gain-of-function mutation) 多基因決定疾病模型多基因決定疾病模型四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)發(fā)展中的作用發(fā)展中的作用第八

32、節(jié)第八節(jié)疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定Cloning and Identification of Disease Relative Genes克隆疾病相關(guān)基因的策略克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克?。ㄒ唬┕δ苄钥寺? (functional cloning) )（二）定位克隆（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候選基因克隆策略（三）非定位候選基因克隆策略(position- independent candidate gene approaches)（四）定位候選基因克隆策略（四）定位候選基因克隆策略(positional candidate

33、 gene approaches )n定義定義 通過(guò)對(duì)一種致病基因功能的了解來(lái)克隆該致通過(guò)對(duì)一種致病基因功能的了解來(lái)克隆該致病基因。病基因。（一）功能克隆（一）功能克隆n應(yīng)用應(yīng)用 生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到純化生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到純化的遺傳性疾病的遺傳性疾病。利用蛋白質(zhì)的表達(dá)及功能信利用蛋白質(zhì)的表達(dá)及功能信息息抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)提純蛋白質(zhì)提純蛋白質(zhì)制備抗體制備抗體建立建立 cDNA文庫(kù)文庫(kù)陽(yáng)性克隆陽(yáng)性克隆提取重組體提取重組體篩選篩選測(cè)序測(cè)序氨基酸序列信息：氨基酸序列信息：氨基酸序列氨基酸序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針設(shè)計(jì)寡核苷酸探針（簡(jiǎn)并密碼）（簡(jiǎn)并密碼）cDNA文庫(kù)文庫(kù)

34、陽(yáng)性克隆陽(yáng)性克隆序列分析序列分析篩選篩選提取重組體提取重組體利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。用不同人的用不同人的DNADNA片段轉(zhuǎn)化與人類(lèi)遺傳疾病具有類(lèi)似表型的片段轉(zhuǎn)化與人類(lèi)遺傳疾病具有類(lèi)似表型的突變酵母突變酵母可以恢復(fù)可以恢復(fù)(rescue)(rescue)正常表型的片段正常表型的片段中所含有的基因中所含有的基因即可即可能為致病基因能為致病基因這 種 實(shí) 驗(yàn) 稱(chēng) 為這 種 實(shí) 驗(yàn) 稱(chēng) 為 功 能 互 補(bǔ) 試 驗(yàn)功 能 互 補(bǔ) 試 驗(yàn) ( f u n c t i o n a l ( f u n c t i o n a l complementatio

35、n assay)complementation assay)。表型與人類(lèi)疾病相似的酵母突變株表型與人類(lèi)疾病相似的酵母突變株表型恢復(fù)正常表型恢復(fù)正常人類(lèi)正常基因人類(lèi)正?；颍ǘ┒ㄎ豢寺。ǘ┒ㄎ豢寺定義定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。最后克隆該基因。n系統(tǒng)的定位克隆工作系統(tǒng)的定位克隆工作 遺傳學(xué)分析遺傳學(xué)分析( (確定致病基因染色體定位確定致病基因染色體定位) )交換分析、連鎖不平衡分析交換分析、連鎖不平衡分析 分子生物學(xué)分析分子生物學(xué)分析 將病人的將病人的DNADNA和正常人的和正常人的DNA DNA 進(jìn)行雜交，進(jìn)

36、行雜交，去除相同部分，剩余部分既是致病基因去除相同部分，剩余部分既是致病基因利用基因在染色體位置的利用基因在染色體位置的信息信息杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良致病基因的定位克?。憾攀霞I(yíng)養(yǎng)不良致病基因的定位克?。?遺傳學(xué)家族連鎖分析將致病基因定位于遺傳學(xué)家族連鎖分析將致病基因定位于Xp21 病人染色體和正常人病人染色體和正常人X染色體雜交，染色體雜交， 去除能雜交的片段去除能雜交的片段 正常染色體上不能雜交的片段既是致病基因正常染色體上不能雜交的片段既是致病基因（三）非定位候選基因克隆策略（三）非定位候選基因克隆策略 由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，可由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，可以不依靠

37、染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對(duì)各種以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對(duì)各種基因產(chǎn)物功能的了解，預(yù)測(cè)出候選致病基因?；虍a(chǎn)物功能的了解，預(yù)測(cè)出候選致病基因。根據(jù)致病基因的可能功能，檢測(cè)因特網(wǎng)基因庫(kù)中根據(jù)致病基因的可能功能，檢測(cè)因特網(wǎng)基因庫(kù)中的基因功能區(qū)將含有接近功能域的基因用于致病的改的基因功能區(qū)將含有接近功能域的基因用于致病的改變檢測(cè)。變檢測(cè)。（四）定位候選基因克隆策略（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因。據(jù)，鑒定出候選致

38、病基因?；蛟\斷和基因治療基因診斷和基因治療第九節(jié)第九節(jié)Gene Diagnosis and Gene Therapy基因變異致病類(lèi)型基因變異致病類(lèi)型內(nèi)源基因的變異內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變基因結(jié)構(gòu)突變基因表達(dá)異?；虮磉_(dá)異常外源基因的入侵外源基因的入侵特點(diǎn)特點(diǎn)針對(duì)性強(qiáng)針對(duì)性強(qiáng) 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)靈敏度高靈敏度高 適應(yīng)性強(qiáng)適應(yīng)性強(qiáng)基因診斷的概念和特點(diǎn)基因診斷的概念和特點(diǎn)定義定義利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測(cè)術(shù)和方法，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)及其及其表達(dá)水平表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法?；蛟\

39、斷常用技術(shù)方法基因診斷常用技術(shù)方法（二）聚合酶鏈反應(yīng)（二）聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)（三）基因測(cè)序（三）基因測(cè)序（四）基因芯片（四）基因芯片（五）連鎖分析（五）連鎖分析（一）核酸分子雜交技術(shù)（一）核酸分子雜交技術(shù)疾病相關(guān)遺傳標(biāo)志的連鎖分析疾病相關(guān)遺傳標(biāo)志的連鎖分析連鎖：連鎖：同一條染色體上位置相鄰的基因被一起遺傳同一條染色體上位置相鄰的基因被一起遺傳而沒(méi)有發(fā)生重組。而沒(méi)有發(fā)生重組。連鎖分析連鎖分析：利用與致病基因相連的某些基因作為遺利用與致病基因相連的某些基因作為遺傳標(biāo)志，通過(guò)鑒定遺傳標(biāo)志的存在判斷個(gè)體是否傳標(biāo)志，通過(guò)鑒定遺傳標(biāo)志的存在判斷個(gè)體是否帶有致病基因。帶有致病基因。連鎖分析連鎖分析無(wú)需

40、了解致病基因的結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制，適無(wú)需了解致病基因的結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制，適用于由未知基因缺陷引起的遺傳性疾病用于由未知基因缺陷引起的遺傳性疾病間接診斷：沒(méi)有直接檢測(cè)致病基因間接診斷：沒(méi)有直接檢測(cè)致病基因無(wú)重組無(wú)重組發(fā)生重組發(fā)生重組用于連鎖分析的遺傳標(biāo)志用于連鎖分析的遺傳標(biāo)志 1.不同個(gè)體之間存在高度的多態(tài)性不同個(gè)體之間存在高度的多態(tài)性 多態(tài)性：在一個(gè)特定的基因座位上存在兩個(gè)以多態(tài)性：在一個(gè)特定的基因座位上存在兩個(gè)以上的等位基因，其中的任何一個(gè)等位基因在群體上的等位基因，其中的任何一個(gè)等位基因在群體中的頻率大于中的頻率大于1%。2.需要獲得足夠的家系成員樣本。需要獲得足夠的家系成員樣本。3.致病基因和

41、標(biāo)志基因連鎖，兩個(gè)基因的距離越近致病基因和標(biāo)志基因連鎖，兩個(gè)基因的距離越近越好。越好。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定DNA序列并在此序列內(nèi)序列并在此序列內(nèi)切斷切斷DNA 單個(gè)鹼基突變可丟失或獲得限制性內(nèi)切酶的切單個(gè)鹼基突變可丟失或獲得限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)點(diǎn) 切割片段長(zhǎng)度不同，電泳分開(kāi)切割片段長(zhǎng)度不同，電泳分開(kāi) 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性與致病的基因連鎖分析限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性與致病的基因連鎖分析GAATTCCTTAAGGAATTTCTTAAARLFPRLFP分析法分析法Mst酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5 3 正?；蛘；? 3 突變基因突

42、變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突變攜帶者突變攜帶者患者患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析PCR/PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single strand conformation (single strand conformation polymorphism, SSCP)polymorphism, SSCP)PCRPCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在?？煞治龃_定致病基因的存在。 正常人正常人純合突變純合突變雜合突變雜合突變Leber 病患者病患者 PCR/SSCP分析分析+短串聯(lián)重復(fù)序列（短串聯(lián)重復(fù)序列（STR） 人類(lèi)基因組人類(lèi)基因組25% 為重復(fù)序列為重復(fù)序列 衛(wèi)星衛(wèi)星DNA