染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

1、一、 染色質(zhì)免疫共沉淀簡介 真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在。因此，研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。CHIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作

2、用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且，CHIP與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍：CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。由此可見，隨著CHIP的進(jìn)一步完善，它必將會在基因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用。染色質(zhì)免疫共沉淀可以：（1）組蛋白修飾酶的抗體作為“生物標(biāo)記”；（2）轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析；（3）藥物開發(fā)研究；（4）DNA損失與凋亡分析。二、ChIP的一般流程 甲醛處理細(xì)胞-收集細(xì)胞，超聲

3、破碎-加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合-加入ProteinA，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀-對沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結(jié)合-洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物-解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷-PCR分析。 三、PCR分析ChIP-chip技術(shù)對于大規(guī)模挖掘順式調(diào)控信息成績卓著，同時它可以用于胚胎干細(xì)胞和一些疾病如癌癥、心血管疾病和中央神經(jīng)紊亂的發(fā)生的機(jī)制。研究人員還可以利用這項(xiàng)技術(shù)開發(fā)一些治療方法。目前ChIP-chip技術(shù)研究主要集中于兩個領(lǐng)域：及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和條件特異性；組蛋白的修飾，組蛋白修飾蛋白和染色體重建。 ChI

4、P-chip在描述轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子動力學(xué)中的研究、染色體結(jié)構(gòu)組分的分布、在組蛋白的修飾、組蛋白修飾蛋白和染色體重建中的應(yīng)用也十分廣泛。ChIP-chip 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是，可以在體內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)；在給定的檢驗(yàn)細(xì)胞環(huán)境的模式下得到DNA相互關(guān)系的簡單影像；使用特異性修正抗體鑒定與包含有一個特異性后轉(zhuǎn)錄修正的蛋白質(zhì)的相關(guān)位點(diǎn)；直接或者間接（通過蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用）的鑒別基因組與蛋白質(zhì)的相關(guān)位點(diǎn)。缺點(diǎn)是：需要一個特異性蛋白質(zhì)抗體，有時難于獲得；為了獲得高豐度的結(jié)合片段，必須實(shí)驗(yàn)演示胞內(nèi)條件下靶標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；調(diào)控蛋白質(zhì)的基因的獲取可能需要限制在組織來源中。 總之，ChIP-chip 技術(shù)的發(fā)

5、展為析活細(xì)胞或組織中DNA與蛋白質(zhì)的相互關(guān)系提供了一個極為有力的工具。在未來的研究中，將對芯片的構(gòu)建進(jìn)行改進(jìn)，提高其實(shí)用性。使用易于獲得抗體，增加這種方法的可用性。在PCR分析這一塊，比較傳統(tǒng)的做法是半定量-PCR。但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向于Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP（其實(shí)就是用ChIP的方法研究細(xì)胞內(nèi)蛋白與RNA的相互結(jié)合，具體方法和ChIP差不多，只是實(shí)驗(yàn)過程中要注意防止RNase，最后分析的時候需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實(shí)就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基

6、礎(chǔ)上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據(jù)公司的要求來準(zhǔn)備樣品）。實(shí)驗(yàn)方法原理在保持組蛋白和DNA聯(lián)合的同時，通過運(yùn)用對應(yīng)于一個特定組蛋白標(biāo)記的生物抗體，染色質(zhì)被切成很小的片斷，并沉淀下來。IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A”特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來的方法。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞樣品試劑、試劑盒甲醛甘氨酸PBSSDS Lysis Buffer洗脫液RNaseA蛋白酶

7、Komega膠回收試劑盒儀器、耗材離心管超聲儀電泳儀離心機(jī)實(shí)驗(yàn)步驟一、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎（ 第一天） 1.  取出1平皿細(xì)胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（培養(yǎng)基共有9 ml）。 2.  37孵育10 min。 3.  終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中?；靹蚝?，在室溫下放置5 min即可。 4.  吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次。5.  細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15 ml離心管中（PBS依次為5

8、ml，3 ml和3 ml）。預(yù)冷后2 000 rpm 5 min收集細(xì)胞。 6.  倒去上清。按照細(xì)胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細(xì)胞終濃度為每200ul含2×106個細(xì)胞。這樣每100 ul溶液含1×106個細(xì)胞。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。假設(shè)MCF7長滿板為5×106個細(xì)胞。本次細(xì)胞長得約為80%。即為4×106個細(xì)胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800 ul。 7.  超聲破碎：VCX750，25%功率，4.5 s沖擊，9 s間隙。共14次。

9、 二、除雜及抗體哺育 （ 第一天） 1.  超聲破碎結(jié)束后，10 000 g 4離心10 min。去除不溶物質(zhì)。 2.  留取300ul做實(shí)驗(yàn)，其余保存于-80。 3.  300 ul中，100 ul加抗體做為實(shí)驗(yàn)組；100 ul不加抗體做為對照組；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M），65處理3 h解交聯(lián)，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。 4.  在100 ul的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50

10、×PIC。 再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4顛轉(zhuǎn)混勻1 h。 5.  1 h后，在4靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min。 6.  取上清。各留取20 ul做為input。一管中加入1 ul抗體，另一管中則不加抗體。4顛轉(zhuǎn)過夜。 三、檢驗(yàn)超聲破碎的效果 （ 第一天） 1.  取100 ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入4 ul 5M NaCl，65處理2 h解交聯(lián)。2.  分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。&#

11、160;四、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗（ 第二天） 1.  孵育過夜后，每管中加入60 ul ProteinA  Agarose/SalmonSperm DNA。4顛轉(zhuǎn)2 h。 2.  4靜置10 min后，700 rpm離心1 min。除去上清。 3.  依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入溶液，在4顛轉(zhuǎn)10 min，4靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min，除去上清。 洗滌溶液：（1）low salt wash buffer-one wash （2）highsalt was

12、h buffer-one wash （3）LiCl wash buffer-one wash （4）TE buffer-two wash 4.  清洗完畢后，開始洗脫。洗脫液的配方：100 ul 10%SDS，100 ul1M NaHCO3，800 ul ddH2O，共1 ml。 每管加入250 ul洗脫buffer，室溫下顛轉(zhuǎn)15 min，靜置離心后，收集上清。重復(fù)洗滌一次。最終的洗脫液為每管500 ul。 5.  解交聯(lián)：每管中加入20 ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M）。 6.  混

13、勻，65解交聯(lián)過夜。 五、DNA樣品的回收（第三天） 1.  解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1 ul RNaseA（MBI），37孵育1 h。 2.  每管加入10 ul 0.5 M EDTA，20 ul1M Tris.HCl（PH6.5），2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45處理2 h。 3.  DNA片段的回收-omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100 ul ddH2O。 六、PCR分析（第三天） 注意事項(xiàng)1. 注意抗體的性質(zhì)。抗體不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。2.  注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面