實(shí)驗(yàn)一有絲分裂

1、實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 植物根尖有絲分裂染色體植物根尖有絲分裂染色體標(biāo)本制備及觀察標(biāo)本制備及觀察實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 目目 的的 學(xué)習(xí)植物根尖壓片方法的基本技術(shù)。學(xué)習(xí)植物根尖壓片方法的基本技術(shù)。熟悉植物細(xì)胞有絲分裂各個(gè)時(shí)期的形態(tài)特熟悉植物細(xì)胞有絲分裂各個(gè)時(shí)期的形態(tài)特征及染色體的變化，并學(xué)會(huì)染色體簡(jiǎn)易永征及染色體的變化，并學(xué)會(huì)染色體簡(jiǎn)易永久片的制片技術(shù)。久片的制片技術(shù)。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 有絲分裂是體細(xì)胞分裂的主要方式，一般發(fā)生在植物根有絲分裂是體細(xì)胞分裂的主要方式，一般發(fā)生在植物根尖或莖尖的分生組織中。在有絲分裂時(shí)，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)有尖或莖尖的分生組織中。在有絲分裂時(shí)，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)有很大的變化，但以細(xì)胞核內(nèi)染色體

2、的變化最為明顯，而且是很大的變化，但以細(xì)胞核內(nèi)染色體的變化最為明顯，而且是有規(guī)律地進(jìn)行。各種生物染色體在數(shù)目上和形態(tài)上是相對(duì)恒有規(guī)律地進(jìn)行。各種生物染色體在數(shù)目上和形態(tài)上是相對(duì)恒定的，并隨科屬種的不同而具有一定的特征。洋蔥體細(xì)胞中定的，并隨科屬種的不同而具有一定的特征。洋蔥體細(xì)胞中有有8 8對(duì)共對(duì)共1616條染色體，在有絲分裂過(guò)程中，每個(gè)染色體能復(fù)制條染色體，在有絲分裂過(guò)程中，每個(gè)染色體能復(fù)制一份，然后分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，所以兩個(gè)子細(xì)胞與母細(xì)胞一份，然后分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，所以兩個(gè)子細(xì)胞與母細(xì)胞所含的染色體在數(shù)目、形態(tài)和性質(zhì)上都是相同的。在細(xì)胞遺所含的染色體在數(shù)目、形態(tài)和性質(zhì)上都是相同的。在細(xì)

3、胞遺傳學(xué)研究中，人們常常需要了解某一物種的染色體數(shù)目，而傳學(xué)研究中，人們常常需要了解某一物種的染色體數(shù)目，而最有效的方法就是觀察細(xì)胞有絲分裂的中期，這樣能得到較最有效的方法就是觀察細(xì)胞有絲分裂的中期，這樣能得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果。為準(zhǔn)確的結(jié)果。 （一）實(shí)驗(yàn)材料（一）實(shí)驗(yàn)材料蠶豆（蠶豆（Vicia fabaVicia faba）根尖）根尖洋蔥（洋蔥（Aillum cepaAillum cepa）根尖；或小麥、玉米等的根尖。）根尖；或小麥、玉米等的根尖。 （二）實(shí)驗(yàn)器具（二）實(shí)驗(yàn)器具 顯微鏡、培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、溫度計(jì)、鑷子、解剖針、刀片、載玻顯微鏡、培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、溫度計(jì)、鑷子、解剖針、刀片、載

4、玻片、蓋玻片、燒杯、量筒、滴瓶、切片架、切片盒、凹面玻片、青霉素瓶、片、蓋玻片、燒杯、量筒、滴瓶、切片架、切片盒、凹面玻片、青霉素瓶、大培養(yǎng)皿、紗布、吸水紙、鉛筆、吸管。大培養(yǎng)皿、紗布、吸水紙、鉛筆、吸管。 （三）藥品試劑（三）藥品試劑 卡諾氏固定液（甲醇或卡諾氏固定液（甲醇或95%95%乙醇乙醇3 3份，冰醋酸份，冰醋酸1 1份）、改良苯酚品紅染份）、改良苯酚品紅染色液（見附錄：實(shí)驗(yàn)試劑的配制）、色液（見附錄：實(shí)驗(yàn)試劑的配制）、0.002M8-0.002M8-羥基喹啉水溶液、羥基喹啉水溶液、0.050.050.2%0.2%秋水仙素溶液、對(duì)二氯苯飽和水溶液、秋水仙素溶液、對(duì)二氯苯飽和水溶液、1

5、N HCl1N HCl、95%95%乙醇、正丁醇、加乙醇、正丁醇、加拿大樹膠。拿大樹膠。 實(shí)驗(yàn)材料、器具與試劑實(shí)驗(yàn)材料、器具與試劑實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法（一）材料準(zhǔn)備（一）材料準(zhǔn)備 選取蠶豆（或小麥、玉米等）種子放在燒杯中，放清選取蠶豆（或小麥、玉米等）種子放在燒杯中，放清水浸泡過(guò)夜，使種子吸水脹大后倒出，再用清水洗幾次，用多層紗布包水浸泡過(guò)夜，使種子吸水脹大后倒出，再用清水洗幾次，用多層紗布包好種子，放進(jìn)好種子，放進(jìn)20202525培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)根尖長(zhǎng)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)根尖長(zhǎng)1 13cm 3cm 時(shí)，即可以進(jìn)時(shí)，即可以進(jìn)行預(yù)處理。行預(yù)處理。（二）預(yù)處理（二）預(yù)處理 為利于有絲分裂中染色體的觀察和計(jì)

6、數(shù)，固定之前進(jìn)行為利于有絲分裂中染色體的觀察和計(jì)數(shù)，固定之前進(jìn)行預(yù)處理，這樣可改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，抑制或破壞紡錘絲的形成，促使染預(yù)處理，這樣可改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，抑制或破壞紡錘絲的形成，促使染色體縮短和分散等。一般在分裂高峰前處理色體縮短和分散等。一般在分裂高峰前處理1.51.5小時(shí)以上，方法如下：小時(shí)以上，方法如下：1 1秋水仙素水溶液秋水仙素水溶液 常用濃度為常用濃度為0.050.050.2%0.2%，室溫下處理，室溫下處理2 24 4小時(shí)。對(duì)抑制紡錘小時(shí)。對(duì)抑制紡錘體活動(dòng)的效果明顯，易于獲得較多的中期分裂相，并且染色體收縮較直，有利體活動(dòng)的效果明顯，易于獲得較多的中期分裂相，并且染色體收縮較

7、直，有利于對(duì)染色體結(jié)構(gòu)的研究。于對(duì)染色體結(jié)構(gòu)的研究。2 2對(duì)二氯苯飽和水溶液對(duì)二氯苯飽和水溶液 室溫下處理室溫下處理3 35 5小時(shí)，對(duì)阻止紡錘體活動(dòng)和縮短染色體小時(shí)，對(duì)阻止紡錘體活動(dòng)和縮短染色體效果也較好，對(duì)染色體小而多的植物中，計(jì)數(shù)染色體制片效果最好。效果也較好，對(duì)染色體小而多的植物中，計(jì)數(shù)染色體制片效果最好。3 38-8-羥基喹啉水溶液羥基喹啉水溶液 使用濃度為使用濃度為0.0020.004M0.0020.004M，一般認(rèn)為它將引起細(xì)胞粘滯度，一般認(rèn)為它將引起細(xì)胞粘滯度的改變，進(jìn)而導(dǎo)致紡錘體活動(dòng)受阻。通常處理的改變，進(jìn)而導(dǎo)致紡錘體活動(dòng)受阻。通常處理2 24 4小時(shí)，可使中期染色體在赤小時(shí)

8、，可使中期染色體在赤道面上保持其相應(yīng)的排列位置，另一優(yōu)點(diǎn)是處理后的縊痕區(qū)較為清晰。道面上保持其相應(yīng)的排列位置，另一優(yōu)點(diǎn)是處理后的縊痕區(qū)較為清晰。4 4低溫處理低溫處理 將材料如小麥，浸入蒸餾水內(nèi)，放置到將材料如小麥，浸入蒸餾水內(nèi)，放置到1 144冰箱中（玉米及水稻冰箱中（玉米及水稻6 688）處理）處理20202424小時(shí)，也起到良好的效果。時(shí)間一般為上午小時(shí)，也起到良好的效果。時(shí)間一般為上午7 79 9時(shí)，固定時(shí)，固定保存方法同上。保存方法同上。植物名稱植物名稱 染色體染色體數(shù)數(shù)(2n(2n） 處處 理理 因因 素素 處理時(shí)間處理時(shí)間 溫溫 度度 效效 果果* * 小麥小麥 420.2%秋水

9、仙素水溶液秋水仙素水溶液9:00-11:0025+ 小麥小麥42 對(duì)二氯苯飽和水溶液對(duì)二氯苯飽和水溶液10:00-14:00室溫室溫+ 小麥小麥4214冰箱冰箱20-24小時(shí)小時(shí)14+ 小黑麥小黑麥56 對(duì)二氯苯飽和水溶液對(duì)二氯苯飽和水溶液10:00-14:00室溫室溫+ 豌豆豌豆14 對(duì)二氯苯飽和水溶液對(duì)二氯苯飽和水溶液10:00-11:30室溫室溫+ 煙草煙草48 對(duì)二氯苯飽和水溶液對(duì)二氯苯飽和水溶液8:30-11:30室溫室溫+ 蠶豆蠶豆120.050.1%秋水仙素水溶液秋水仙素水溶液20:00-23:00室溫室溫+ 蠶豆蠶豆120.050.1%秋水仙素水溶液秋水仙素水溶液14:30-1

10、7:308+ 洋蔥洋蔥16 0.050.1%秋水仙素水溶液秋水仙素水溶液7:30-11:3015+ 茄子茄子240.002M8-羥基喹啉羥基喹啉9:00-13:0015+ 大麥大麥140.050.1%秋水仙素水溶液秋水仙素水溶液8:00-11:0025不同材料采用不同預(yù)處理方法獲得的效果不同材料采用不同預(yù)處理方法獲得的效果 *+ 優(yōu)優(yōu) + 良。良。 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法（三）固定（三）固定 通常采用的是卡諾氏固定液。目的是用化學(xué)的方法把細(xì)胞迅速殺死，使通常采用的是卡諾氏固定液。目的是用化學(xué)的方法把細(xì)胞迅速殺死，使蛋白質(zhì)變性，并盡量保持原來(lái)的分裂狀態(tài)，同時(shí)更易于著色。固定時(shí)，將根尖投入固蛋白質(zhì)變性，

11、并盡量保持原來(lái)的分裂狀態(tài)，同時(shí)更易于著色。固定時(shí)，將根尖投入固定液中室溫處理定液中室溫處理3 32424小時(shí)。材料若不及時(shí)用，可經(jīng)過(guò)小時(shí)。材料若不及時(shí)用，可經(jīng)過(guò)90%90%酒精和酒精和70%70%酒精浸洗一次，酒精浸洗一次，再換入新的再換入新的70%70%酒精中，置于冰箱內(nèi)酒精中，置于冰箱內(nèi)0 044保存?zhèn)溆帽４鎮(zhèn)溆?。（四）解離（四）解離 目的是使分生組織細(xì)胞之間的果膠質(zhì)層解掉，并使細(xì)胞壁軟化，便于壓目的是使分生組織細(xì)胞之間的果膠質(zhì)層解掉，并使細(xì)胞壁軟化，便于壓片。解離的時(shí)間視根尖的粗細(xì)老嫩不同而有差異。方法是：將固定后（或保存后）的片。解離的時(shí)間視根尖的粗細(xì)老嫩不同而有差異。方法是：將固定后

12、（或保存后）的根尖分裝到青霉素小瓶子內(nèi)，用清水洗幾次，吸干水，加入根尖分裝到青霉素小瓶子內(nèi)，用清水洗幾次，吸干水，加入1N HCl1N HCl溶液，在溶液，在6060下水下水解解8 820 min20 min（洋蔥用（洋蔥用8min8min，蠶豆側(cè)根用，蠶豆側(cè)根用10min10min，玉米用，玉米用20min20min），解離成功的根尖，），解離成功的根尖，分生組織發(fā)白，伸長(zhǎng)區(qū)已呈半透明，似爛狀。解離后的根尖用水輕洗分生組織發(fā)白，伸長(zhǎng)區(qū)已呈半透明，似爛狀。解離后的根尖用水輕洗2 23 3次，以利于次，以利于著色。著色。（五）染色、壓片（五）染色、壓片 將解離后的根尖放在凹面玻片內(nèi)（根尖較長(zhǎng)的切

13、除伸長(zhǎng)區(qū)部將解離后的根尖放在凹面玻片內(nèi)（根尖較長(zhǎng)的切除伸長(zhǎng)區(qū)部位），滴加改良苯酚品紅染色液染色位），滴加改良苯酚品紅染色液染色1010分鐘左右。制片時(shí)，取一根尖放在潔凈的載玻分鐘左右。制片時(shí)，取一根尖放在潔凈的載玻片上，用刀片切取片上，用刀片切取1mm1mm左右的生長(zhǎng)區(qū)，其余部分棄掉，加半滴染色液，加蓋玻片。用左右的生長(zhǎng)區(qū)，其余部分棄掉，加半滴染色液，加蓋玻片。用鑷子在材料的地方輕壓幾下，使生長(zhǎng)區(qū)的細(xì)胞分散開來(lái)，再在蓋玻片上覆蓋一層吸水鑷子在材料的地方輕壓幾下，使生長(zhǎng)區(qū)的細(xì)胞分散開來(lái)，再在蓋玻片上覆蓋一層吸水紙，用解剖針或鉛筆上的橡皮頭敲擊根尖部位，重復(fù)幾次，力一次比一次大，以蓋玻紙，用解剖針

14、或鉛筆上的橡皮頭敲擊根尖部位，重復(fù)幾次，力一次比一次大，以蓋玻片不破裂為準(zhǔn)。片不破裂為準(zhǔn)。（六）觀察（六）觀察 將制好的標(biāo)本片，置于顯微鏡下先作低倍觀察，選取不將制好的標(biāo)本片，置于顯微鏡下先作低倍觀察，選取不同分裂時(shí)期的典型細(xì)胞，換高倍鏡觀察，注意核及染色體的動(dòng)態(tài)變化。同分裂時(shí)期的典型細(xì)胞，換高倍鏡觀察，注意核及染色體的動(dòng)態(tài)變化。（七）永久裝片（七）永久裝片 由臨時(shí)壓片材料做成永久玻片標(biāo)本，一般以正丁醇由臨時(shí)壓片材料做成永久玻片標(biāo)本，一般以正丁醇法最為簡(jiǎn)單可靠。步驟如下，取四個(gè)大培養(yǎng)皿，分別裝入下列溶液：法最為簡(jiǎn)單可靠。步驟如下，取四個(gè)大培養(yǎng)皿，分別裝入下列溶液：實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法1 3/4 95%酒精+1/4冰醋酸 510分鐘 2. 2/3 95%酒精+1/3正丁醇 3分鐘 3. 1/3 95%酒精+2/3正丁醇 3分鐘 4. 純正丁醇 3分鐘 最后用加拿大樹膠封片 附圖附圖1 植物