《細(xì)胞工程》教案

1、細(xì)胞工程電子教案第一章緒 論教學(xué)目的與要求全面了解細(xì)胞工程與現(xiàn)代生物技術(shù)的關(guān)系；了解細(xì)胞工程的發(fā)展與相關(guān)學(xué)科的聯(lián)系；了解細(xì)胞工程在現(xiàn)代世界經(jīng)濟(jì)中的潛力。教學(xué)重點：細(xì)胞工程學(xué)的發(fā)展方向與現(xiàn)狀及主要內(nèi)容教學(xué)難點：細(xì)胞工程學(xué)研究的主要內(nèi)容第一節(jié) 細(xì)胞工程在生物技術(shù)領(lǐng)域中的地位一、生物技術(shù)概述生物技術(shù)是以生物科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物個體或生物器官、組織、細(xì)胞的特性和功能，設(shè)計構(gòu)建具有預(yù)期性狀的新物種或新品系（包括細(xì)胞系），以及與工程原理相結(jié)合進(jìn)行產(chǎn)品加工生產(chǎn)的綜合性技術(shù)體系。生物技術(shù)的內(nèi)涵主要是：運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)理論與科學(xué)技術(shù)改造細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，培育出人們需要的生物新品種；工業(yè)規(guī)模地利用現(xiàn)有生物體系，制備生

2、物產(chǎn)品；模擬生物體系，以生物化學(xué)工程代替化學(xué)工程，制備工業(yè)產(chǎn)品；發(fā)展相應(yīng)的科學(xué)理論與工程技術(shù)。主要技術(shù)范疇包括：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程以及生化工程?，F(xiàn)代生物技術(shù)特征：多學(xué)科性；商業(yè)性；規(guī)?；?。二、細(xì)胞工程的概念及研究范疇細(xì)胞工程（cell engineering）是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，借助工程學(xué)的試驗方法或技術(shù)，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，以獲得特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品或新生物體的有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科。廣義的細(xì)胞工程包括所有的生物組織、器官及細(xì)胞離體操作和培養(yǎng)技術(shù)，狹義的細(xì)胞工程則是指細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。根據(jù)研究對象不同，細(xì)胞工程可分為動物細(xì)胞工

3、程和植物細(xì)胞工程。動物細(xì)胞工程包括：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)）；細(xì)胞融合技術(shù)；胚胎工程技術(shù) （核移植、胚胎分割等）；克隆技術(shù)（單細(xì)胞系克隆、器官克隆、個體克?。Ｖ参锛?xì)胞工程包括：植物組織、器官培養(yǎng)技術(shù)；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；原生質(zhì)體融合與培養(yǎng)技術(shù)；亞細(xì)胞水平的操作技術(shù)等。三、細(xì)胞工程與其它相關(guān)學(xué)科的關(guān)系1細(xì)胞工程學(xué)科的建立依賴于相關(guān)學(xué)科理論的發(fā)展2為生物學(xué)研究提供新的實驗體系3細(xì)胞工程必須與其它生物技術(shù)相結(jié)合才能更好地發(fā)揮作用四、細(xì)胞工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的地位及其實踐意義1改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)2保護(hù)自然資源，維護(hù)生態(tài)平衡3生物醫(yī)藥開發(fā)第二節(jié) 動物物細(xì)胞工程的發(fā)展一融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)19世紀(jì)30年

4、代，Muller, Schwann, Virchow等相繼在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等病理組織中觀察到多核細(xì)胞現(xiàn)象，但當(dāng)時并沒有引起人們的關(guān)注，認(rèn)為這只是一種特殊現(xiàn)象。1849年Lobing在骨髓中也發(fā)現(xiàn)了多核現(xiàn)象的存在，1855年1858年，科學(xué)家們在肺組織和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現(xiàn)了多核細(xì)胞。至此，自然界中廣泛存在著多核細(xì)胞的事實，才被生命科學(xué)工作者接受。1859年，A. Barli在研究黏蟲的生活史時發(fā)現(xiàn)，某些黏蟲存在著由單個細(xì)胞核融合形成多核的原生質(zhì)團(tuán)的情況。據(jù)此，他認(rèn)為多核細(xì)胞是由單個細(xì)胞彼此融合而形成的。二. 動物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立1907年，美國胚胎學(xué)家R. Har

5、rison將蛙的胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，這片組織在體外不但存活了若干星期，而且還從細(xì)胞中長出了軸突(神經(jīng)纖維)細(xì)胞，解決了當(dāng)時關(guān)于軸突起源的爭論，并表明了利用體外存活的組織進(jìn)行實驗研究的可能性。他所采用的把培養(yǎng)物放在蓋玻片上并置于凹玻片腔中培養(yǎng)的方法還一直沿用至今。Carrel (1911)發(fā)現(xiàn)了雞胚浸出液對于某些細(xì)胞的生長具有很強(qiáng)的促進(jìn)效應(yīng)，還把無菌技術(shù)引到了組織培養(yǎng)技術(shù)中。作為他的技術(shù)標(biāo)志是，他在不含抗菌素的培養(yǎng)條件下使雞胚心臟細(xì)胞維持生存了34年，先后繼代3400次，證明動物細(xì)胞有可能在體外無限地生長。1914年，Thomson創(chuàng)立了另一條完全不同的體外組織培養(yǎng)途徑器

6、官培養(yǎng)法，以后又Strangeways和Fell所發(fā)展。1940年，Earle建立了可以無限傳代的一個C3H小鼠的結(jié)締組織細(xì)胞系L系。二是1951年，Gay建立了第一個人體細(xì)胞系人體宮頸癌Hela細(xì)胞系三. 細(xì)胞融合技術(shù)的建立和雜交瘤技術(shù)的誕生1958年, Okada發(fā)現(xiàn)紫外滅活的仙臺病毒可引起艾氏腹水瘤細(xì)胞彼此融合。由于仙臺病毒能穩(wěn)定地誘發(fā)細(xì)胞融合而引起了許多科學(xué)家的興趣，60年代，Harris(1965)誘導(dǎo)不同的動物體細(xì)胞融合獲得成功并能存活下來。Lifflefield(1964)根據(jù)親本細(xì)胞的酶缺陷型，利用HAT選擇性培養(yǎng)基能使親本細(xì)胞死亡而只留下異型融合細(xì)胞，并能不斷地增殖，從此形成

7、了細(xì)胞融合到雜種細(xì)胞選擇、培養(yǎng)的一整_套技術(shù)。使這一技術(shù)在此后廣泛地應(yīng)用于遺傳學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)等多種學(xué)科的研究工作中。1975年，免疫學(xué)家Kohler和Milstein利用仙臺病毒誘導(dǎo)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，選擇到能分泌單一抗體的雜種細(xì)胞。該雜種細(xì)胞具有在小鼠體內(nèi)和體外培養(yǎng)條件下大量繁殖的能力，并能長期地分泌單克隆抗體，從而建立了小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)的誕生把細(xì)胞融合技術(shù)從實驗階段推向了應(yīng)用研究階段，促進(jìn)了動物細(xì)胞工程的蓬勃發(fā)展。四. 動物克隆技術(shù)的建立Heape等人首次報道了家兔胚胎移植成功的結(jié)果，他們把安哥拉家兔胚胎移植給比利時兔，得到了4只安哥

8、拉家兔。本世紀(jì)30年代以后，先后在羊、豬、牛等動物的胚胎移植上獲得成功。經(jīng)過幾十年的不斷完善和充實，已成為一項比較成熟的繁殖生物學(xué)技術(shù)。首例克隆動物成功的報道是在1962年，英國學(xué)者Grudon把非洲爪蟾小腸上皮細(xì)胞的核注入同種或異種非洲爪蟾未受精卵(經(jīng)紫外線照射殺死卵細(xì)胞核)中，約有1的重組卵發(fā)育成為成熟蛙。這一成功開創(chuàng)了由體細(xì)胞培育動物個體的新型實驗途徑，其貢獻(xiàn)在于：實驗證明了完全分化的腸細(xì)胞仍然具有未分化細(xì)胞的全部遺傳信息，并能在一定的條件下發(fā)育成動物個體，從而證明了動物細(xì)胞仍然具有全能性；初步建立了體細(xì)胞核移植的實驗體系，證明在體細(xì)胞核轉(zhuǎn)至胚胎發(fā)育方向的早期，卵細(xì)胞質(zhì)對體細(xì)胞核的發(fā)育功

9、能起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，其作用因子可能是細(xì)胞質(zhì)中的mRNA與有關(guān)的蛋白質(zhì)。1997年2月，英國科學(xué)家Wilmut等在世界權(quán)威雜志Nature上首例報道了世界第一只克隆羊的誕生。它的貢獻(xiàn)在于：實驗證明了哺乳動物高度分化的細(xì)胞同樣含有全套遺傳信息，亦能在一定條件下發(fā)育成動物個體，進(jìn)一步證明了動物細(xì)胞的全能性。*多利誕生的技術(shù)路線：取6歲供體羊乳腺細(xì)胞 血清饑餓培養(yǎng)使細(xì)胞處于G0期經(jīng)GnRH處理取卵細(xì)胞 移去卵細(xì)胞的細(xì)胞核將培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞的核移植到去核的卵細(xì)胞中重組細(xì)胞植入第一受體羊輸卵管中培養(yǎng)至胚泡期(桑椹胚)桑椹胚再移植入第二受體羊子宮內(nèi)發(fā)育至分娩第三節(jié) 植物細(xì)胞工程的發(fā)展植物細(xì)胞工程是一門以植

10、物組織和細(xì)胞的離體操作為基礎(chǔ)的實驗性學(xué)科。它是以植物組織細(xì)胞為基本單位，在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種或創(chuàng)造新物種，或加速繁殖植物個體，或獲得有用物質(zhì)的過程統(tǒng)稱為植物細(xì)胞工程。植物細(xì)胞工程是在植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，因此，植物細(xì)胞工程亦是廣義概念上的植物組織培養(yǎng)。一探索階段在這一階段中，細(xì)胞學(xué)說的產(chǎn)生和細(xì)胞全能性學(xué)說的提出為組織培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)生奠定了理論基礎(chǔ)。在這些理論的指導(dǎo)下所開展的有關(guān)試驗，對組織培養(yǎng)技術(shù)的建立進(jìn)行了有益的探索。細(xì)胞學(xué)說（cell theory）是Schleiden和Schwann分別于1838年和

11、1839年提出的，其核心內(nèi)容是，細(xì)胞是有機(jī)體，亦是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位，由它構(gòu)成整個生物個體。同時，植物細(xì)胞又是在生理和發(fā)育上具有潛在全能性的功能單位。隨后，Schwann在1839年更明確的指出：“如果具有與有機(jī)體內(nèi)一樣的條件時，每個細(xì)胞應(yīng)該可以獨(dú)立生活和發(fā)展”。這一論點已成為組織培養(yǎng)研究的思想基礎(chǔ)。細(xì)胞全能性學(xué)說是德國著名植物學(xué)家G. Haberlandt在細(xì)胞學(xué)說的基礎(chǔ)上于1902年提出的。他認(rèn)為，高等植物的組織、器官可以不斷分割，直到單個細(xì)胞。如果每個細(xì)胞都有植物個體一樣的性質(zhì)和能力，那么，可以通過植物細(xì)胞培養(yǎng)使單個細(xì)胞發(fā)育成為一個新個體。二培養(yǎng)技術(shù)建立階段作為一門技術(shù)，它必須具有一定

12、的程序性。也就是說，它應(yīng)該具有一定的技術(shù)模式。在這一階段，植物組織培養(yǎng)建立了兩個與培養(yǎng)技術(shù)有關(guān)的重要模式，一是培養(yǎng)基模式，二是激素調(diào)控模式。三應(yīng)用研究階段其一，組織培養(yǎng)領(lǐng)域的研究迅速在世界各國的有關(guān)實驗室廣泛展開。其二，技術(shù)體系更加完善。這一階段的技術(shù)體系包括：根據(jù)不同的培養(yǎng)目的外植體的取材和滅菌方法，不同外植體及其培養(yǎng)產(chǎn)物的培養(yǎng)程序，適合于不同植物種類和外植體類型的培養(yǎng)基等。其三，形成了較為完整的理論體系。在植物組織培養(yǎng)研究的基礎(chǔ)上，植物細(xì)胞工程現(xiàn)已形成了以細(xì)胞全能性為基本理論基礎(chǔ)，以細(xì)胞脫分化和再分化調(diào)控為中心的理論體系。其四，研究目的性更加明確，并已廣泛應(yīng)用到生物科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，以細(xì)

13、胞工程為基礎(chǔ)的新型生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)正在興起。四植物細(xì)胞工程應(yīng)用在植物育種上的應(yīng)用將常規(guī)植物育種技術(shù)與植物組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，可以獲得常規(guī)技術(shù)難以或無法獲得的種質(zhì)材料，縮短育種周期，提高育種效率?？焖佾@得特殊倍性材料；克服遠(yuǎn)緣雜交不親和；克服雜種胚早期夭折；導(dǎo)入外源基因；突變體篩選；種質(zhì)資源保存種苗脫病毒與快速繁殖細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用次生產(chǎn)物在細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究中的應(yīng)用在植物遺傳、生理生化以及植物病理等基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用思考題1細(xì)胞工程的概念、研究范疇、在生命科學(xué)中與其它學(xué)科的關(guān)系。2動物細(xì)胞工程發(fā)展的主要標(biāo)志性階段。3植物細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展階段與標(biāo)志性成就。4植物細(xì)胞工程的作用與應(yīng)用領(lǐng)域。63第

14、二章 實驗室設(shè)置及一般技術(shù)教學(xué)目的與要求：了解細(xì)胞工程的通用技術(shù)，初步掌握細(xì)胞工程實驗技術(shù)所需設(shè)備以及無菌操作的原理與操作方法。教學(xué)重點：實驗室配制、基本操作技術(shù)教學(xué)難點：無菌操作技術(shù)第一節(jié) 實驗室設(shè)置細(xì)胞工程實驗室它必須滿足三個基本的需要，即：實驗準(zhǔn)備，包括培養(yǎng)基配制，洗滌與滅菌等；無菌操作；控制培養(yǎng)。一實驗室組成1基本實驗室準(zhǔn)備室 準(zhǔn)備室的功能就是進(jìn)行一切與實驗有關(guān)的準(zhǔn)備工作。要求寬敞明亮，通風(fēng)條件好。接種室 接種室的功能是進(jìn)行無菌操作。要求封閉性好，干燥清潔，能較長時間保持無菌。房間一般不宜過大，其規(guī)模根據(jù)實驗需要而定。接種室除了出入口和通氣口外，應(yīng)行密閉。培養(yǎng)室 培養(yǎng)室的功能是對離體材

15、料進(jìn)行控制培養(yǎng)。其首要要求是要能控制光照和溫度，其次為防止微生物感染，培養(yǎng)室應(yīng)保持干燥和清潔。2輔助實驗室細(xì)胞學(xué)實驗室 其功能是對培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。攝影室及暗室 其功能是進(jìn)行培養(yǎng)材料的攝影記錄和膠片沖印。在有條件的情況下可建立此實驗室。生化分析室 在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實驗室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗實驗室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時進(jìn)行取樣檢查。細(xì)胞工程實驗室布局的其基本要求是：便于隔離、便于操作、便于滅菌、便于觀察。二基本設(shè)備配制基本設(shè)備 冰箱、天平、酸度計、純水器、電爐、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器。滅菌設(shè)備 蒸汽壓力滅菌

16、鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。無菌操作設(shè)備 凈化工作臺、接種箱。光溫控制設(shè)備 時間程序控制器、空調(diào)及溫度感應(yīng)器。細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備 培養(yǎng)設(shè)備根據(jù)需要而定，包括培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、搖床、生物反應(yīng)器等。細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備 光學(xué)研究顯微鏡、實體顯微鏡、倒置顯微鏡。除上述基本設(shè)備外，如果有條件和需要還可配制攝影設(shè)備、生化分析設(shè)備等。三培養(yǎng)器皿及實驗用具玻璃器皿新型材料器皿金屬材質(zhì)用具第二節(jié) 基本技術(shù)一洗滌技術(shù)1洗滌液鉻酸洗滌液是用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)與硫酸(H2SO4)配制而成，可根據(jù)需要配制成弱、中、強(qiáng)三種。弱 用重鉻酸鉀50g加入蒸餾水1L，加熱溶化，冷卻后再緩慢加入濃硫酸90ml。中

17、 用重鉻酸鉀50g加入蒸餾水100ml，加熱溶化，冷卻后再緩慢加入濃硫酸875ml。強(qiáng) 與濃硫酸加熱的同時緩慢加入磨碎的重鉻酸鉀，直到重鉻酸鉀達(dá)到飽和為止。一般濃硫酸1L加入重鉻酸鉀50g。2洗滌方法玻璃器皿洗滌塑料用品洗滌金屬用品洗滌二滅菌、消毒技術(shù)物理方法： 物理滅菌 干熱、濕熱、射線處理；物理除菌 過濾、離心沉淀等化學(xué)方法： 消毒劑、抗菌素滅菌1培養(yǎng)基滅菌2玻璃器皿滅菌3金屬用具滅菌4接種室滅菌5外植體滅菌幾種常用消毒劑的效果比較消 毒 劑使用濃度() 消毒時間(分) 效 果殘液去除難易次氯酸鈣10 530 好易次氯酸鈉25 530 好易新潔爾滅1020 530 好易氯化汞0.11 21

18、0 最好最難過氧化氫1012 515 較好最易抗菌素450mgl-1 3060 較好較難思考題1、如果讓你建一個植物細(xì)胞工程實驗室，在實驗室的設(shè)置和主要儀器與設(shè)備方面你會怎么設(shè)計?2、簡述在細(xì)胞工程實驗室內(nèi)常用的基本設(shè)備和滅菌設(shè)備。3、簡述玻璃器皿的洗滌程序。4、簡述物理滅菌的方法和其應(yīng)用對象及特點。5、化學(xué)滅菌的試劑和應(yīng)用范圍是什么？6、簡述無菌操作技術(shù)。第三章組織培養(yǎng)教學(xué)目的與要求：深入了解植物細(xì)胞的全能性，以及器官的發(fā)生和體細(xì)胞胚的形成，并掌握組織培養(yǎng)中培養(yǎng)的制備、基本培養(yǎng)方法，并掌握單倍體的培養(yǎng)、原生質(zhì)體的制備和培養(yǎng)、脫毒苗的脫毒技術(shù)以及工人種子的生成。教學(xué)重點：植物細(xì)胞的全能性、組織

19、培養(yǎng)的基本技術(shù)及操作規(guī)程，單倍體、原生質(zhì)、脫莖尖脫毒和人工種子制備過程。教學(xué)難點：單倍體、原生質(zhì)、脫莖尖脫毒和人工種子制備技術(shù)。第一節(jié)細(xì)胞全能性與形態(tài)發(fā)生一、細(xì)胞全能性概述簡單地講，一個生活細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的潛在能力稱之為細(xì)胞的全性。參照動物細(xì)胞研究分類類型，植物細(xì)胞也可分為三類：第一類是莖尖、根尖及形成層細(xì)胞，這類細(xì)胞始終保持分裂能力，從一個周期進(jìn)入另一個周期，為周期細(xì)胞。第二類是篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞，他們?yōu)橛谰檬シ至涯芰Φ募?xì)胞，為終端分化細(xì)胞。第三類是表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞，這類細(xì)胞在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新啟動分裂，稱為Go細(xì)胞一個植物細(xì)胞向

20、分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進(jìn)行的程度，取決于它在自然部位上所處的位置和生理狀態(tài)。培養(yǎng)條件下的細(xì)胞脫分化培養(yǎng)條件下使一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過程就是細(xì)胞脫分化（dedifferentiation）。1細(xì)胞脫分化過程中生理活動與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化脫分化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)會發(fā)生急劇變化。這些變化總體上包括：細(xì)胞質(zhì)顯著變濃，大液泡消失，核體積增加并逐漸移位至細(xì)胞中央，細(xì)胞器增加。液泡蛋白體的出現(xiàn)和質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體被認(rèn)為是細(xì)胞脫分化的重要特征。根據(jù)脫分化過程的時空順序，細(xì)胞的脫分化過程可分為三個階段：第一階段為啟動階段，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)增生，并開始向細(xì)胞中央伸出細(xì)胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)；第二階

21、段為演變階段，此時細(xì)胞核開始向中央移動，質(zhì)體演變成原質(zhì)體；第三階段為脫分化終結(jié)期，細(xì)胞回復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞分裂即將開始。2細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理細(xì)胞周期調(diào)控激素的作用PSK的調(diào)控作用染色體變化3細(xì)胞分裂與愈傷組織形成脫分化是細(xì)胞生理狀態(tài)的改變，而形成愈傷組織是離體培養(yǎng)中的一個階段。細(xì)胞分化所謂細(xì)胞分化（differentiation），是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變芲_的過程（許智宏，1998）。一個細(xì)胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)和機(jī)能，這是在時間上的分化；同一種細(xì)胞后代，由于所處的環(huán)境（如部位）不同而可以有相異的形態(tài)和機(jī)能，這是在空間上的分化。單細(xì)胞生物僅

22、有時間上的分化，如噬菌體的溶菌型和溶原型。多細(xì)胞生物的細(xì)胞不但有時間上的分化，而且由于在同一個體上的各個細(xì)胞所處的位置不同，因而發(fā)生機(jī)能上的分工，于是又有空間上的分化，如一個植物個體在其頂端、根、莖、葉等不同部位具有不同的細(xì)胞。1細(xì)胞分化與基因組變化染色體重復(fù)復(fù)制DNA的差異擴(kuò)增基因重排2極性與細(xì)胞分化所謂極性是指植物的器官、組織、甚至單個細(xì)胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。極性無論在低等植物或高等植物中均普遍存在。極性一旦建立，在一般情況下不可逆轉(zhuǎn)。在很多情況下，細(xì)胞的不均等分裂是細(xì)胞極性建立的標(biāo)志。3TE細(xì)胞分化及其調(diào)控作為維管系統(tǒng)的主要成分，管狀分子（trach

23、eary elements，TEs）在維管系統(tǒng)的形成中具有中心作用。在植物系統(tǒng)發(fā)育條件下，TEs由根和芽的原形成層或次生形成層細(xì)胞分化形成。在離體培養(yǎng)條件下，TEs則由愈傷組織薄壁細(xì)胞分化形成，這也是愈傷組織細(xì)胞分化器官的前提。4激素在細(xì)胞分化中的調(diào)控作用激素在植物生長發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用，也是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素，其中生長素和細(xì)胞分裂素是兩類主要的調(diào)控培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長和分化的植物激素。此外，在有些試驗中也顯示，GA3、ABA、乙烯等也在細(xì)胞分化中起到一定的調(diào)節(jié)作用。二、器官發(fā)生植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根（adven

24、titious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器官的過程。離體培養(yǎng)中器官發(fā)生的方式通過器官發(fā)生形成再生植株大體上有三種方式：第一種方式是先芽后根第二種方式為先根后芽第三種方式是在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯(lián)系形成完整植株。器官分化過程離體培養(yǎng)條件下，經(jīng)過愈傷組織再分化器官一般要經(jīng)過三個生長階段。第一階段是外植體經(jīng)過誘導(dǎo)形成愈傷組織。第二階段是“生長中心”形成。當(dāng)把愈傷組織轉(zhuǎn)移到有利于有序生長的條件下以后，首先在若干部位成叢出現(xiàn)類似形成層的細(xì)胞群，通常稱之為“生長中心”，也稱為擬分生組織，它們是愈傷組織中形成器官的部位。第三階段是器官原基及器

25、官形成。在有些情況下，外植體不經(jīng)過典型的愈傷組織即可形成器官原基。這一途徑有兩種情況：一是外植體中已存在器官原基，進(jìn)一步培養(yǎng)即形成相應(yīng)的組織器官進(jìn)而再生植株，如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)；另一種情況是外植體某些部位的細(xì)胞，在重新分裂后直接形成分生細(xì)胞團(tuán)，然后由分生細(xì)胞團(tuán)形成器官原基。這種不經(jīng)過愈傷組織直接發(fā)生器官的途徑在以品種繁殖為目的的離體培養(yǎng)中具有重要的實踐意義。研究表明，在葉肉細(xì)胞再生植株過程中，最初分裂細(xì)胞的第一次分裂軸向是十分重要的。在不經(jīng)過愈傷組織的器官分化中，這次平周分裂既是葉肉細(xì)胞的脫分化，同時也是該細(xì)胞轉(zhuǎn)變發(fā)育方式極性的確定。現(xiàn)在，有人把最先啟動分裂的這些細(xì)胞稱之為感受態(tài)細(xì)胞。第

26、二節(jié)植物組織培養(yǎng)的概念與基本方法一、植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)是在含有營養(yǎng)物質(zhì)及植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)離體植物組織（器官或細(xì)胞）并誘導(dǎo)使其長成完整植株的技術(shù)。離體培養(yǎng)的細(xì)胞、組織或器官發(fā)育形成完整植株是通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官形成兩種方式實現(xiàn)的。二、植物組培的培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基的概念培養(yǎng)基是植物細(xì)胞、組織和器官離體培養(yǎng)所需的營養(yǎng)物質(zhì)，其中含有植物細(xì)胞生長分化所必需的各種營養(yǎng)成分和生長調(diào)節(jié)物質(zhì)同。對培養(yǎng)基成分的篩選和優(yōu)化是植物組織培養(yǎng)中非常重要的步驟。各種常用培養(yǎng)基之間在組分上的主要差別在于各種鹽或離子數(shù)量上的不同。2、培養(yǎng)基的組成（1）無機(jī)鹽類大量元素 培養(yǎng)基的大量元素使用量一般每升幾

27、十至幾千毫克（濃度大于0.5mmol/L）。植物所必有的元素除 C，H，O外，大量元素包括N，P，K，Ca，Mg，S微量元素 微量元素的用量一般濃度低于0.5mmol/L 。植物所需要的微量元素有Fe，Cu，Zn，B，Mu，MnWhite培養(yǎng)基是最早的植物組織培養(yǎng)基之一。（2）有機(jī)營養(yǎng)成分碳源最常用的碳源是糖（濃度一般為2%5%），既可做為碳源，又可維持培養(yǎng)基的滲透壓。維生素直接參與生物催化劑酶的形成，還參與植物蛋白、脂肪的代謝等重要生命活動。常用維生素是VB1（硫胺素）、VB6（吡哆醇）、Vpp（煙酸）、VB5（泛酸鈣）、VH（生物素）氨基酸蛋白質(zhì)的組成成分。其它天然提取物 如椰乳、番茄汁、

28、YE(酵母提取物)（3）植物激素植物激素是人工合成培養(yǎng)基中必不可少的成分。常用的植物激素有：生長素類、細(xì)胞分裂素類和赤霉素類。在誘導(dǎo)離體細(xì)胞分裂和分化過程中，常需要生長素和細(xì)胞分裂素的協(xié)同作用。生長素類在組織培養(yǎng)中生長素被用于誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化。常用的生長素有IAA(吲哆乙酸)、NAA (奈乙酸 )、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哆丁酸)等。它們的主要作用是誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生；作用的強(qiáng)弱順序為：2，4-D>NAA>IBA>IAA。細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素影響細(xì)胞分裂、頂端優(yōu)勢的變

29、化和莖的分化等。常用的細(xì)胞分裂素有KT (激動素或呋喃氨基嘌呤)、6BA(6-卞基腺嘌呤)、2-ip(異戊烯氨基嘌呤)、ZT（玉米素）等。它們的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢、促進(jìn)側(cè)芽的生長及顯著改變其他的激素作用；作用的強(qiáng)弱順序為：ZT>2-iP>6-BA>KT。赤毒素類在植物組織培養(yǎng)中加入的赤毒素是GA3。主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長生長，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株此外，根據(jù)不同培養(yǎng)目的， ABA(脫落酸)、乙烯、B9、CCC(矮壯素)等生長抑制物質(zhì)有時也被用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的生長發(fā)育過程，如誘導(dǎo)某些變態(tài)器官的發(fā)生等。（4）瓊脂瓊

30、脂是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物 瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40 即凝固為固體狀凝膠。通常所說的“煮化”培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90以上的熱水。瓊脂的用量在610gL之間，若濃度太高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散到培養(yǎng)的組織中去。若濃度過低，凝固性不好。其主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，同時不參與代謝。（5）活性炭活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉沫結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。加入培養(yǎng)基中的目的主要是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響，如可以防止酚類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。3、培養(yǎng)基的制備

31、通常先配制一系列母液，即貯備液。所謂母液是欲配制液的濃縮液，這樣不但可以保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時的快速移取，而且還便于低溫保藏。一般母液配成比所需濃度高10-200倍。母液配制時可分別配成大量元素（1020倍）、微量元素（100200倍）、鐵鹽（200倍） 、有機(jī)物（200倍）和激素類等。配制母液時要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品應(yīng)選取等級較高的化學(xué)純或分析純。藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起。母液配好后放人冰箱內(nèi)低溫保存，用時再按比例稀釋。4、常用培養(yǎng)基（1

32、）MS培養(yǎng)基 它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計的。特點是無機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。 （2）B5培養(yǎng)基 是1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計的。其主要特點是含有較低的銨，這可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。 （3）White培養(yǎng)基 是1943年由White為培養(yǎng)

33、番茄根尖而設(shè)計的。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MgSO4的濃度和增加了鵬素。其特點是無機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。（4）N6培養(yǎng)基 是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計的。其特點是成分較簡單，KNO3和(NH4)2SO4含量高。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。（5）KM-80培養(yǎng)基  它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計的。其特點是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。 三、植物組織培養(yǎng)的一般方法1、洗滌培養(yǎng)瓶和其它器皿應(yīng)先在清水中浸泡后，然后刷去瓶內(nèi)污物，再用洗衣粉、洗

34、潔凈等洗滌。 洗凈的器皿應(yīng)不掛水珠，內(nèi)外壁水膜均一，置于烘箱內(nèi)烘干。2、滅菌無菌操作是植物組織培養(yǎng)中最關(guān)鍵的技術(shù)！ 培養(yǎng)基應(yīng)用高壓滅菌鍋滅菌121度15分鐘滅菌 一些不耐熱的物質(zhì)將采用過濾滅菌，如生物添加劑、赤霉酸和玉米素等 玻璃器皿及耐熱用具用干熱滅菌。 植物材料先刷洗然后沖洗，再用消毒液，如次氯酸鈉、升汞等進(jìn)行表面滅菌，最后用蒸餾水清洗。 3、原代培養(yǎng)外植體：從活植物體上切下進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官。1）外植體滅菌消毒。（根尖、莖、芽、嫩葉、種子、花粉等） 2）用消毒過的器械將外植體置于培養(yǎng)皿上。 3）切取所需的外植體。 4）將外植體接種于培養(yǎng)容器的培養(yǎng)基上， 整個試驗在超凈工作臺上進(jìn)行

35、，保持無菌！ 外植體經(jīng)過一段時間在培養(yǎng)基上生長后，會形成愈傷組織。 愈傷組織的形成脫分化：一個成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程即形成愈傷組織叫脫分化。 愈傷組織：在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團(tuán)無序生長的薄壁細(xì)胞。 再分化：愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞具有異質(zhì)性，能重新分化成各種類型的組織細(xì)胞。 4、繼代培養(yǎng)將愈傷組織重新轉(zhuǎn)移到成分相同的新鮮培養(yǎng)基上的過程稱為繼代，愈傷組織將在不同的培養(yǎng)基上分化形成小芽或根，進(jìn)而形成小苗。5、試管苗的煉苗當(dāng)小苗生根成為完整的再生植株后，可以出瓶種植。 由于環(huán)境有很大的改變，首先要進(jìn)行煉苗，使之適應(yīng)外界環(huán)境。 1）開蓋，保持小苗的水分供需平衡 2）放置在與種植環(huán)境相一致的的光

36、、溫條件下；或降低溫度，增加光照。 3）防止菌類滋生。 6、移栽意義1.無性系快速繁殖 2.去除病毒、真菌和細(xì)菌等病毒 3.培育新品種的得力手段 4.種質(zhì)資源的保存 5.次生代謝物的生產(chǎn)第三節(jié)植物的試管繁殖工藝流程一、單倍體培養(yǎng)單倍體：具有配子體染色體組成的孢子體；一般多指形成花粉的小孢子 60年代：印度Guha和Maheshwari進(jìn)行花藥培養(yǎng)，首次進(jìn)行了單倍體培養(yǎng)。 幼年植物的花藥和花粉都能進(jìn)行培養(yǎng)，形成花粉植株。雄核發(fā)育影響因子： 1）營養(yǎng)因子：蔗糖等 2）藥壁因子：花粉壁內(nèi)的物質(zhì) 3）花粉在接種時所處的發(fā)育時期 4）溫度和光照 5）供體植株的生理狀況：幼年植株較好花藥培養(yǎng)的基本程序是：

37、 外植體選擇外植體(花蕾)預(yù)處理外植體消毒剝?nèi)』ㄋ幗臃N誘導(dǎo)培養(yǎng)分化培養(yǎng)花粉及小孢子培養(yǎng)l 1. 取材時期的確定四分體單核早期單核晚期雙核早期雙核晚期三核期 小 孢 子 花 粉 粒 花粉培養(yǎng) 花藥培養(yǎng)花粉的發(fā)育時期四分體 小孢子 單核花粉 雙核花粉 花藥培養(yǎng)花粉或小孢子的分離小孢子的分離一般有兩種方法： 一是機(jī)械擠壓梯度離心法二是自然散粉法。這一方法可以和預(yù)培養(yǎng)結(jié)合進(jìn)行花粉培養(yǎng)（花藥看護(hù)法）具體做法是：取適宜發(fā)育時期的花蕾消毒，取出花藥。按上述介紹的方法分離小孢子，將小孢子細(xì)胞密度調(diào)整到0.5ml含10個細(xì)胞的密度；在配好的半固體培養(yǎng)基表面橫放幾個（4個）完整花藥，再在花藥上平放上滅菌的濾紙片；

38、取0.5ml（10個細(xì)胞）花粉懸液接種于濾紙片上，將接種的花粉懸液置于適宜條件下培養(yǎng)（一個月可長出綠色細(xì)胞團(tuán)）。其它單倍體的途徑1）由未受粉的子房或胚珠培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體的形成 2）利用遠(yuǎn)緣種雜交引起染色體消除以獲得單倍體 高等植物中單倍體的意義和應(yīng)用由于單倍體只有一套基因，隱性突變不受顯性基因干擾，攜帶有利突變的單倍體一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就可在一個世代內(nèi)通過染色體加倍，成為表現(xiàn)有利突變的二倍體。 應(yīng)用： 1）新品種培育 2）加速純系獲得 3）異源染色體或基因的轉(zhuǎn)移 4）突變體的選擇及應(yīng)用 現(xiàn)狀：成功主要局限于茄科，禾本科和十字花科單倍體植株的二倍體二、原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)1、分離2、酶解法原生質(zhì)體的純化植

39、物經(jīng)過一段時間的酶解后，需要將酶解混合物中破碎的原生質(zhì)體、未去壁的細(xì)胞、細(xì)胞器及其他碎片除出去。常用的方法有：過濾法：用濾網(wǎng)過濾酶解混合物，濾去未被酶解的細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)及組織塊。離心法：利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進(jìn)行過濾然后低速離心，使純凈完整的原生質(zhì)體集中于試管某一部位。飄浮法：采用比原生質(zhì)體比重大的高滲溶液（蔗糖、 Ficoll液等 ），使原生質(zhì)體漂浮在溶液表面。實際操作中一般聯(lián)合運(yùn)用多種方法3、原生質(zhì)體活力檢測目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、流動性確定原生質(zhì)體活力。FDA法：FDA（二乙酸熒光素）是一種非極性物質(zhì)，能自由地穿越細(xì)胞質(zhì)膜，在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)

40、熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過具熒光的細(xì)胞的觀察確定細(xì)胞活性。伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞使，細(xì)胞才能被染色，因而可以通過細(xì)胞被染色與否確定活性。目測法原生質(zhì)體培養(yǎng)方法三、植物脫毒培養(yǎng)技術(shù)1）無性繁殖作物，易感染病毒，造成品質(zhì)下降。 2）如何在一個已經(jīng)受感染的群體中獲得無病植株？ a.種子繁殖 b.消除病原菌 3）消除病原菌的方法又是什么？ a.熱處理：熱水或熱空氣。 b.莖尖培養(yǎng)。 c.愈傷組織培養(yǎng)。莖尖及愈傷組織培養(yǎng)1.母體植株的選擇和預(yù)處理母體的選擇欲脫毒材料的品種典型性外植體健康程度選擇2. 莖尖分生組織培養(yǎng)再生植株基本過程

41、：外植體消毒莖尖剝離莖尖培養(yǎng)3. 脫毒效果檢測 指示植物鑒定（test plants) 所謂指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的?；园Y狀的寄主植物。 血清鑒定(serologic test) 試管沉淀反應(yīng)；免疫雙擴(kuò)散；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。四、人工種子制作過程第三節(jié)植物細(xì)胞突變體的篩選及應(yīng)用用組織培養(yǎng)進(jìn)行突變研究的意義可以在比田間試驗小得多的空間和較短的時間內(nèi)，用人工控制的環(huán)境對單倍體、二倍體和多倍體細(xì)胞進(jìn)行大量的基因組操縱，在植株水平回收所發(fā)生的遺傳修飾。 細(xì)胞水平上選擇出的變異不一定在再生植株水平上表達(dá)。體細(xì)胞無性系變異：未受過選擇壓力之組織培養(yǎng)物，其再生植株出現(xiàn)遺傳變異 誘變突

42、變分類：自發(fā)突變和誘發(fā)突變 繼代過程中會發(fā)生染色體的變異。 自發(fā)突變的頻率低，一般在100萬次細(xì)胞分裂中才發(fā)生一次。 誘發(fā)突變利用誘變劑：甲基磺酸乙酯（EMS）、N甲基N硝基N亞硝基胍（MNNG）、紫外線、X射線等，可以增加活細(xì)胞中的變異型。 注意：化學(xué)誘變劑一般有毒且致癌。 誘變材料多用原生質(zhì)體和胚。變異體的分離和鑒定突變體的步驟1）分離營養(yǎng)缺陷型或溫度敏感變異體 負(fù)選擇法：即在特定的培養(yǎng)條件下，選擇出其生長受限制的那些細(xì)胞 全數(shù)分離法：花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株原生質(zhì)體分、培養(yǎng)和誘變用全數(shù)分離法分離一個個單個的集落并試驗負(fù)選擇鑒定變異系的專一性和重現(xiàn)性鑒定變異系的穩(wěn)定性再生植株作遺傳學(xué)分析。

43、2）分離抗性變異體和鑒定突變體的一般步驟 直接選擇法：即把細(xì)胞置于有毒的化合物（選擇劑）協(xié)迫下，敏感的細(xì)胞不能生長而抗性細(xì)胞能夠生長從而分離出來。 篩選出的變體異品種1.營養(yǎng)缺陷型：需泛酸、腺嘌呤、異亮氨酸等 2.抗氯酸鹽 3.抗氨基酸或氨基酸類似物 4.抗抗菌素藥物：如抗鏈霉素的煙草突變體 5.抗除草劑：如一種煙草的變異體 6.抗病的：如玉米，馬鈴薯的變異體 另外：還有抗核酸堿基類似物的煙草突變植物，耐熱，耐旱，抗重金屬離子，溫度敏感的變異體等。突變細(xì)胞系的意義1）可作為遺傳學(xué)和遺傳工程研究的好材料 如：為遺傳研究提供適用的選擇標(biāo)志，分析控制性狀的突變基因，識別特點基因，定向誘變等 2）了解

44、代謝和發(fā)育過程及其調(diào)節(jié) 3）利用有益突變，獲得實用價值的新類型作業(yè)1、什么是細(xì)胞全能性、脫分化、再分化、器官發(fā)生、極性和體細(xì)胞胚？2、什么是組織培養(yǎng)？組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基主要成分是什么？3、如何制備培養(yǎng)基？常用培養(yǎng)基有哪些？4、組織培養(yǎng)的一般方法是什么？5、什么是原生質(zhì)體？原生質(zhì)體如何分離的？6、如何進(jìn)行植物植株的脫毒？7、什么是人工種子？第四章植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生產(chǎn)物生產(chǎn)教學(xué)目的與要求：深入了解植物細(xì)胞在離體條件下的生長特性，掌握植物細(xì)胞懸浮系的建立以及種細(xì)胞的篩選方法。理解培養(yǎng)細(xì)胞次生代謝特性及其調(diào)節(jié)方法。教學(xué)重點：植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)、植物細(xì)胞的規(guī)模培養(yǎng)和植物細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的要點及操作規(guī)程

45、。教學(xué)難點：培養(yǎng)細(xì)胞的次生代謝及產(chǎn)物積累。第一節(jié)、懸浮培養(yǎng)(suspension culture)一、懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)是指將單個游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。1起始培養(yǎng)物的建立l 選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。l 選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度；必要的附加物質(zhì)。l 愈傷組織的要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)2懸浮系的建立3懸浮細(xì)胞的生長與增殖懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個優(yōu)點：一是增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)；二是在振蕩條件下可避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對細(xì)胞自身產(chǎn)生毒害；三是振蕩培養(yǎng)可以適當(dāng)改善氣體的交換。影響懸浮細(xì)

46、胞生長的因素：l 起始愈傷組織的質(zhì)量l 接種細(xì)胞密度l 培養(yǎng)條件：方式、溫度、l 繼代周期一個成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件：l 懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在3050個細(xì)胞以下，在實際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。l 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。l 細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般23天甚至更短時間便可增加一倍。第三節(jié)、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)一、概述植物次生代謝產(chǎn)物是指植物中一大類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化和物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和

47、生長發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝。1 植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型植物次生產(chǎn)物種類繁多（據(jù)保守估計已超過2萬種），根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同大致分為：酚類化合物黃酮類單酚類醌 類（苯醌、萘醌、蒽醌）萜類化合物三萜皂甙甾體皂甙單萜、倍半萜、二萜含氮化合物生物堿（真生物堿、偽生物堿、原生物堿）胺類（伯、仲、叔、季胺）非蛋白質(zhì)氨基酸生氰甙多炔類、有機(jī)酸等2植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。李時珍（1593）在本草綱目中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25的法定藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑

48、和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，可以用于殺蟲、殺菌，而對環(huán)境和人畜無害，是理想的環(huán)保產(chǎn)品。3規(guī)?；?xì)胞培養(yǎng)是生產(chǎn)植物次生產(chǎn)物的理想途徑l 保護(hù)生態(tài)環(huán)境l 提高生產(chǎn)效率l 發(fā)展新型生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求：從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物細(xì)胞生長和生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)；從培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下三個條件：培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物；細(xì)胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物；代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。二、培養(yǎng)系統(tǒng)1、懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)液體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)基本

49、原理與上述實驗室懸浮培養(yǎng)方法一致，但大規(guī)模培養(yǎng)所采用的設(shè)備及控制技術(shù)比實驗室小規(guī)模培養(yǎng)要復(fù)雜的多。l 機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器通常是在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計的，根據(jù)植物細(xì)胞的特性，其設(shè)備要求在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上作如下改進(jìn)：攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式；因為植物細(xì)胞生長周期長，需要隨時補(bǔ)充水分和營養(yǎng)，因此必須設(shè)計加液裝置；由于植物細(xì)胞的生理活動需要新鮮空氣，且細(xì)胞代謝也可能產(chǎn)生有害氣體，所以必須設(shè)計通氣裝置； 為便于取樣觀察，一般還設(shè)計有取樣口。l 氣壓攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)考慮到機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用難以避免，同時攪拌器轉(zhuǎn)動的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此

50、，發(fā)展出空氣提升式生物反應(yīng)器，但其缺點是攪拌不均勻。l 旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)一般用于產(chǎn)品中試或某些必需裂解細(xì)胞才能獲得目的產(chǎn)物的培養(yǎng)，其優(yōu)點是控制精確，處理靈活，缺點是培養(yǎng)體積較小。2、固定化培養(yǎng)系統(tǒng)這一技術(shù)的優(yōu)點在于：l 可以較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而可以研究特定的代謝途徑，并便于調(diào)節(jié)；l 細(xì)胞位置的固定使其所處的環(huán)境類似于在植物體中所處的狀態(tài)，相互間接觸密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生產(chǎn)物的合成；l 由于細(xì)胞固定在支持物上，培養(yǎng)基可以不斷更換，可以從培養(yǎng)基中提取產(chǎn)物，免除了培養(yǎng)基中因含有過多的初生產(chǎn)物對細(xì)胞代謝的反饋抑制，也由于細(xì)胞留在反應(yīng)器中，新的培養(yǎng)基可以再次利用這些細(xì)胞生

51、產(chǎn)初生產(chǎn)物，從而節(jié)省了生產(chǎn)細(xì)胞所付出的時間和費(fèi)用；l 正是由于細(xì)胞固定在一定的介質(zhì)中，并可以從培養(yǎng)基中不斷提取產(chǎn)物，因此，它可以進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。細(xì)胞固定化培養(yǎng)技術(shù)按照其支持物不同可以分為兩大類：l 包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺等；l 附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。三、植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)要點1、細(xì)胞系的建立和選擇2、優(yōu)良細(xì)胞系的增殖培養(yǎng)3、大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立培養(yǎng)方式的選擇：l 間歇培養(yǎng)流加間歇培養(yǎng)兩級或多級間歇培養(yǎng)l 連續(xù)培養(yǎng)單級連續(xù)培養(yǎng)多級連續(xù)培養(yǎng)回流式連續(xù)培養(yǎng)l 固定化細(xì)胞培養(yǎng)四、影響植物細(xì)胞培養(yǎng)及次生產(chǎn)物合成的因

52、素1植物細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成的關(guān)系l 生長偶聯(lián)型 產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長成正比。l 中間型 產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長下降時合成，細(xì)胞處于指數(shù)生長期或停止生長產(chǎn)物都不合成。l 非生長偶聯(lián)型 產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長停止以后。2影響因素l 內(nèi)因 細(xì)胞的遺傳特性母細(xì)胞外植體的生理狀態(tài)l 外因 溫度pH營養(yǎng)狀況通氣狀況生長調(diào)節(jié)因子：激素、前體物質(zhì)第三節(jié)、單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一、細(xì)胞平板培養(yǎng)主要技術(shù)要點是：l 單細(xì)胞的分離；l 單細(xì)胞懸浮液的制備；l 植板l 植板率評估：這是平板培養(yǎng)中常用的一個術(shù)語，用來反應(yīng)植板效率的高低。它以能長出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比例來表示。植板率()(形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)/接種的細(xì)胞數(shù))

53、5;100二、看護(hù)培養(yǎng)三、微室培養(yǎng)思考題1一個好的懸浮細(xì)胞系有哪些特征？用于建立懸浮細(xì)胞系的愈傷組織有何要求？2建立懸浮細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)有哪些？3懸浮細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)中其群體生長規(guī)律。4細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)？5植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)與次生產(chǎn)物生產(chǎn)前景及需要研究解決的問題。第五章動物細(xì)胞組織培養(yǎng)教學(xué)目的與要求了解動物細(xì)胞特性及其培養(yǎng)特點，掌握設(shè)備、試劑及培養(yǎng)基的選擇和配制技術(shù)以及培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定和污染檢驗方法；掌握動物細(xì)胞凍存和復(fù)蘇技術(shù)教學(xué)重點：動物細(xì)胞的特性、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以及動物細(xì)胞凍存和復(fù)蘇。教學(xué)難點：動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以及動物細(xì)胞凍存和復(fù)蘇。第一節(jié)動物細(xì)胞特性一、動物細(xì)胞與植物細(xì)胞的比較

54、動物細(xì)胞的表面由質(zhì)膜被著，質(zhì)膜控制著細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的運(yùn)輸，質(zhì)膜與細(xì)胞內(nèi)部的膜系統(tǒng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和核膜等都相聯(lián)。植物細(xì)胞有細(xì)胞壁，而細(xì)胞之間有一層膠狀物即胞間層（middle lamella）將兩個細(xì)胞粘合在一起，在兩個相鄰細(xì)胞之間有胞間連絲（plasmadesma）使細(xì)胞間相互聯(lián)通。二、體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化 在活體內(nèi)，動物細(xì)胞在胚胎期即已高度分化，而且這種分化是不可逆轉(zhuǎn)的。一經(jīng)分化的動物細(xì)胞在功能上具有明確的分工，同時也具有明顯的形態(tài)特征?；铙w內(nèi)的細(xì)胞可以分為以下三大類：第一類是能保持繼續(xù)分裂能力的細(xì)胞，可以繼續(xù)不斷地分裂，如骨髓干細(xì)胞、各類前體細(xì)胞；第二類細(xì)胞是永久失去分裂能力的細(xì)胞，

55、如各類高度特化的細(xì)胞；第三類是靜止細(xì)胞群，即所謂的G0細(xì)胞，在正常情況下，它們不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，則重新進(jìn)入細(xì)胞分裂。如人的肝臟細(xì)胞等。第一類和第三類細(xì)胞在適當(dāng)條件下可進(jìn)行離體培養(yǎng)1、差異：細(xì)胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開始發(fā)生了。2、分化體外培養(yǎng)的細(xì)胞分化能力并未完全喪失，只是環(huán)境的改變，細(xì)胞分化的表現(xiàn)和在體內(nèi)不同。細(xì)胞是否表現(xiàn)分化,關(guān)鍵在于是否存在使細(xì)胞分化的條件。如Fr