高效液相色譜法測(cè)定生物樣本中頭孢噻肟和舒巴坦的濃度(1)

1、    高效液相色譜法測(cè)定生物樣本中頭孢噻肟和舒巴坦的濃度(1)    】 目的：為靜滴注射用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉后在血漿和尿液中的藥物濃度分析提供檢測(cè)方法. 方法：采用HPLC測(cè)定頭孢噻肟鈉血漿和尿液中濃度. 在血樣中加入甲醇沉淀蛋白后，尿樣用超純水稀釋后取上清液進(jìn)樣，色譜分析條件: 以C18反相柱作分析柱；柱溫：室溫；流速： 1 mL/min；頭孢噻肟和舒巴坦的流動(dòng)相分別為：1g/L的三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)pH值6.2）甲醇6832和8416；頭孢噻肟和舒巴坦的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)分別為254 nm和220 nm. 結(jié)果

2、：頭孢噻肟血樣和尿樣的線性范圍分別為5.3530.0 mg/L和5.45545.00 mg/L，最低檢測(cè)濃度分別為1.00 mg/L和0.25 mg/L；舒巴坦血樣和尿樣的線性范圍為1.04208.00 mg/L，最低檢出濃度分別為0.5 mg/L和0.25 mg/L；方法平均提取回收率在 (89110)%之間；日內(nèi)、日間RSD均小于5%. 頭孢噻肟和舒巴坦血漿和尿液樣品置于-20冰箱3 d內(nèi)穩(wěn)定. 結(jié)論：本方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn),適合于頭孢噻肟和舒巴坦血漿和尿液濃度測(cè)定.【關(guān)鍵詞】 頭孢噻肟；舒巴克坦；色譜法，高壓液相；血漿；尿0引言由湘北威爾曼制藥有限公司開(kāi)發(fā)研制的一類復(fù)方新

3、藥注射用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉已經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進(jìn)行期臨床試驗(yàn)（臨床研究批件號(hào)：2005L00727）. 頭孢噻肟鈉屬第三代半合成頭孢菌素類，其抗菌譜廣，對(duì)革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌、需氧菌和某些厭氧菌均有較好的抗菌活性，特別對(duì)革蘭陰性菌的殺滅作用更強(qiáng). 隨著頭孢噻肟在臨床的廣泛使用，許多臨床病原菌通過(guò)產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶對(duì)頭孢噻肟產(chǎn)生耐藥性而導(dǎo)致臨床治療方案的失敗1-2. 舒巴坦為半合成內(nèi)酰胺酶抑制劑,與頭孢噻肟合用時(shí)出現(xiàn)協(xié)同作用，使對(duì)頭孢噻肟耐藥的細(xì)菌的最低抑菌濃度下降到敏感范圍之內(nèi). 為了評(píng)價(jià)靜滴注射用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉后該藥品在健康志愿受試者的耐受性以及藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，我們采用高效液相色譜

4、法測(cè)定了生物樣本中頭孢噻肟和舒巴坦的濃度.1材料和方法1.1材料Beckman公司System gold高效液相色譜儀（125型二元梯度泵，7725i手動(dòng)進(jìn)樣器，20 L定量環(huán)，168型紫外檢測(cè)器，32 Karat TM Software）. 頭孢噻肟、舒巴坦對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），甲醇為色譜純（迪馬公司），水為自制超純水，其余試劑均為分析純.1.2方法1.2.1色譜條件色譜柱： 迪馬公司 Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm, 5 m）；柱溫： 室溫；流速： 1 mL/min；進(jìn)樣量： 20 L. 頭孢噻肟流動(dòng)相： 1 g/L的三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)pH

5、值6.2）甲醇6832；頭孢噻肟紫外檢測(cè)波長(zhǎng)： 254 nm. 舒巴坦流動(dòng)相： 1 g/L的三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)pH至6.2）甲醇=8416；舒巴坦紫外檢測(cè)波長(zhǎng)： 220 nm.1.2.2樣品處理血樣處理： 精密量取血漿0.2 mL，置1.5 mL尖底離心管中，加入甲醇0.5 mL，漩渦混合0.5 min，離心（4200 g）20 min，取上清液20 L進(jìn)樣. 尿樣處理： 將尿液用水稀釋10200倍后，漩渦混合0.5 min，用0.45 m微孔濾膜濾過(guò)，取20 L進(jìn)樣.2結(jié)果2.1色譜圖頭孢噻肟對(duì)照品溶液、空白血漿、健康受試者給藥后的血漿樣品的色譜(圖1)，空白尿液、給藥后的尿液樣品的色譜

6、(圖2)，其中頭孢噻肟保留時(shí)間約為5.8 min；舒巴坦對(duì)照品溶液、空白血漿、健康受試者給藥后的血漿樣品的色譜(圖3)，空白尿液、給藥后的尿液樣品的色譜(圖4)，其中舒巴坦保留時(shí)間約為4.5 min. 結(jié)果表明，空白血漿、空白尿液中雜質(zhì)不干擾測(cè)定.圖1頭孢噻肟(1)對(duì)照品溶液（A）,空白血漿（B）,健康受試者給藥6 h后的血漿樣品（C）的色譜圖（略）圖2頭孢噻肟(1)空白尿液樣品（A）,健康受試者給藥4 h后的尿液樣品（B）的色譜圖（略）圖3舒巴坦(1)對(duì)照品溶液（A）,空白血漿（B）,健康受試者給藥2 h后的血漿樣品（C）的色譜圖（略）圖4舒巴坦(1)空白尿液樣品（A）,健康受試者給藥2 h

7、后的尿液樣品（B）的色譜圖（略）2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線2.2.1頭孢噻肟標(biāo)準(zhǔn)曲線方程取空白血漿0.2 mL，加入適量對(duì)照品溶液，使血漿中頭孢噻肟濃度依次分別為5.3, 10.6, 53, 106, 212, 318, 424和530 mg/L，按照血漿樣品制備方法制備，在上述色譜條件下，進(jìn)樣20 L，測(cè)定對(duì)照品峰面積. 以色譜峰面積（A）對(duì)頭孢噻肟濃度C（mg/L）作加權(quán)線性回歸(權(quán)重為1/C2)，求得線性方程為A=8770.487C 10391.277, R2=0.9994. 線性范圍為5.3530.0 mg/L（n=8）. 血漿中頭孢噻肟的最低檢出濃度（按信噪比3計(jì)）為1 mg/L. 尿樣中頭孢噻

8、肟色譜峰面積（A）對(duì)濃度C（mg/L）作加權(quán)線性回歸(權(quán)重為1/C2)，求得線性方程為A=37055.42C 78893.03, R2=0.9998. 線性范圍為5.45545 mg/L（n=8），尿樣中頭孢噻肟的最低檢出濃度（按信噪比3計(jì)）為0.25 mg/L.            作者：顧宜，王曉娟，王榮，白娟娟，高蘇莉【關(guān)鍵詞】頭孢噻肟；舒巴克坦；色譜法,高壓液相；血漿；尿【Abstract】 AIM:     

9、60;   本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。2.2.2舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)曲線方程取空白血漿0.2 mL，加入適量舒巴坦對(duì)照品溶液，使血漿中舒巴坦?jié)舛纫来畏謩e為1.04, 2.08, 5.20, 10.4, 52, 104和208 mg/L，按照血漿樣品制備方法制備，在上色譜條件下，進(jìn)樣20 L，測(cè)定對(duì)照品峰面積. 以色譜峰面積（A）對(duì)舒巴坦?jié)舛菴（mg/L）作加權(quán)線性回歸(權(quán)重為1/C2，圖4)，求得線性方程為A=1681.319

10、C 779.655, R2=0.9996. 線性范圍為1.04208 mg/L（n=7）. 血漿中舒巴坦的最低檢出濃度（按信噪比3計(jì)）為0.5 mg/L. 以尿樣中舒巴坦色譜峰面積（A）對(duì)濃度C（mg/L）作加權(quán)線性回歸(權(quán)重為1/C2)，求得線性方程為A=5415.424C 1753.765, R2=0.9994，線性范圍為1.04208 mg/L（n=7）. 尿樣中舒巴坦的最低檢出濃度（按信噪比3計(jì)）為0.25 mg/L.2.3提取回收率分別用甲醇配制頭孢噻肟對(duì)照品溶液和舒巴坦對(duì)照品溶液，同時(shí)制備相同濃度的血樣和尿樣并依法處理，分別進(jìn)樣分析，以血樣和尿樣中藥物峰面積與對(duì)照品峰面積比值計(jì)算提

11、取回收率(表1).表1血樣和尿樣中頭孢噻肟和舒巴坦提取回收率（略）2.4方法精密度2.4.1頭孢噻肟方法精密度取空白血漿加入適量頭孢噻肟對(duì)照品，配制成低、中、高濃度分別為10, 100和400 mg/L血漿樣品，在1 d內(nèi)按樣品測(cè)定法重復(fù)測(cè)定6次，求得日內(nèi)RSD分別為2.74%, 2.21%和3.40%. 將上述3個(gè)濃度的樣品在3 d內(nèi)連續(xù)各重復(fù)測(cè)定6次，求得日間RSD分別為3.13%, 2.85%和3.85%.    2.4.2尿液中頭孢噻肟方法精密度取空白尿液加入適量頭孢噻肟對(duì)照品，配制成低、中、高濃度分別為10, 100和400 mg/L尿液樣品，

12、在1 d內(nèi)按樣品測(cè)定法重復(fù)測(cè)定6次，求得日內(nèi)RSD分別為1.52%, 1.30%和1.14%. 將上述3個(gè)濃度的樣品在3d內(nèi)連續(xù)各重復(fù)測(cè)定6次，求得日間RSD分別為1.44%, 1.78%和1.30%.2.4.3血漿中舒巴坦方法精密度取空白血漿加入適量舒巴坦對(duì)照品，配制成低、中、高濃度分別為2.08, 10.4和104 mg/L血漿樣品，在1 d內(nèi)按樣品測(cè)定法重復(fù)測(cè)定6次，求得日內(nèi)RSD分別為3.59%, 2.43%和1.75%. 將上述3個(gè)濃度的樣品在3d內(nèi)連續(xù)各重復(fù)測(cè)定6次，求得日間RSD分別為3.20%, 2.80%和2.06%.2.4.4尿液中舒巴坦方法精密度取空白尿液加入適量舒巴坦對(duì)

13、照品，配制成低、中、高濃度分別為2.08, 10.4和104 mg/L尿液樣品，在1 d內(nèi)按樣品測(cè)定法重復(fù)測(cè)定6次，求得日內(nèi)RSD分別為1.46%, 1.09%和0.48%. 將上述3個(gè)濃度的樣品在3 d內(nèi)連續(xù)各重復(fù)測(cè)定6次，求得日間RSD分別為1.63%, 1.37%和1.06%.2.5樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 2.5.1頭孢噻肟血漿和尿液樣品-20放置穩(wěn)定性試驗(yàn)將低、中、高（10.6, 106和424 mg/L）3個(gè)濃度的頭孢噻肟血漿樣品和尿液樣品分別置于-20冰箱內(nèi)1, 2, 3 d；另將低、中、高（10.9, 109和436 mg/L）3個(gè)濃度的頭孢噻肟尿液樣品同法放置，按前述方法測(cè)定頭孢噻肟濃

14、度變化，血漿中RSD分別為2.51%, 1.46%和2.41%，尿液中RSD分別為0.52%, 2.39%和1.70%. 表明頭孢噻肟血漿和尿液樣品置于-20冰箱3 d內(nèi)穩(wěn)定.2.5.2舒巴坦血漿和尿液樣品-20放置穩(wěn)定性試驗(yàn)將低、中、高（2.08, 10.4和104 mg/L）3個(gè)濃度的舒巴坦血漿樣品和尿液樣品分別置于-20冰箱內(nèi)1, 2, 3d；另將低、中、高（2.08, 10.4和104 mg/L）3個(gè)濃度的舒巴坦尿液樣品同法放置，按前述方法測(cè)定舒巴坦?jié)舛茸兓?，血漿中RSD分別為10.33%, 4.73%和8.80%，尿液中RSD分別為0.67%, 0.66%和0.76%. 表明舒巴坦血

15、漿和尿液樣品置于-20冰箱3 d內(nèi)穩(wěn)定.3討論我們采用HPLC法測(cè)定生物樣本中頭孢噻肟和舒巴坦?jié)舛?同文獻(xiàn)報(bào)道的紫外法3、微生物法4-5和HPLC法6-7相比較,樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單,測(cè)定時(shí)間短,方法準(zhǔn)確精密,穩(wěn)定性高,適合藥代動(dòng)力學(xué)和臨床藥物濃度監(jiān)測(cè)應(yīng)用.血樣處理方法可采用三氯醋酸、高氯酸做蛋白沉淀劑，蛋白沉淀完全，但酸性強(qiáng)，頭孢噻肟和舒巴坦分子中含有酯基、酰胺基等結(jié)構(gòu),溶液中的酸能催化這些基團(tuán)的水解，經(jīng)試用這些方法樣品中頭孢噻肟和舒巴坦均表現(xiàn)不穩(wěn)定，含量大幅降低. 采用甲醇直接沉淀蛋白, 沉淀離心后直接取上清液測(cè)定,使樣品處理步驟大大簡(jiǎn)化,效果良好，回收率高.流動(dòng)相未采用易形成結(jié)晶的緩沖鹽溶液和

16、價(jià)格較貴的離子對(duì)試劑，而選用甲醇1 g/L三乙胺水溶液的流動(dòng)相體系,所用試劑價(jià)廉低毒, 加入1 g/L三乙胺的目的是掩蓋固定相表面游離硅醇基的活性，減少了頭孢噻肟和舒巴坦的化學(xué)結(jié)構(gòu)中酰胺基團(tuán)與固定相表面游離的硅醇基發(fā)生的相互作用，頭孢噻肟和舒巴坦的色譜峰形均較好. 經(jīng)試驗(yàn)甲醇與1 g/L三乙胺水溶液比例分別為6832及8416時(shí)，頭孢噻肟和舒巴坦的保留時(shí)間分別為5.8 min和4.5 min，保留時(shí)間長(zhǎng)短適宜于生物樣本的大規(guī)模分析的需.流動(dòng)相中水相的pH值在47范圍內(nèi)時(shí),舒巴坦保留時(shí)間變化不大,而頭孢噻肟保留時(shí)間則隨pH升高而延長(zhǎng),在pH6.2左右時(shí)各峰保留時(shí)間合適,且峰型較好,無(wú)明顯拖尾,故

17、以pH6.2±0.1作為水相的pH值,實(shí)際效果理想.紫外掃描測(cè)得頭孢噻肟的最大吸收波長(zhǎng)為240 nm, 但254 nm處吸收也較高,并且254 nm處干擾更少，故選254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng). 舒巴坦最大吸收波長(zhǎng)為210 nm，但系末端吸收，干擾較大，選擇220 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)較適宜.【參考文獻(xiàn)】1 耿燕，張王剛，王香玲，等. 泌尿系感染產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌的耐藥表型和基因分型J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,26(7):622-624.2 彭道榮，楊愛(ài)龍，徐修禮，等. 腸桿菌科細(xì)菌中超廣譜內(nèi)酰胺酶的攜帶率及其耐藥性的變遷J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002,23(3):

18、254-257.3 Dutta BP, Debnath SC, Mandal TK, Chakraborty AK. Modification of pharmacokinetics of cefotaxime in uranyl nitrateinduced renal damage in black bengal goatsJ. J Vet Sci,2004,5(1):1-3.4 Casal J, Aguilar L, Jado I, et al. Effects of Specific Antibodies against Streptococcus pneumoniae on Pharmacodynamic Parameters of Lactams in a Mouse Sepsis ModelJ. Antimicrob Agents Chemother, 2002,46（5）:1340-1344.5 RodriguezHernandez MJ, Cuberos L