親和層析法純化胰蛋白酶ppt課件

1、親和層析法純化胰蛋白酶親和層析法純化胰蛋白酶第一部分第一部分實驗內(nèi)容簡介實驗內(nèi)容簡介 1 內(nèi)容摘要 親和層析包括了一整套復(fù)雜的底物及其配體與生物大分子之間相互作用時所形成的獨(dú)特的生物學(xué)特性。在親和結(jié)合的過程中涉及到疏水力、靜電力、范德華力及空間阻力等因素的影響。 親和層析的概念可以理解為配基以共價鍵的形式與水不溶性固體載體共價結(jié)合， 形成具有高度專一性的親和吸附劑。以該介質(zhì)為填料填充親和層析柱，從復(fù)雜的混合物中有針對性分離某一種成分。 本實驗以親和層析方法分離純化豬胰蛋白酶為目的，從豬胰臟提取液中分離純化胰蛋白酶，最終得到純度較高的胰蛋白酶。圍繞親和層析實驗所涉及的蛋白質(zhì)和酶基本性質(zhì)及相關(guān)技術(shù)

2、進(jìn)行綜合訓(xùn)練。其中主要包括親和層析介質(zhì)配基的制備，親和介質(zhì)的合成，蛋白質(zhì)和酶的分離純化，酶活性的測定等內(nèi)容。 通過綜合訓(xùn)練，能夠系統(tǒng)掌握蛋白質(zhì)制備的基本原理和操作，學(xué)習(xí)如何進(jìn)行實驗設(shè)計，掌握實驗過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對實驗中出現(xiàn)的問題進(jìn)行科學(xué)的分析。使學(xué)生在學(xué)習(xí)實驗技術(shù)的同時，自覺培養(yǎng)分析問題和解決問題能力。2實驗?zāi)康姆椒▽嶒災(zāi)康姆椒ㄕ莆盏鞍踪|(zhì)分離純化的基本原理與操作技術(shù)掌握蛋白質(zhì)分離純化的基本原理與操作技術(shù)掌握親和層析的基本原理及親和介質(zhì)合成技術(shù)掌握親和層析的基本原理及親和介質(zhì)合成技術(shù)掌握胰蛋白酶活性及抑制活性測定的原理和方法掌握胰蛋白酶活性及抑制活性測定的原理和方法掌握消光系數(shù)法測定蛋白質(zhì)的原

3、理及計算方法掌握消光系數(shù)法測定蛋白質(zhì)的原理及計算方法1.3實驗流程實驗流程雞蛋清雞蛋清Spharose4B豬胰臟豬胰臟提取提取活化活化提取提取分離純化分離純化純卵粘蛋白純卵粘蛋白(CHOM)活化活化Spharose4B胰蛋白酶原粗提液胰蛋白酶原粗提液偶聯(lián)偶聯(lián)激活激活CHOM-Spharose4B胰蛋白酶提取液胰蛋白酶提取液親和層析親和層析酶促動力學(xué)酶促動力學(xué)純胰蛋白酶純胰蛋白酶酶活性測定酶活性測定酶蛋白含量測定酶蛋白含量測定1.4要求掌握的技術(shù)要求掌握的技術(shù)柱層析技術(shù)柱層析技術(shù)SephadexG-25分子篩層析分子篩層析DEAE-Cellulose離子交換層析離子交換層析CHOMSepharo

4、se4B親和層析親和層析蛋白質(zhì)提取技術(shù)蛋白質(zhì)提取技術(shù)10%TCA提取雞卵粘蛋白提取雞卵粘蛋白3.5%乙酸乙酸,pH3.0提取胰蛋白酶原提取胰蛋白酶原蛋白含量測定技術(shù)蛋白含量測定技術(shù)消光系數(shù)法測定胰蛋白酶含量消光系數(shù)法測定胰蛋白酶含量消光系數(shù)法測定雞卵粘蛋白含量消光系數(shù)法測定雞卵粘蛋白含量生物活性測定生物活性測定胰蛋白酶比活性測定胰蛋白酶比活性測定雞卵粘蛋白抑制活性測定雞卵粘蛋白抑制活性測定親和介質(zhì)合成技術(shù)親和介質(zhì)合成技術(shù)載體載體-Sepharose4B的前處理的前處理載體載體-Sepharose4B的活化的活化活化載體活化載體-Sepharose4B的偶聯(lián)的偶聯(lián)第二部分第二部分實驗方法實驗方法

5、實驗一實驗一雞卵粘蛋白的分離純化雞卵粘蛋白的分離純化1雞卵粘蛋白的基本性質(zhì)雞卵粘蛋白的基本性質(zhì)1.1雞卵粘蛋白的組成雞卵粘蛋白的組成分子量分子量:28000Da分子組成分子組成:四個分子量相近的亞基組成糖蛋白四個分子量相近的亞基組成糖蛋白糖基部分糖基部分:D-甘露糖甘露糖,D-半乳糖半乳糖,葡萄糖胺葡萄糖胺,唾液酸唾液酸1.2化學(xué)穩(wěn)定性化學(xué)穩(wěn)定性耐熱耐熱:在在80條件下條件下,理化性質(zhì)不發(fā)生改變理化性質(zhì)不發(fā)生改變耐有機(jī)溶劑耐有機(jī)溶劑:在在50%的丙酮溶液中的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度能保持良好的溶解度耐沉淀劑耐沉淀劑:在在10%的的TCA的溶液中不發(fā)生沉淀的溶液中不發(fā)生沉淀.1.3等電點(diǎn)性

6、質(zhì)等電點(diǎn)性質(zhì)等電點(diǎn)等電點(diǎn):pI在在3.9-4.5之間之間溶液中的狀態(tài)溶液中的狀態(tài):在在pH3.0的溶液中穩(wěn)定的溶液中穩(wěn)定,在在pH8.0的溶液中的溶液中容易分解容易分解雞卵粘蛋白在雞卵粘蛋白在10%的的TCA不同不同pH值的溶液中的溶解狀態(tài)值的溶液中的溶解狀態(tài)見表見表1。表1，雞卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解度 溶液pH 值 雞卵粘蛋白 雞卵清蛋白 等于3.5沉淀5%溶解95%沉淀95%溶解5%低于3.5沉淀溶解沉淀溶解高于3.5沉淀溶解沉淀溶解 1.2.雞卵粘蛋白的提取雞卵粘蛋白的提取2.1提?。禾崛。好拷M發(fā)給每組發(fā)給50毫升的雞卵清加入一定體積的毫升的雞卵清加入一定體積的10%pH1.

7、15TCA溶液溶液(輕輕攪拌一邊攪拌一邊加入輕輕攪拌一邊攪拌一邊加入),攪勻后用攪勻后用pH試紙試紙檢查檢查pH值值,待待pH穩(wěn)定在穩(wěn)定在3.50.2后放置后放置4冰箱過夜冰箱過夜.2.2離心：離心：轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移50毫升離心杯中毫升離心杯中,于于3000rpm離心離心15min。2.3過濾：過濾：傾出上清液，濾紙過濾，濾去上浮脂類物質(zhì)和不溶物傾出上清液，濾紙過濾，濾去上浮脂類物質(zhì)和不溶物2.4調(diào)調(diào)pH值：值：用用1mol/LHCl將溶液精確調(diào)至將溶液精確調(diào)至pH3.5。量取體積。量取體積。2.5丙酮沉淀：緩緩加入三倍體積預(yù)冷的丙酮，攪勻，用丙酮沉淀：緩緩加入三倍體積預(yù)冷的丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴(yán)

8、，放置冰箱內(nèi)靜止塑料薄膜封嚴(yán)，放置冰箱內(nèi)靜止4小時。小時。2.6離心：虹吸出部分上清，將沉淀部分轉(zhuǎn)移到離心：虹吸出部分上清，將沉淀部分轉(zhuǎn)移到50ml離心離心杯中，于杯中，于3000rpm離心離心15min。2.7除殘留丙酮：棄去上清液，將盛有沉淀的離心杯至于除殘留丙酮：棄去上清液，將盛有沉淀的離心杯至于真空干燥器中。抽去殘留丙酮。（沉淀物的顏色由白變成真空干燥器中。抽去殘留丙酮。（沉淀物的顏色由白變成透明膠狀物即可）透明膠狀物即可）2.8溶解：加入溶解：加入25ml蒸餾水或蒸餾水或20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖磷酸緩沖液溶解，濾紙過濾，收集濾液，備用。液溶解，濾紙過濾，收集濾液，備用。

9、3雞卵粘蛋白的分離純化 3.1 Sephadex G-25 柱脫鹽 (1)溶脹： 稱取15g Sephadex G-25放入500ml的燒杯中, 加入200ml 蒸餾水，在室溫下溶脹24小時或在沸水浴中溶脹2小時。 (2)裝柱： 取一支303cm 的層析柱，將溶脹好的Sephadex G-25裝柱，自然沉降。 (3) 處置： 用2倍柱床體積的0.5mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍體積的蒸餾水洗去殘留的NaCl。 (4)平衡： 用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，流速控制在1.0-1.5 ml/min。紫外檢測儀檢測柱內(nèi)平衡狀態(tài)，直到儀器繪出穩(wěn)定的基線。 (5)上樣： 將柱內(nèi)的緩沖

10、液液面流至于膠面相切，取20ml雞卵粘蛋白提取液上樣，待樣液液面流至于膠面相切，加入2-3ml緩沖液沖洗層析柱內(nèi)壁，待溶液液面流至于膠面相切，然后加入緩沖液距膠面高度約2-3cm，以同樣的流速洗脫。 (6)搜集： 在檢測儀上觀察到開始出現(xiàn)峰時進(jìn)行收集。見圖1 圖1 Sephadex G-25分子篩層析分離圖譜3.2Cellulose離子交換柱層析分離離子交換柱層析分離(1)溶脹：溶脹：稱取稱取20gDEAE-Cellulose放入放入500ml的燒杯中的燒杯中,加入加入150ml蒸餾水，在室溫下溶脹蒸餾水，在室溫下溶脹24小時。小時。(2)裝柱：裝柱：取一支取一支203cm的層析柱，將溶脹好的

11、的層析柱，將溶脹好的DEAE-Cellulose裝柱，自然沉降。裝柱，自然沉降。(3)再生：再生：用用200ml0.5mol/LNaCl0.5mol/LNaOH混合溶液洗混合溶液洗柱，再用蒸餾水洗至流出液的柱，再用蒸餾水洗至流出液的pH值達(dá)到值達(dá)到pH8.0。用。用200ml0.5mol/LHCl溶液洗柱，再用蒸餾水洗至流出液的溶液洗柱，再用蒸餾水洗至流出液的pH值值達(dá)到達(dá)到pH6.0。(4)平衡：平衡：用用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，流速控制在磷酸緩沖液平衡，流速控制在1.0ml/min。紫外檢測儀檢測柱內(nèi)平衡狀態(tài)，直到儀器繪。紫外檢測儀檢測柱內(nèi)平衡狀態(tài)，直到儀器繪出穩(wěn)定的基

12、線。出穩(wěn)定的基線。(5)上樣：上樣：將經(jīng)將經(jīng)SephadexG-25柱脫鹽的卵粘蛋白溶液上樣，用柱脫鹽的卵粘蛋白溶液上樣，用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，直到儀器繪出穩(wěn)定的磷酸緩沖液平衡，直到儀器繪出穩(wěn)定的基線。流速控制在基線。流速控制在1.0ml/min左右。左右。(6)洗脫：洗脫：用用0.3mol/LNaCl-20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液。磷酸緩沖液。(7)搜集：搜集：在檢測儀上觀察到出現(xiàn)高峰時開始收集。見圖在檢測儀上觀察到出現(xiàn)高峰時開始收集。見圖2圖圖2，雞卵粘蛋白在，雞卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱的分離柱的分離3.3透析及丙酮沉淀透析及丙酮沉淀(1)

13、透析：透析：將經(jīng)將經(jīng)DEAE-Cellulose柱分離的雞卵粘蛋白轉(zhuǎn)入透析袋柱分離的雞卵粘蛋白轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)，對蒸餾水透析，隔一段時間換一次水，直到滲出液經(jīng)內(nèi)，對蒸餾水透析，隔一段時間換一次水，直到滲出液經(jīng)BaCl2溶液檢查無氯離子存在，即可。溶液檢查無氯離子存在，即可。(2)調(diào)調(diào)pH值：值：將透析好的雞卵粘蛋白溶液，用將透析好的雞卵粘蛋白溶液，用0.1mol/LHCl精確調(diào)精確調(diào)至至pH4.0最好一次調(diào)成功），量體積。最好一次調(diào)成功），量體積。(3)丙酮沉淀：丙酮沉淀：加入加入3倍體積的預(yù)冷丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴(yán)，在倍體積的預(yù)冷丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴(yán)，在冰箱內(nèi)靜止冰箱內(nèi)靜止4小時以上或

14、過夜。小時以上或過夜。(4)離心：離心：虹吸出部分上清，將沉淀部分轉(zhuǎn)移到虹吸出部分上清，將沉淀部分轉(zhuǎn)移到50ml離心杯中，離心杯中，于于3000rpm離心離心15min，收集沉淀。，收集沉淀。(5)枯燥：枯燥：將盛有雞卵粘蛋白的離心杯放入真空干燥器中干燥。將盛有雞卵粘蛋白的離心杯放入真空干燥器中干燥。(6)收集雞卵粘蛋白成品，冰箱保存。收集雞卵粘蛋白成品，冰箱保存。4活性測定活性測定(1)標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶活性測定標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶活性測定空白空白:1.5ml緩沖液緩沖液1.5ml底物混勻底物混勻.樣品樣品:1.5ml緩沖液緩沖液1.5ml底物底物胰蛋白酶胰蛋白酶10l混勻混勻,立立即測定即測定(2)自提

15、雞卵粘蛋白抑制活性測定自提雞卵粘蛋白抑制活性測定空白空白:1.5ml緩沖液緩沖液1.5ml底物混勻底物混勻.樣品樣品:1.5ml緩沖液緩沖液雞卵粘蛋白雞卵粘蛋白10l胰蛋白酶胰蛋白酶10l混混勻放置勻放置2min以上以上1.5ml底物底物,立即測定立即測定(3) 雞卵粘蛋白含量測定 取透析液0.3ml稀釋10倍, 測定 A280. 3實驗結(jié)果 (1)計算雞卵粘蛋白收率 (2)計算標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶的比活性 (3) 計算雞卵粘蛋白的抑制活性。5試劑配制試劑配制5.1公用試劑公用試劑(1)10%TCA溶液溶液,pH1.15,1500ml(50ml/組組)(2)0.05mol/L,pH8.0Tris-HC

16、l緩沖液緩沖液,(內(nèi)含內(nèi)含0.2%CaCl2)200ml(3)2mmol/LBAEE底物溶液底物溶液200ml(4)1mg/LTrypsin標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液10ml5.2自配試劑自配試劑(1)0.2mol,pH6.6,PBS緩沖液緩沖液120ml(10)(2)0.3mol/LNaCl0.02mol/L,pH6.6,PBS緩沖液緩沖液100ml(3)0.5mol/LHCl溶液溶液200ml(4)0.5mol/LNaCl0.5mol/LNaOH溶液溶液200ml(5)0.5mol/LNaCl溶液溶液250ml6時間安排時間安排 星期星期上午上午8：00-12：00）下午下午12：00-6：00）晚

17、上晚上一一講實驗，配試劑講實驗，配試劑提 取 雞 卵 粘 蛋 白 ， 裝提 取 雞 卵 粘 蛋 白 ， 裝DEAE和和G25柱，處理各柱，處理各柱柱二二離心，丙酮沉淀，平衡離心，丙酮沉淀，平衡G25柱和柱和DEAE柱，離柱，離心，去丙酮心，去丙酮上上G25柱脫鹽，收集第一柱脫鹽，收集第一峰，上峰，上DEAE柱分離，收柱分離，收集第二峰，對蒸餾水透集第二峰，對蒸餾水透析過夜。析過夜。三三換水，取樣測粘蛋白抑換水，取樣測粘蛋白抑制活性和標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶制活性和標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶活性，透析液調(diào)活性，透析液調(diào)pH4，丙酮沉淀。丙酮沉淀。繼續(xù)測定標(biāo)準(zhǔn)酶活性和繼續(xù)測定標(biāo)準(zhǔn)酶活性和抑制活性，離心，收集抑制活性，離心，

18、收集沉淀物沉淀物4枯燥?？菰?。結(jié)束實驗結(jié)束實驗 實驗二實驗二親和層析純化胰蛋白酶親和層析純化胰蛋白酶1原理原理雞卵粘蛋白雞卵粘蛋白(ovomucoid,簡稱簡稱CHOM)，是胰蛋白酶的天，是胰蛋白酶的天然抑制劑，在然抑制劑，在pH7.8-8.0的緩沖溶液中二者發(fā)生專一性的的緩沖溶液中二者發(fā)生專一性的親和作用。以雞卵粘蛋白為配基，偶聯(lián)在已經(jīng)活化的瓊脂親和作用。以雞卵粘蛋白為配基，偶聯(lián)在已經(jīng)活化的瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)糖凝膠層析介質(zhì)-Sepharose4B上，制備成雞卵粘蛋白親上，制備成雞卵粘蛋白親和層析介質(zhì)和層析介質(zhì)CHOM-Sepharose4B）。然后通過親和層）。然后通過親和層析法從胰蛋白酶粗

19、提液中分離純化胰蛋白酶。常用的載體析法從胰蛋白酶粗提液中分離純化胰蛋白酶。常用的載體活化與蛋配基偶聯(lián)的方法有環(huán)氧氯丙烷活化和溴化氰活化活化與蛋配基偶聯(lián)的方法有環(huán)氧氯丙烷活化和溴化氰活化法。反應(yīng)的基本原理如下圖所示：法。反應(yīng)的基本原理如下圖所示：1.1環(huán)氧氯丙烷活化載體與蛋白質(zhì)配基的偶聯(lián) 活化 偶聯(lián) 親和結(jié)合 洗脫洗脫 1.2溴化氰活化載體 與蛋白質(zhì)配基的偶聯(lián) 2親和介質(zhì)合成親和介質(zhì)合成2.1瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)(Sepharose4B)的活化的活化2.1.1瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)的處理瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)的處理稱取稱取10克瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)，置于克瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)，置于G-3玻璃

20、燒結(jié)漏斗內(nèi)，玻璃燒結(jié)漏斗內(nèi)，用用100ml1.0mol/LNaCl溶液抽洗少量多次），溶液抽洗少量多次），100ml蒸蒸餾水抽洗，抽干后轉(zhuǎn)移到餾水抽洗，抽干后轉(zhuǎn)移到100ml三角瓶中備用。三角瓶中備用。2.1.2配方 瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)-QT410克 蒸餾水7ml 1,4二氧六環(huán)8 ml 2 mol/L NaOH 6.5ml 環(huán)氧氯丙烷1.5ml。 2.1.3活化活化將配制的好介質(zhì)的三角瓶，放入將配制的好介質(zhì)的三角瓶，放入45恒溫水浴中，于恒溫水浴中，于160轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分鐘，振搖活化分鐘，振搖活化2小時。停止活化，轉(zhuǎn)移到小時。停止活化，轉(zhuǎn)移到G-3玻璃燒玻璃燒結(jié)漏斗內(nèi)，抽去活化劑，用結(jié)漏斗內(nèi)，抽去

21、活化劑，用100ml蒸餾水洗少量多次），蒸餾水洗少量多次），轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移100ml到三角瓶中，準(zhǔn)備偶聯(lián)。到三角瓶中，準(zhǔn)備偶聯(lián)。2.2偶聯(lián)偶聯(lián)稱取約稱取約100mg雞卵粘蛋白，用雞卵粘蛋白，用10ml0.1mol/LpH9.5Na2CO3緩沖液充分溶解。取緩沖液充分溶解。取0.1ml稀釋稀釋10倍測定倍測定OD280，計算溶液的蛋白濃度。然后將溶解好的雞卵粘蛋白溶液，計算溶液的蛋白濃度。然后將溶解好的雞卵粘蛋白溶液，轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到100ml三角瓶中與活化的瓊脂糖凝膠介質(zhì)混勻。在三角瓶中與活化的瓊脂糖凝膠介質(zhì)混勻。在40恒溫水浴中，于恒溫水浴中，于160轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分鐘，振搖偶聯(lián)分鐘，振搖偶聯(lián)22小時左右，小

22、時左右，停止偶聯(lián)。停止偶聯(lián)。2.3洗滌洗滌取一個洗凈的取一個洗凈的500ml抽濾瓶，將已經(jīng)偶聯(lián)好的瓊脂糖凝抽濾瓶，將已經(jīng)偶聯(lián)好的瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)轉(zhuǎn)移到膠層析介質(zhì)轉(zhuǎn)移到G-3玻璃燒結(jié)漏斗內(nèi)抽濾，收集濾液，玻璃燒結(jié)漏斗內(nèi)抽濾，收集濾液，測定濾液中剩余的雞卵粘蛋白的含量。測定濾液中剩余的雞卵粘蛋白的含量。用用100ml1.0mol/LNaCl溶液抽洗，溶液抽洗，100ml蒸餾水抽洗，蒸餾水抽洗，再用再用20ml親和層析洗脫液洗滌。親和層析洗脫液洗滌。將親和介質(zhì)轉(zhuǎn)移到將親和介質(zhì)轉(zhuǎn)移到50ml的小燒杯內(nèi)，加入的小燒杯內(nèi)，加入20ml親和層析親和層析平衡液，浸泡平衡液，浸泡20分鐘，脫氣，裝柱。分鐘，脫

23、氣，裝柱。3胰蛋白酶粗提液的制備胰蛋白酶粗提液的制備3.1胰蛋白酶的基本性質(zhì)胰蛋白酶的基本性質(zhì)3.1.1存在形式：胰蛋白酶通常是以胰酶原的形式存在于動存在形式：胰蛋白酶通常是以胰酶原的形式存在于動物的胰臟或其他組織中。在底物的誘導(dǎo)下或激活劑的作用物的胰臟或其他組織中。在底物的誘導(dǎo)下或激活劑的作用下，酶原的下，酶原的C端水解，去端水解，去6肽轉(zhuǎn)變成具有活性的胰蛋白酶。肽轉(zhuǎn)變成具有活性的胰蛋白酶。-6肽肽胰蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶胰蛋白酶Ca+2激活劑激活劑3.1.2等電點(diǎn)與分子量：等電點(diǎn)與分子量：胰蛋白酶原的胰蛋白酶原的pI=10.8，分子量：分子量：24000Da胰蛋白酶的胰蛋白酶的pI=8

24、.9，分子量：分子量：23700Da3.1.3穩(wěn)定性穩(wěn)定性胰蛋白酶在酸性環(huán)境中很穩(wěn)定，在堿性環(huán)境中容易自溶，胰蛋白酶在酸性環(huán)境中很穩(wěn)定，在堿性環(huán)境中容易自溶，在提取的過程中要注意溶液的在提取的過程中要注意溶液的pH值。值。當(dāng)溶液的當(dāng)溶液的pH2.0容易變性容易變性pH=3.0生物活性穩(wěn)定生物活性穩(wěn)定pH7.0容易自溶容易自溶3.2胰蛋白酶原的提取胰蛋白酶原的提取(1)勻槳勻槳:取約取約30克豬胰臟，剝?nèi)ソY(jié)締組織和脂肪，取凈重克豬胰臟，剝?nèi)ソY(jié)締組織和脂肪，取凈重20-25克克左右左右,剪成碎塊。轉(zhuǎn)移到組織搗碎器內(nèi)剪成碎塊。轉(zhuǎn)移到組織搗碎器內(nèi),加入加入150ml預(yù)冷的預(yù)冷的3.5%的乙酸酸化水的乙

25、酸酸化水,勻槳勻槳.(2)提取提取:轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到500ml燒杯中燒杯中,用用2mol/L硫酸調(diào)節(jié)硫酸調(diào)節(jié)pH值在值在3.5-4.0之之間間,10攪拌提取約攪拌提取約4小時小時.(3)過濾過濾:取一塊紗布取一塊紗布,折疊成四層折疊成四層,用水潤濕用水潤濕,放在玻璃漏斗上放在玻璃漏斗上,將胰將胰蛋白酶原提取液過濾蛋白酶原提取液過濾,收集濾液收集濾液.(4)酸化: 用2mol/L硫酸調(diào)節(jié)濾液的pH值至2.5-3.0之間,4冰箱靜止沉淀4小時以上。(5)過濾: 折疊濾紙過濾,收濾液。 3.3胰蛋白酶原的激活胰蛋白酶原的激活(1)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH值值:用用5mol/LNaOH將濾液精確調(diào)節(jié)將濾液精確調(diào)節(jié)pH

26、值至值至pH8.0,量取溶量取溶液體積液體積.(2)加激活劑加激活劑:加入固體加入固體CaCl2使溶液的使溶液的Ca+2終濃度達(dá)到終濃度達(dá)到0.1mol/L,然然后加入約后加入約5mg結(jié)晶胰蛋白酶結(jié)晶胰蛋白酶,混勻混勻,激活激活.(3)激活時間激活時間:在在4冰箱內(nèi)激活冰箱內(nèi)激活12-16小時小時,在在25恒溫水浴中激活恒溫水浴中激活2-4小時小時.3.4停止激活停止激活(1)活性測定活性測定:取取1ml上清液分別測定蛋白濃度和活性上清液分別測定蛋白濃度和活性.具體具體操作見活性測定部分操作見活性測定部分.(2)停止激活停止激活:等酶溶液的比活性達(dá)到等酶溶液的比活性達(dá)到1000u/mg左右左右

27、,用用2mol/L硫酸調(diào)節(jié)硫酸調(diào)節(jié)pH值到值到3.0.(3)過濾過濾:濾紙過濾濾紙過濾,濾去濾去CaSO4沉淀沉淀,收集濾液收集濾液,4冰箱保冰箱保存存.4親和層析分離胰蛋白酶親和層析分離胰蛋白酶(1)裝柱裝柱:取一支層析柱取一支層析柱(101.0cm),將合成好的親和層析介將合成好的親和層析介質(zhì)質(zhì)CHOM-Sepharose4B裝入柱內(nèi)裝入柱內(nèi),自然沉降自然沉降.(2)平衡平衡:以以0.1mol/L,pH8.0Tris-HCl緩沖液緩沖液(內(nèi)含內(nèi)含0.5mol/LKCl,50mmol/LCaCl2)平衡平衡.(3)上樣上樣:將以經(jīng)激活的胰蛋白酶提取液將以經(jīng)激活的胰蛋白酶提取液,用用5mol/

28、LNaOH精確調(diào)節(jié)精確調(diào)節(jié)pH值至值至pH8.0,濾紙過濾濾紙過濾,取濾液上樣取濾液上樣.通過親和介通過親和介質(zhì)的偶聯(lián)量和胰蛋白酶粗提液的比活性質(zhì)的偶聯(lián)量和胰蛋白酶粗提液的比活性,計算出上樣所需計算出上樣所需體積體積.計算方法如下計算方法如下:偶聯(lián)偶聯(lián)mg數(shù)數(shù)0.861.3104(u/mg)上樣體積上樣體積(ml)=粗酶濃度粗酶濃度(mg/ml)比活比活(u/mg)(4)平衡平衡:上完樣以后上完樣以后,以以0.1mol/L,pH8.0Tris-HCl緩沖液緩沖液(內(nèi)含內(nèi)含0.5mol/LKCl,50mmol/LCaCl2)平衡平衡,洗去未被吸附的雜洗去未被吸附的雜蛋白。蛋白。(5)洗脫洗脫:等

29、平衡到基線穩(wěn)定后等平衡到基線穩(wěn)定后,用用0.1mol/L,pH2.5甲酸甲酸-0.5mol/LKCl溶液洗脫溶液洗脫.收集洗脫峰。收集洗脫峰。(6)(6)親和層析洗脫曲線親和層析洗脫曲線: :胰蛋白酶活性測定胰蛋白酶活性測定1胰蛋白酶活性測定胰蛋白酶活性測定1.1胰蛋白酶測定的基本原理胰蛋白酶測定的基本原理胰蛋白酶是一種蛋白水解酶胰蛋白酶是一種蛋白水解酶,它除了能水解堿性氨基酸與它除了能水解堿性氨基酸與其它氨基酸形成的肽鍵外其它氨基酸形成的肽鍵外,還能水解堿性氨基酸所形成的還能水解堿性氨基酸所形成的酯鍵酯鍵,催化活性具有高度的專一性催化活性具有高度的專一性.因此因此,可以用人工合成的可以用人工

30、合成的N-苯甲酰苯甲酰-L-精氨酸乙酯精氨酸乙酯(N-benzoyl-L-argineethylester,簡稱簡稱BAEE)為底物測定胰蛋白酶活性為底物測定胰蛋白酶活性.N-苯甲酰苯甲酰-L-精氨酸精氨酸乙酯乙酯(BAEE)在堿性條件下在堿性條件下,經(jīng)胰蛋白酶作用水解去一個乙經(jīng)胰蛋白酶作用水解去一個乙基生成基生成N-苯甲酰苯甲酰-L-精氨酸精氨酸(BA),催化反應(yīng)原理如圖所示。催化反應(yīng)原理如圖所示。由于BAEE在波長253nm處的光吸收值遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于BA。因此，可以在加入酶為零點(diǎn),測定在X分鐘內(nèi)的遞增吸光值.通過酶的定義求出酶活性。 1.2測定胰蛋白酶活性的定義測定胰蛋白酶活性的定義底物濃度底物

31、濃度C=1mmol/L光程光程:L=1cm波長波長:=253nm1個個BAEE單位單位溫度溫度:T=25體積體積:V=3ml遞增值遞增值:O.D=0.001A1.3計算公式(1)活性單位 O.DBAEE單位(u/ml) = N(稀釋倍數(shù)) 0.001 (2)比活性 測得的BAEE 活性單位(u/ml)BAEE單位(u/mg) = 胰蛋白酶濃度mg/ml)加入體積(ml) 2雞卵粘蛋白活性的測定雞卵粘蛋白活性的測定雞卵粘蛋白是胰蛋白酶的天然抑制劑雞卵粘蛋白是胰蛋白酶的天然抑制劑,通常通常1g雞卵粘蛋雞卵粘蛋白能抑制白能抑制0.86g胰蛋白酶的活性胰蛋白酶的活性(相當(dāng)于相當(dāng)于1:0.86).在胰蛋

32、白在胰蛋白酶液中加入適量的雞卵粘蛋白酶液中加入適量的雞卵粘蛋白,胰蛋白酶活性就會降低胰蛋白酶活性就會降低,胰胰蛋白酶遞減的活性就是雞卵粘蛋白的抑制活性蛋白酶遞減的活性就是雞卵粘蛋白的抑制活性.在同樣的在同樣的條件下分別測定出未加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性條件下分別測定出未加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性A1和和加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性A2.將將A1-A2就可以得到雞就可以得到雞卵粘蛋白的抑制活性卵粘蛋白的抑制活性.計算公式如下計算公式如下:(1)抑制活性抑制活性A1A2BAEE單位單位(Iu/ml)=N(稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù))0.001A1：胰蛋白酶活性：胰蛋白酶活性A2：加雞

33、卵粘蛋白的胰蛋白酶活性：加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性(2)抑制比活抑制比活測得的測得的BAEE活性單位活性單位(Iu/ml)BAEE單位單位(Iu/mg)=雞卵粘蛋白濃度雞卵粘蛋白濃度(mg/ml)加入體積加入體積(ml)3蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定3.1消光系數(shù)的定義：在蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸，消光系數(shù)的定義：在蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸，芳香族氨基酸在芳香族氨基酸在280nm處有最大吸收峰。蛋白質(zhì)分子中含處有最大吸收峰。蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸的數(shù)量以及分子的緊密程度有差異，在有芳香族氨基酸的數(shù)量以及分子的緊密程度有差異，在280nm處的光吸收強(qiáng)弱不同。在一定的條件下，一種純的處的光吸收強(qiáng)弱不同。在一定的條件下，一種純的蛋白質(zhì)在在蛋白質(zhì)在在280nm處的光吸收值是一個常數(shù)。因此酶以純處的光吸收值是一個常數(shù)。因此酶以純的蛋白質(zhì)在的蛋白質(zhì)在280nm處都有一個的消光系數(shù)處都有一個的消光系數(shù)A280。用符號。用符號表示為表示為E1%1cm。這個符號的定義是指在濃度為。這個符號的定義是指在濃度為1%（W/V的蛋白質(zhì)溶液中，測定光程為的蛋白質(zhì)溶液中，測定光程為1cm的條件下，該的條件下，該蛋白的吸光值。