基因工程制藥的下游技術

1、 基因工程藥物的分離純化技術基因工程藥物的分離純化技術 基因工程藥物的特點基因工程藥物的特點l目的產物在初始物料中含量低目的產物在初始物料中含量低l含目的產物的初始物料組成復雜含目的產物的初始物料組成復雜l目的產物的穩(wěn)定性差目的產物的穩(wěn)定性差l種類繁多（多糖、多肽、蛋白質、抗體、疫苗等）種類繁多（多糖、多肽、蛋白質、抗體、疫苗等）l應用面廣，對其質量、純度要求高，甚至要求無應用面廣，對其質量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱源等菌、無熱源等下游技術下游技術l指從發(fā)酵液中分離和純化產品的技術過程，包指從發(fā)酵液中分離和純化產品的技術過程，包括括固液分離技術固液分離技術（離心、過濾、沉淀等）、（離心、

2、過濾、沉淀等）、細細胞破壁技術胞破壁技術（超聲、高壓剪切、滲透壓、表面（超聲、高壓剪切、滲透壓、表面活性劑和溶壁酶等）、活性劑和溶壁酶等）、蛋白質純化技術蛋白質純化技術（沉淀（沉淀法、色譜分離法和超濾法等），最后還有法、色譜分離法和超濾法等），最后還有產品產品的包裝處理技術的包裝處理技術（真空干燥、冰凍干燥等），（真空干燥、冰凍干燥等），是運用生物化學、物理學方法分離、純化產品，是運用生物化學、物理學方法分離、純化產品，最終將產品推向市場并獲得社會或經濟效益的最終將產品推向市場并獲得社會或經濟效益的過程。過程。l基因工程產業(yè)化除上游構建工程菌之外基因工程產業(yè)化除上游構建工程菌之外,下游下游必須

3、建立生產規(guī)模的發(fā)酵工藝、離心、細胞破必須建立生產規(guī)模的發(fā)酵工藝、離心、細胞破碎、目的產物的分離、純化、恢復表達產物的碎、目的產物的分離、純化、恢復表達產物的天然結構使之具有生物活性、表達產物的修飾天然結構使之具有生物活性、表達產物的修飾加工等。加工等。l就基因工程產業(yè)化而言就基因工程產業(yè)化而言,下游技術的研究與建下游技術的研究與建立是十分重要的立是十分重要的,又是十分耗時的又是十分耗時的,需要遠比上需要遠比上游研究多得多的投資。游研究多得多的投資。（一）、建立工藝需了解各種因素（一）、建立工藝需了解各種因素l含目的產物的初始物料的特點含目的產物的初始物料的特點l物料中雜質種類和性質物料中雜質種

4、類和性質l目的產物特性目的產物特性l產品質量要求產品質量要求l與傳統(tǒng)方式相似與傳統(tǒng)方式相似,重組蛋白的分離純化也是利用其物重組蛋白的分離純化也是利用其物理和化學性質的差異理和化學性質的差異,在進行任何一種蛋白質純化工在進行任何一種蛋白質純化工藝設計之前藝設計之前,都需要盡可能多地先對提純的體系都需要盡可能多地先對提純的體系,目目標蛋白和雜質的性質進行了解。標蛋白和雜質的性質進行了解。如目標蛋白質的相如目標蛋白質的相對分子質量、等電點、疏水性、帶電性、碳氫鏈或對分子質量、等電點、疏水性、帶電性、碳氫鏈或自由巰基存在情況等。另外還需對影響目標蛋白活自由巰基存在情況等。另外還需對影響目標蛋白活性的因

5、素有了解性的因素有了解,如溫度、如溫度、H、有機溶劑、蛋白變、有機溶劑、蛋白變性劑、重金屬離子、機械剪切力等性劑、重金屬離子、機械剪切力等,以保證純化后的以保證純化后的蛋白活性。蛋白活性。l當前蛋白質的純化主要是依靠色譜（層析技術）和當前蛋白質的純化主要是依靠色譜（層析技術）和電泳技術。電泳技術。由于重組蛋白在組織和細胞中仍以復雜由于重組蛋白在組織和細胞中仍以復雜混合物的形式存在混合物的形式存在,因此到目前為止還沒有一個單獨因此到目前為止還沒有一個單獨或一整套現(xiàn)成的方法把任何一種蛋白質從復雜的混或一整套現(xiàn)成的方法把任何一種蛋白質從復雜的混合物中分離出來合物中分離出來,而只能依據目標蛋白的物理化

6、學性而只能依據目標蛋白的物理化學性質摸索和選擇一套綜合上述方法的適當分離程序質摸索和選擇一套綜合上述方法的適當分離程序,以以獲得較高純度的制品。獲得較高純度的制品。（二）、分離純化的基本過程（二）、分離純化的基本過程l細胞破碎細胞破碎l固液分離固液分離l濃縮與初步純化濃縮與初步純化l高度純化直至得到純品高度純化直至得到純品l成品加工成品加工（三）、細胞的破碎方法（三）、細胞的破碎方法l物理破碎法物理破碎法：高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎法、高壓擠壓法破碎法、高壓擠壓法l化學破碎法：化學破碎法：滲透沖擊、增溶法、脂溶法滲透沖擊、增溶法、脂溶法l生物破碎法：生物破碎法

7、：酶溶法酶溶法（四）、固液分離（四）、固液分離l沉淀：沉淀：鹽沉淀、有機溶劑沉淀、等電點沉淀、熱鹽沉淀、有機溶劑沉淀、等電點沉淀、熱變性沉淀變性沉淀l離心：離心：高速離心和超速離心高速離心和超速離心l膜過濾：膜過濾：微濾、超濾和反滲透微濾、超濾和反滲透l雙水相萃取雙水相萃取 （五）、重組蛋白質的分離純化（五）、重組蛋白質的分離純化l分離純化主要依賴分離純化主要依賴色譜層析分離色譜層析分離方法。分為離子交換方法。分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜及高壓液相色譜等譜及高壓液相色譜等l色譜技術是醫(yī)藥生物技術下游過程精制階段的常用

8、手色譜技術是醫(yī)藥生物技術下游過程精制階段的常用手段，其優(yōu)點是該法具有多種多樣的分離機制、設備簡段，其優(yōu)點是該法具有多種多樣的分離機制、設備簡單、便于自動化控制和分離過程中無發(fā)熱等有害效應單、便于自動化控制和分離過程中無發(fā)熱等有害效應2011-10-3011基因工程下游技術離子交換層析離子交換層析l離子交換層析離子交換層析(ion exchange chromatography，IEC）是是以蛋白質分子凈電荷和表面電荷分布以蛋白質分子凈電荷和表面電荷分布為分離基礎的。具體就是利用蛋白質帶電性的為分離基礎的。具體就是利用蛋白質帶電性的差異差異,在離子吸附劑上靜電吸附能力不同在離子吸附劑上靜電吸附能

9、力不同,用不用不同的同的pH/離子強度洗脫液洗脫離子強度洗脫液洗脫,從而使蛋白質分從而使蛋白質分離的柱層析方法。離的柱層析方法。l離子交換色譜分辨率高、容量大、操作容易，離子交換色譜分辨率高、容量大、操作容易，為多肽、蛋白質、核酸和許多發(fā)酵產物分離純?yōu)槎嚯?、蛋白質、核酸和許多發(fā)酵產物分離純化的一種重要方法化的一種重要方法l離子交換離子交換又分為：又分為：陽離子交換劑和陰離子陽離子交換劑和陰離子疏水層析疏水層析l疏水層析疏水層析(hydrophobic interaction chromatography，HIC）是利用蛋白質表面的疏水區(qū)域與固定相上疏是利用蛋白質表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基

10、團相互作用力的差異，對蛋白質組分進行分水性基團相互作用力的差異，對蛋白質組分進行分離的層析方法離的層析方法l廣泛應用于蛋白質類大分子的分離以及蛋白質結構廣泛應用于蛋白質類大分子的分離以及蛋白質結構和折疊機制的研究等和折疊機制的研究等l在高鹽濃度時，蛋白質與固定相疏水締合；鹽在高鹽濃度時，蛋白質與固定相疏水締合；鹽濃度降低時蛋白質疏水作用減弱，目的蛋白質濃度降低時蛋白質疏水作用減弱，目的蛋白質被逐步洗脫下來被逐步洗脫下來l疏水色譜回收率較高，蛋白質與固定相的疏水疏水色譜回收率較高，蛋白質與固定相的疏水作用力較弱，蛋白質變性的可能性小，蛋白質作用力較弱，蛋白質變性的可能性小，蛋白質活性在層析分離過

11、程中不易喪失活性在層析分離過程中不易喪失親和層析親和層析l親和層析親和層析(affinity chromatography，AC）是利是利用固定化配體與目的蛋白質之間非常特異的生用固定化配體與目的蛋白質之間非常特異的生物親和力進行吸附，這種結合既是特異的，又物親和力進行吸附，這種結合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結合解除是可逆的，改變條件可以使這種結合解除l親和色譜親和色譜是分離純化蛋白質、酶等生物大分子是分離純化蛋白質、酶等生物大分子最為特異而有效的層析技術，分離過程簡單、最為特異而有效的層析技術，分離過程簡單、快速，具有很高的分辨率，在生物分離中有廣快速，具有很高的分辨率，在生

12、物分離中有廣泛的應用。同時也可用于某些生物大分子結構泛的應用。同時也可用于某些生物大分子結構和功能的研究和功能的研究凝膠過濾層析凝膠過濾層析l凝膠過濾層析凝膠過濾層析(gel filtration chromatography）又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析，是以多孔又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析，是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對溶液中各性凝膠填料為固定相，按分子大小對溶液中各組分進行分離的液相層析方法。填料有一定大組分進行分離的液相層析方法。填料有一定大小范圍的孔徑，大分子進不去先洗脫，小分子小范圍的孔徑，大分子進不去先洗脫，小分子進入孔徑而后被阻滯，不同的蛋白質根據它們進入孔徑而后

13、被阻滯，不同的蛋白質根據它們大小和形狀的不同在層析柱中被分離大小和形狀的不同在層析柱中被分離l優(yōu)點：設備簡單、操作方便、樣品回收率高、優(yōu)點：設備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復性好、不改變樣品生物學活性等實驗重復性好、不改變樣品生物學活性等l缺點：分辨率較低，尤其是相對分子質量相近缺點：分辨率較低，尤其是相對分子質量相近的分子之間的分子之間l廣泛用于蛋白質廣泛用于蛋白質(酶）、核酸、多糖等生物大酶）、核酸、多糖等生物大分子的分離純化分子的分離純化l用于蛋白質相對分子質量的測定、脫鹽、樣品用于蛋白質相對分子質量的測定、脫鹽、樣品濃縮等濃縮等（六）、非蛋白質類雜質的去除（六）、非蛋白質類雜質

14、的去除lDNA的去除的去除：離子交換離子交換層析、層析、親和層析親和層析、疏水疏水層析層析l熱原質的去除熱原質的去除：最好的方法是防止產生熱原質最好的方法是防止產生熱原質，陰離子交換層析法陰離子交換層析法，疏水層析法疏水層析法，親和層析法親和層析法（多黏菌素（多黏菌素B B）l病毒的去除：色譜分離、紫外線照射和過濾病毒的去除：色譜分離、紫外線照射和過濾l根據產物表達形式來選擇根據產物表達形式來選擇l根據分離單元之間的銜接選擇根據分離單元之間的銜接選擇l根據分離純化工藝的要求來選擇根據分離純化工藝的要求來選擇（七（七 ）、選擇分離純化方法的依據）、選擇分離純化方法的依據7.1 根據產物表達形式來

15、選擇根據產物表達形式來選擇l分泌型表達產物分泌型表達產物：濃縮處理濃縮處理（沉淀和超濾）沉淀和超濾）l可溶性表達產物：可溶性表達產物：親和層析，離子交換親和層析，離子交換l周質表達產物：周質表達產物：低濃度溶菌酶處理后，采用滲低濃度溶菌酶處理后，采用滲透壓休克的方法透壓休克的方法l包涵體：包涵體：對蛋白質分離純化有兩方面的影響，對蛋白質分離純化有兩方面的影響，一是它可以很容易地與胞內可溶性蛋白雜質分一是它可以很容易地與胞內可溶性蛋白雜質分離，蛋白純化較容易完成；另一方面產物經過離，蛋白純化較容易完成；另一方面產物經過了一個變性復性過程，較易形成產物的錯誤折了一個變性復性過程，較易形成產物的錯誤

16、折疊和聚合體疊和聚合體 l選擇不同機制的分離單元組成一套分離純化工選擇不同機制的分離單元組成一套分離純化工藝，盡早采用高效分離手段，將含量最多的雜藝，盡早采用高效分離手段，將含量最多的雜質先分離去除，將最昂貴、最費時的分離單元質先分離去除，將最昂貴、最費時的分離單元放在最后階段放在最后階段7.2 根據分離單元之間的銜接選擇根據分離單元之間的銜接選擇l先運用非特異、低分辨的操作單元，如沉淀、先運用非特異、低分辨的操作單元，如沉淀、超濾和吸附等，盡快縮小樣品體積，提高產物超濾和吸附等，盡快縮小樣品體積，提高產物濃度，去除最主要的雜質濃度，去除最主要的雜質l隨后采用高分辨率的操作單元，如離子交換色隨

17、后采用高分辨率的操作單元，如離子交換色譜和親和色譜譜和親和色譜l最后選用分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元最后選用分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元如凝膠排阻色譜，可以提高分離效果如凝膠排阻色譜，可以提高分離效果色譜分離次序的選擇色譜分離次序的選擇l經鹽析得到的液體不適宜于離子交換層析，可經鹽析得到的液體不適宜于離子交換層析，可直接應用疏水層析直接應用疏水層析l離子交換色譜之后進行疏水層析比較合適離子交換色譜之后進行疏水層析比較合適l親和層析多放在第二步以后親和層析多放在第二步以后l凝膠過濾色譜放在最后一步凝膠過濾色譜放在最后一步l要具有良好的穩(wěn)定性和重復性要具有良好的穩(wěn)定性和重復性l要盡可能減少

18、組成工藝的步驟要盡可能減少組成工藝的步驟l組成工藝的各技術或步驟之間要能相互適應和組成工藝的各技術或步驟之間要能相互適應和協(xié)調，工藝與設備也能相互適應，從而減少步協(xié)調，工藝與設備也能相互適應，從而減少步驟之間對物料的處理和條件調整驟之間對物料的處理和條件調整7.3 根據根據分離純化工藝的要求來選擇分離純化工藝的要求來選擇 l在工藝過程中要盡可能少用試劑，以免增加分在工藝過程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干擾產品質量離純化步驟，或干擾產品質量l工藝時間要盡可能短（生物活性收率會降低）工藝時間要盡可能短（生物活性收率會降低）l工藝和技術必須高效，收率高，易操作，對設工藝和技術必須高效，收率高，易操作，對設備要求低，能耗低備要求低，能耗低l具有較高的安全性具有較高的安全性（八）、產品的保存（八）、產品的保存l目的產物失活受多種理化因素的影響，保存