食品微生物檢驗學實驗指導2013-03-08

1、1食食品品微微生生物物檢檢驗驗學學實實驗驗指指導導2013-3-192實驗實驗 1 菌落總數(shù)測定菌落總數(shù)測定 主要內(nèi)容：1）樣品的稱取、勻漿和稀釋；2）接種與瓊脂傾注；3）24h 后菌落計數(shù)及結(jié)果報告。實驗實驗 2 大腸菌群大腸菌群 MPN 測定測定 主要內(nèi)容：1）樣品的稱取、勻漿和稀釋；2）接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管，培養(yǎng)；3）24h后觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況，劃線于 EMB 瓊脂，培養(yǎng)；3）48h 時觀察菌落特征，革蘭氏染色、鏡檢；4）查 MPN 檢索表，報告結(jié)果。實驗實驗 3 大腸桿菌檢驗大腸桿菌檢驗主要內(nèi)容：1）樣品前處理； 2）增菌 （腸道增菌液）； 3）分離（麥康凱或伊紅美藍瓊脂）； 4）革蘭氏

2、染色、鏡檢； 5）生化試驗（TSI， pH7.2 尿素，甲基紅試驗和吲哚試驗，V-P 試驗和枸櫞酸鹽試驗）實驗實驗 4 金黃色葡萄球菌檢驗金黃色葡萄球菌檢驗 主要內(nèi)容：1）將金黃色葡萄球菌和鏈球菌肉湯培養(yǎng)物劃線于普通瓊脂、血液瓊脂，接種生化培養(yǎng)基，進行紙片法藥敏試驗，培養(yǎng)；2）24h 時觀察菌落特征，革蘭氏染色、鏡檢；3）觀察主要生化試驗結(jié)果和藥敏試驗結(jié)果。4）報告。實驗實驗 5 魏氏梭菌檢驗魏氏梭菌檢驗 主要內(nèi)容：1）細菌篩選 （亞硫酸鹽多粘菌素磺胺嘧啶，SPS 瓊脂）；2 細菌培養(yǎng)（液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，F(xiàn)T 培養(yǎng)基）；3）動力硝酸鹽還原實驗；4）暴烈發(fā)酵實驗；5）卵黃脂酶水解實驗。實驗實

3、驗 6 罐頭食品檢驗罐頭食品檢驗 主要內(nèi)容：1）罐頭感觀檢查；2）pH 值測定；3）染色鏡檢；4）接種培養(yǎng)（庖肉培養(yǎng)，溴甲酚紫葡萄糖肉糖，麥芽浸膏湯）5）平板篩選（錳鹽營養(yǎng)瓊脂平板，血瓊脂平板，卵黃瓊脂平板）實驗實驗 7 PCR 法檢測鼠傷寒沙門氏菌法檢測鼠傷寒沙門氏菌主要內(nèi)容：1) 以鼠傷寒沙門氏菌以 SdiA 為模板設計引物：(PCR 產(chǎn)物長度：562bpFsdiA: 5-TGG CAG CAG AGG ATG TTT AT-3RsdiA 5-TCG ATC TCC GAT GAG GTC TT-32) 細菌單克隆水懸浮后做模板，做 PCR3) 電泳檢測是否擴出條帶。實驗實驗 8 霉菌檢驗

4、霉菌檢驗 主要內(nèi)容：1）樣品稀釋 2）平板接種培養(yǎng)（馬鈴薯葡萄糖瓊脂，孟加拉紅瓊脂） ；3）菌落計數(shù)3實習周實習周: 雞蛋中沙門氏菌篩選、分離、生化鑒定及嗜菌體檢測雞蛋中沙門氏菌篩選、分離、生化鑒定及嗜菌體檢測主要內(nèi)容：（一）樣品前處理及增菌培養(yǎng)；（二）沙門氏菌在選擇平板上菌落特征觀察；（三）沙門氏菌染色特性和生化特性觀察；（四）沙門氏菌噬菌體鑒定。4實驗一實驗一 菌落總數(shù)測定菌落總數(shù)測定目的與要求目的與要求1.通過本試驗要求掌握食品的菌落總數(shù)測定的方法，菌落計數(shù)和報告方式，以及經(jīng)常食用的各類動物性食品的菌落總數(shù)標準。2.菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過適當處理，在一定的條件下培養(yǎng)后，所得 1g 或

5、1mL 檢樣中所含細菌菌落的總數(shù)，其也是判定食品被污染程度的標志。實驗器材及試劑實驗器材及試劑 溫箱、天平、滅菌試管、吸管、滅菌平皿、稀釋液、營養(yǎng)瓊脂、牛奶等。 實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容（一）檢樣稀釋及培養(yǎng)（一）檢樣稀釋及培養(yǎng)：1.以無菌操作，將檢樣（牛奶）0.5ml 放于含有 4.5mL 滅菌生理鹽水試管內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨作成 1：10 的均勻稀釋液。2.用無菌移液器吸取 1：10 稀釋液 0.5ml，注入含有 4.5mL 滅菌生理鹽水的試管中振搖試管混合均勻，作成 1：100 倍稀釋。3.更換槍頭后，再用無菌移液器，按（2）操作 10 倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次換一只 1mL 無菌槍頭。4.

6、根據(jù)衛(wèi)生標準要求或?qū)悠肺廴厩闆r的估計，選擇 23 個適宜稀釋度，分別在作 10 倍遞增稀釋的同時，用移液器吸取 1mL 稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作 2 個平皿。5.稀釋液移入平皿后，應立即將冷至 46 左右營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（可放置 46 水浴中保溫）注入平皿約 15-20 ml，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻，同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有 lml 滅菌稀釋液的滅菌平皿內(nèi)，作空白對照。6.待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置 37溫箱內(nèi)培養(yǎng) 482h。（二）（二） 菌落計數(shù)菌落計數(shù)1 選取30-300 CFU 之間，無蔓延生長的、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU 的平板記錄具體菌落數(shù)，大于3

7、00 CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應采用兩個平板的平均數(shù)。2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。3 當平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。5（三）（三） 結(jié)果與報告結(jié)果與報告1 菌落總數(shù)的計算方法菌落總數(shù)的計算方法1.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。1.2 若有兩個連續(xù)稀釋

8、度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按公式（1）計算：N=C/(n1+ 0.1 n2)d （1）式中：N樣品中菌落數(shù)；C平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d稀釋因子（第一稀釋度）。示例：稀釋度1:100（第一稀釋度）1:1000（第二稀釋度菌落數(shù)（CFU）232，24433，35N=C/(n1+ 0.1 n2)d = (232+244+33+35)/2+(0.12) 10-2 = 544/0.022 = 24727上述數(shù)據(jù)按 2.2 數(shù)字修約后，表示為 25000 或 2.5104。1.3 若所有稀釋度的平板上菌

9、落數(shù)均大于300 CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。1.4 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30 CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。1.5 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1 乘以最低稀釋倍數(shù)計算。1.6 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU300 CFU 之間，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 時，則以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。62 菌落總數(shù)的報告2.1 菌落數(shù)小于100 CFU 時，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。

10、2.2 菌落數(shù)大于或等于100 CFU 時，第3 位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2 位數(shù)字，后面用0 代替位數(shù)；也可用10 的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。2.3 若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。2.4 若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。2.5 稱重取樣以 CFU/g 為單位報告，體積取樣以 CFU/mL 為單位報告。思考題1 菌落總數(shù)的食品衛(wèi)生學意義？2 影響本實驗結(jié)果的因素有哪些？7實驗二實驗二 大腸菌群數(shù)的測定大腸菌群數(shù)的測定目的與要求目的與要求 1掌握大腸菌群 MPN 的測定原理與方法，及實驗結(jié)果報告方式。2了解大腸菌群

11、的食品衛(wèi)生學意義原理原理大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。 食品中大腸菌群數(shù)系以每 100g（或 ml）檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（the most probable number-簡稱 MPN）表示。實驗器材及試劑實驗器材及試劑樣品：牛乳 溫箱、天平、滅菌試管、吸管、滅菌平皿、乳缽、剪子和鑷子、稀釋液、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉湯、煌綠乳

12、糖膽鹽（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉湯、磷酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水等。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容一、常規(guī)檢驗法一、常規(guī)檢驗法1 檢樣稀釋及培養(yǎng)檢樣稀釋及培養(yǎng) 取樣及稀釋方法與菌落總數(shù)檢驗方法相同,做成 10 倍遞減的均勻系列稀釋液，從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過 15 min。2 初發(fā)酵實驗初發(fā)酵實驗每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1 mL，則用雙料LST肉湯），361 培養(yǎng)24 h2 h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24 h2 h

13、產(chǎn)氣者進行復發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h2 h，產(chǎn)氣者進行復發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。3 復發(fā)酵試驗復發(fā)酵試驗用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36 1培養(yǎng)48 h2 h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。84 大腸菌群最可能數(shù)（大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告）的報告按3確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。 思考題思考題 1 為什么大腸菌群的檢驗要經(jīng)過復發(fā)酵才能證實？ 2 復發(fā)酵時為什么使用乳糖發(fā)酵管但不需加膽鹽？表表 3-23-2大腸菌群最可能數(shù)（大

14、腸菌群最可能數(shù)（MPNMPN）檢索表）檢索表陽性管數(shù)95可信限1ml（g）30.1ml（g）30.01ml（g）3MPN100ml（g）下限上限000000000123303060905900000111101233060901205130000022220123609012016052000000333301239013016019010210111100000123407011015010230111111110123701101501903036011112222012311015020024030360113301160200303609113323240290222200000123

15、901402002601037022221111012315020027034030440222222220123210280350420707039047022223333012329036044053010015003333000001232303906409504070150120013001800333311110123430750120016007014030021002300380033332222012393015002100290015030035038004400470033333333012324004600110002400036071015001300024000480

16、00注： 表采用 3 個稀釋度1mL（g）、0.1mL（g）和 0.01mL（g），每稀釋度 3 管。 內(nèi)所列檢樣量如改用 10mL（g）、1mL（g）和 0.1mL（g）時，表內(nèi)數(shù)字相應降低 10 倍；如改用 0.1mL（g）、0.01mL（g）和 0.001mL（g）時，則表內(nèi)數(shù)字應相應增加 10 倍。其余可類推。 10實驗三實驗三 食品中致病性大腸桿菌檢驗食品中致病性大腸桿菌檢驗 目的與要求目的與要求（1）了解病原性大腸埃希氏菌的種類與非病原性大腸埃希氏菌的區(qū)別。（2）掌握病原性大腸埃希氏菌檢驗的原理和方法原理原理正常情況下，大腸埃希氏菌不致病，而且還能合成微生素 B 和微生素 K，生產(chǎn)

17、大腸菌素，對機體有利。但當機體抵抗力下降或大腸埃希氏菌侵入腸外組織或器官時，可作為條件性致病菌而引起腸道外感染。有些血清型可引起腸道感染，已知的引起致病性大腸埃希氏菌有 4 類，即產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌和腸道致病性大腸埃希氏菌。 實驗器材及試劑實驗器材及試劑 樣品：豬肉 溫箱、顯微鏡、載玻片、革蘭氏染色液、腸道菌增菌肉湯、營養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂（EMB） 、三糖鐵瓊脂（TSI） 、尿素瓊脂（pH7.2） 、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、甲基紅、枸櫞酸鹽、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基等。 實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容1 增菌增菌以無菌操作稱取 10g 樣品，在無菌研缽

18、內(nèi)，用無菌剪刀剪碎樣品并加入 10ml 生理鹽水和適量滅菌沙，將樣品磨碎。然后將其加入 90ml 營養(yǎng)肉湯內(nèi)，于 361培養(yǎng) 6h。挑取 1 環(huán)，接種于 5ml 腸道菌增菌湯內(nèi)，于 42培養(yǎng) 18h。2 2 分離分離將腸道增菌液分別劃線接種于麥康凱和伊紅美藍瓊脂平板上，于 361培養(yǎng) 18-24h，觀察菌落。3 3 生化試驗生化試驗平板上挑菌直接接種于三糖鐵（TSI） 、蛋白胨水、尿素瓊脂（pH7.2） 、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)物均在 361培養(yǎng) 18-24h。同時，對細菌培養(yǎng)物做甲基紅試驗、靛基質(zhì)試驗和枸櫞酸鹽利用試驗。TSI 斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，H2S 陰性，靛基質(zhì)和甲基

19、紅試驗陽性，V-P 試驗和枸櫞酸鹽利用試驗陰型為大腸埃希氏菌。114 染色鏡檢染色鏡檢對培養(yǎng)菌通過革蘭氏染色鏡檢。5 血清學檢驗血清學檢驗結(jié)果和實驗結(jié)論結(jié)果和實驗結(jié)論（1）記錄實驗結(jié)果，書寫實驗報告。（2）總結(jié)大腸埃希氏菌的特征性生化反應。12實驗四實驗四 牛奶中金黃色葡萄球菌檢驗牛奶中金黃色葡萄球菌檢驗 目的與要求目的與要求 1掌握葡萄球菌的常規(guī)檢驗方法。 2認識葡萄球菌的形態(tài)、培養(yǎng)和生化特性。實驗器材及試劑實驗器材及試劑 溫箱、營養(yǎng)瓊脂、顯微鏡、載玻片、革蘭氏染色液、新鮮兔血漿、血瓊脂平板等。 實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容一、葡萄球菌的檢驗一、葡萄球菌的檢驗 金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，并使血漿纖維蛋

20、白發(fā)生凝固，呈現(xiàn)陽性反應。一）檢樣的采集與處理一）檢樣的采集與處理 取 10ml 檢樣加入 90 mL 滅菌生理鹽水內(nèi)制成混懸液。二）增菌和分離培養(yǎng)1吸取混懸液 0.5mL 接種 7.5氯化鈉肉場 4.5mL，于 36 1 培養(yǎng) 18 h24 h。金黃色葡萄球菌在 7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長。2 將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 1 培養(yǎng)18 h24 h。Baird-Parker 平板36 1 培養(yǎng)18 h24 h 或45 h48 h。3 金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直徑為2 mm3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色

21、，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。三）鑒定1 染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5 m1 m。2 血漿凝固酶試驗：挑取、Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1 個或以上，分別接種到5 mL BHI和營養(yǎng)瓊脂

22、小斜面，36 1 培養(yǎng)18 h24 h。取新鮮配置兔血漿0.5 mL，放入小試管中，再加入BHI 培養(yǎng)物0.2 mL0.3 mL，振蕩搖勻，置361 溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6 h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌13株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進行血漿凝固酶試驗。結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 1 培養(yǎng)18 h48 h，重復試驗。四）結(jié)果與報告四）結(jié)果與報告1 結(jié)果判定：符合 2.3 和三 ，可判定為金黃色葡萄球菌。2 結(jié)

23、果報告：在25 g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。 思考題1 金黃色葡萄球菌的毒力主要表現(xiàn)在哪幾個方面?14實驗五實驗五 魏氏梭菌檢驗魏氏梭菌檢驗目的與要求目的與要求 1認識魏氏梭菌的形態(tài)及染色特性 2掌握魏氏梭菌檢驗方法。 實驗器材及試劑實驗器材及試劑 溫箱、天平、滅菌試管、吸管、滅菌平皿、乳缽、剪子和鑷子、稀釋液、營養(yǎng)瓊脂、顯微鏡、載波片、革蘭氏染色液 SPS 瓊脂、動力一硝酸鹽培養(yǎng)基含鐵牛奶培養(yǎng)基卵黃瓊脂平板。 實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容 一、形態(tài)及染色特性觀察 本菌為革蘭氏陽性的粗大桿菌，單在或成雙排列。芽胞呈卵圓形位于菌體中央或近端。在機體內(nèi)形成莢膜，無鞭毛，不能運動。在陳舊的培養(yǎng)物

24、中，菌體呈革蘭氏陰性。 二、活菌計數(shù)培養(yǎng) 1按無菌操作稱取食品檢樣 25g（ mL）放入均質(zhì)器，加 01蛋白胨水稀釋劑225mL，低速攪動 12 分鐘，使之均質(zhì)化，做成 1：10 稀釋。 2以上述 1： 10 稀釋的均質(zhì)液按 lmL 加 01蛋白胨稀釋劑 9mL，做成 10-210-6的系列稀釋液。 3吸取各稀釋液分別放于 2 個滅菌平皿內(nèi)各 lmL。每個平皿澆注約 50的 SPS 瓊脂 1520mL，仔細轉(zhuǎn)動手血，使稀釋液和瓊脂充分混勻。 4上述瓊脂平板凝固后，倒置于厭氧培養(yǎng)裝置內(nèi) 36 士 1培養(yǎng) 24h。 5選取長有 30300 個黑色菌落的平板，計數(shù)。 三、證實試驗 1由平板上任取 1

25、0 個黑色菌落，分別接種 FT 培養(yǎng)基； 36 土 1培養(yǎng) 1824h。 2用上述培養(yǎng)液涂片，革蘭氏染色鏡檢，檢查培養(yǎng)液的純凈度。3用接種環(huán)（針）穿刺接種動力一硝酸鹽培養(yǎng)基， 36 土 1培養(yǎng) 24h，觀察接種線的生長情況，判斷有無動力。然后滴加 a 一萘胺液和對氨基苯磺酸液各 05mL，觀察硝酸鹽是否被還原。(亞硝酸鈉與對氨基苯磺酸發(fā)個重氮反應，其產(chǎn)物與 a 一萘胺起偶氮作用，呈紫紅色) 4取生長旺盛的 FT 培養(yǎng)液 lmL 接種含鐵牛奶培養(yǎng)基，于 46水浴中培養(yǎng)，2h 時后觀察有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象。5h 不發(fā)酵者為陰性。15 5用接種環(huán)蘸取 FT 培養(yǎng)液（液體硫已醇酸鹽培養(yǎng)基）點種卵黃瓊脂

26、平板（每個平板至少可點種 10 點） ，倒置厭氧培養(yǎng)裝置內(nèi)，35培養(yǎng) 24h，觀察接種點的乳白色混濁變化，以判定有無卵磷脂酶產(chǎn)生。 四、菌落計算 根據(jù)黑色菌落的計數(shù)（5）和證實試驗的結(jié)果，計算每 g（mL）食品檢樣的含菌數(shù)。 例如，10-4稀釋液的平板長有黑色菌落 100 個，而供作證實試驗的 10 個菌落中有 7 個被確證為魏氏梭菌，則每 g（ mL）食品檢樣所含魏氏梭菌數(shù)： 1000.7104=7105 思考題1 魏氏梭菌的形態(tài)染色特性和培養(yǎng)特性?2 “暴烈發(fā)酵”的原理是什么?16實驗六實驗六 罐頭食品檢驗罐頭食品檢驗目的與要求目的與要求1 了解罐頭食品商業(yè)無菌檢驗的安全學意義。2 掌握罐

27、頭食品商業(yè)無菌檢驗原理和方法。實驗器材實驗器材冰箱、溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、顯微鏡、電位 pH 計、吸管、培養(yǎng)皿、試管等。培養(yǎng)基、試劑和樣品培養(yǎng)基、試劑和樣品1 培養(yǎng)基和試劑革蘭氏染色液、庖肉培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖肉湯、酸性肉湯、麥芽浸膏湯、錳鹽營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂、卵黃瓊脂。2 樣品肉罐頭，水果罐頭。概述概述罐頭食品是將食品原料經(jīng)過預處理，裝入容器，經(jīng)殺菌、密封之后制成的，通常稱之為罐頭。罐頭食品經(jīng)過適度的熱殺菌以后，不含有致病的微生物，也不含有在通常溫度下能在其中繁殖的非致病性微生物，這種狀態(tài)稱之為商業(yè)無菌。罐頭腐敗變質(zhì)的原因有化學因素，物理因素和生物因素等。引起腐敗的主要原因是罐頭內(nèi)污染了微生

28、物而導致腐敗變質(zhì)。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容1 開罐將樣罐用溫水和洗滌劑洗刷干凈，用自來水沖洗后擦干。放入無菌室，以紫外燈照射30min。將樣罐移置于超凈工作臺上，用 75%酒精棉球擦拭，并點燃滅菌（胖聽罐不能燒） 。用滅菌的衛(wèi)生開罐刀或罐頭打孔器開啟（帶湯汁的罐頭開罐前適當震搖） 。2 pH 值測定取樣測定 pH 值3 接種培養(yǎng)用滅菌的適當工具移出約 1ml(g) 內(nèi)容物，分別接種培養(yǎng)。接種量約為培養(yǎng)基的十分之一。要求在 55培養(yǎng)基管，在接種前應在 55水浴中預熱至該溫度，接種后立即放入55溫箱培養(yǎng)。17（1）低酸性罐頭食品（每罐）接種培養(yǎng)基、管數(shù)及培養(yǎng)條件見表 6-1。表 6-1 低酸性罐頭食品的檢

29、驗培養(yǎng)基管數(shù)培養(yǎng)條件/時間/h庖肉培養(yǎng)2361(厭氧)96120庖肉培養(yǎng)2551(厭氧)2472溴甲酚紫葡萄糖肉湯(帶倒管)2361(需氧)96120溴甲酚紫葡萄糖肉湯(帶倒管)2551(需氧)2472（2）酸性罐頭食品（每罐）接種培養(yǎng)基、管數(shù)及培養(yǎng)條件見表 6-2表 6-2 酸性罐頭食品的檢驗培養(yǎng)基管數(shù)培養(yǎng)條件/時間/h酸性肉湯2551(需氧)48酸性肉湯2301(需氧)96麥芽浸膏湯2301(需氧)964 微生物培養(yǎng)檢驗程序及判定對在 36培養(yǎng)有菌生長的溴甲酚紫葡萄糖肉湯管，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況，并涂片染色鏡檢。如果是含桿菌的混合培養(yǎng)物或球菌、酵母菌或霉菌的純培養(yǎng)物，不再往下檢驗；如僅有芽孢桿

30、菌則判為嗜溫性需氧芽孢桿菌；如僅有桿菌無芽孢則為嗜溫性需氧桿菌；如需進一步證實是否是芽孢桿菌，可轉(zhuǎn)接于錳鹽營養(yǎng)瓊脂平板在 36培養(yǎng)后再作判定。對在 55培養(yǎng)有菌生長的溴甲酚紫葡萄糖肉湯管，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況，并涂片染色鏡檢。如有芽孢桿菌，則判為嗜熱性需氧芽孢桿菌；如僅有桿菌無芽孢則為嗜熱性需氧桿菌；如需進一步證實是否是芽孢桿菌，可轉(zhuǎn)接于錳鹽營養(yǎng)瓊脂平板在 55培養(yǎng)后再作判定。對在 36培養(yǎng)有菌生長的庖肉培養(yǎng)基管，涂片染色鏡檢，如為不含桿菌的混合菌相，不再往下進行；如有桿菌，帶或不帶芽孢，都要轉(zhuǎn)接于兩個血瓊脂平板（或卵黃瓊脂平板）在 36分別進行需氧和厭氧培養(yǎng)。在需氧平板上有芽孢生長，則為嗜溫性需

31、氧芽孢桿菌；在厭氧平板上生長為一般芽孢則為嗜溫性厭氧芽孢桿菌，如為梭狀芽孢桿菌，應用庖肉培養(yǎng)基原培養(yǎng)液進行肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗。對在 55培養(yǎng)有菌生長的庖肉培養(yǎng)基管，涂片染色鏡檢，如有芽孢桿菌，則判為嗜熱性厭18氧芽孢桿菌或硫化腐敗性芽孢桿菌；如無芽孢僅有桿菌，轉(zhuǎn)接于錳鹽營養(yǎng)瓊脂平板，在55厭氧培養(yǎng)，如有芽孢則為嗜熱厭氧芽孢桿菌，如無芽孢則為嗜熱性厭氧桿菌。（2）對有微生物生長的酸性肉湯和麥芽浸膏湯管進行觀察，并涂片染色鏡檢。按所發(fā)現(xiàn)的微生物類型判定。實驗結(jié)果實驗結(jié)果對檢樣檢測過程進行合適的記錄，并報告檢驗結(jié)果。思考題思考題1 簡述罐頭食品進行商業(yè)無菌檢驗的意義。2 簡述罐頭食品進行商業(yè)無菌

32、檢驗的操作步驟。19實驗七實驗七 PCR 法檢測鼠傷寒沙門氏菌法檢測鼠傷寒沙門氏菌目的與要求目的與要求掌握 PCR 法檢測豬肉中沙門氏菌的原理和方法。實驗器材實驗器材1 儀器PCR 儀、離心機、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)2 實驗菌鼠傷寒沙門氏菌 CVCC541培養(yǎng)基、試劑和樣品培養(yǎng)基、試劑和樣品1 培養(yǎng)基和試劑亞硫酸鉍瓊脂，LB 培養(yǎng)液；磷酸鹽緩沖液，無菌生理鹽水，DNA Marker2000, PCR buffer、dNTPs、Taq 酶；PCR 引物2 樣品全脂乳、脫脂乳等實驗原理實驗原理在 DNA 聚合酶催化下，以母鏈 DNA 為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外

33、復制出與模板 DNA 互補的子鏈 DNA，通過快速特異地在體外擴增目的 DNA 而達到特異、快速地檢測目標菌的目的。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容1 引物設計以鼠傷寒沙門氏菌以 SdiA 為模板設計引物：(PCR 產(chǎn)物長度：562bpFsdiA: 5-TGG CAG CAG AGG ATG TTT AT-3RsdiA 5-TCG ATC TCC GAT GAG GTC TT-32 菌種活化及樣品制備將鼠傷寒沙門氏菌 CVCC541 菌株經(jīng)二次斜面活化后 LB 培養(yǎng)液，計數(shù)后置于 4冰箱保藏；將活化細菌接種豬肉中，制得人工污染樣品。3 基因組 DNA 模板提取LB 培養(yǎng)液中模板 DNA 提?。翰捎盟蠓ǎ?

34、1ml 菌液 4500r/min 離心 15min，棄上清液，重復水洗一次，沉淀用 50l 無菌水重懸后煮沸 10min，12000 r/min 離心 5min， 取上清 5l 作為 PCR 擴增模板。20豬肉中細菌模板 DNA 提取：1ml 人工污染樣品中加入 0.2ml 無水乙醇、0.2ml 氨水和0.2ml 石油醚，混勻后 12000 r/min 離心 10min。沉淀用 300l 10mmol/l 的 TE(pH7.8)溶解后，加入 5l 10mg/ml 溶菌酶，37孵化 1h,期間不斷劇烈震蕩。然后加入 50l 10%的 SDS 煮沸 5min。上述混合液中加入等體積的氯仿充分震蕩混

35、勻，13000 r/min 離心 10min 收集上清。所得上清液用 0.1 倍體積 2.5mol/l 乙酸銨（pH5.4）和 2.5 倍體積預冷無水乙醇沉淀DNA，13000 r/min 離心 20min，DNA 沉淀干燥后用 100l 滅菌超純水溶解，4保存?zhèn)溆谩? PCR 反應（1）PCR 反應體系：25l 反應體系12.5l PCR 2mixture,上、下游引物各 1l，模板5l，無菌水 5.5l（2）PCR 反應條件94變性 3min 后進入 PCR 循環(huán)：94 30s、66 (大腸桿菌)或 55（沙門氏菌）30s,72 1min, 30 個循環(huán)；72 10min、4 10min。

36、實驗結(jié)果實驗結(jié)果PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測是否有目的條帶出現(xiàn)。思考題思考題利用 PCR 方法進行快速檢測時，有時會出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，試分析造成假陽性或假陰性結(jié)果的原因并提出相應的試驗控制措施。21實驗八實驗八 霉菌和酵母計數(shù)霉菌和酵母計數(shù)目的與要求目的與要求 了解和掌握食品中霉菌和酵母計數(shù)的測定方法實驗器材及試劑實驗器材及試劑被檢肉樣，滅菌試管，滅菌吸管，滅菌平皿，天平，量筒，三角瓶，剪刀，鑷子，載玻片，顯微鏡，香柏油，擦鏡紙等。馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（附加抗生素） ，孟加拉紅培養(yǎng)基。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容1 以無菌操作稱取檢樣 25g（mL） ，放入含有 225mL 滅菌水的具玻塞錐形瓶

37、中，振搖30min，即為 1:10 稀釋的樣品。2 用滅菌吸管吸取 1:10 樣品液 10mL，注入滅菌試管中，另用 1mL 一支滅菌吸管反復吹打50 次，使霉菌孢子充分散開。3 吸取 1:10 樣品液 1mL 注入含有 9 mL 滅菌水的試管中，另換一支 1 mL 滅菌吸管吸吹 5次，制成 1:100 樣品液。4 按上述操作順序做 10 倍系列稀釋，每稀釋一次，換用一支滅菌吸管，根據(jù)對樣品污染程度的估計選擇 3 個合適的稀釋度，分別在進行稀釋的同時吸取 1mL 樣液置于滅菌平皿，每個稀釋度做個平皿。然后將融化后保存在水浴中的瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿，輕輕轉(zhuǎn)動平皿使樣液與培養(yǎng)基充分混勻，待瓊脂凝固

38、后倒置于1溫箱中，5后開始觀察。 計數(shù)方法：通常選擇菌落數(shù)在10150之間的平皿進行計數(shù)，取同一稀釋度的兩個平皿菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（毫升）檢樣中所含霉菌和酵母數(shù)。霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計。菌落數(shù)應采用兩個平板的平均數(shù)。6 結(jié)果與報告6.1.1計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)計算。6.1.2 若所有平板上菌落數(shù)均大于150 CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。6.1.3 若所有平板上菌落數(shù)均小于10 CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。226.1.4 若所

39、有稀釋度平板均無菌落生長，則以小于1 乘以最低稀釋倍數(shù)計算；如為原液，則以小于1計數(shù)。6.2 報告6.2.1 菌落數(shù)在100 以內(nèi)時，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報告。6.2.2 菌落數(shù)大于或等于100 時，前3 位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2 位數(shù)字，后面用0 代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可用10 的指數(shù)形式來表示，此時也按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字。6.2.3 稱重取樣以CFU/g 為單位報告，體積取樣以CFU/mL 為單位報告，報告或分別報告霉菌和/或酵母數(shù)。23實習周實習周: 雞蛋中沙門氏菌篩選、分離、生化鑒定及嗜菌體檢測雞蛋中沙門氏菌篩選、分離、生化鑒定及

40、嗜菌體檢測目的與要求目的與要求 通過本實驗要求了解沙門氏菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)染色特性、生化特性和噬菌體鑒定；掌握動物性食品中沙門氏菌的國家標準檢驗方法（ GB4789） 。 實驗器材及試劑實驗器材及試劑 溫箱、顯微鏡、載玻片、革蘭氏染色液、亞硫酸鉍瓊脂、DHL 瓊脂、HE 瓊脂、三糖鐵瓊脂、蛋白胨水、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、pH72 尿素瓊脂、P22 噬菌體等。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容（一）樣品前處理及增菌培養(yǎng)；（二）沙門氏菌在選擇平板上菌落特征觀察；（三）沙門氏菌染色特性和生化特性觀察；（四）沙門氏菌噬菌體鑒定。 操作步驟操作步驟一、國家標準檢驗方法（ GB4789484）（一）前增菌和和選擇性增菌

41、肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應經(jīng)過前增菌。各稱取檢樣 25g，加在裝有 225mL 緩沖蛋白胨水的 500mL 廣口瓶中，固體食物可先用均質(zhì)器，以 800010000 轉(zhuǎn)/分打碎 1min。 ，或用乳缽加滅菌沙磨碎；粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化。于 361培養(yǎng) 4h（干蛋白需培養(yǎng) 1824h） ，移取 10mL，轉(zhuǎn)種子 100mL 四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于 42培養(yǎng) 1824h。同時，另取 10mL 加入 1 00mL 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于 36 士 1培養(yǎng)上 1824h。 鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工食品不必經(jīng)過前增菌。各取 25g（ mL）加入滅菌生理鹽水 225mL 按前

42、法做成檢樣勻液，取其半量接種于 100mL 四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于 42培養(yǎng) 24h；另半量接種于 100mL 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于 36 士 1培養(yǎng)1824h。 （二）分離 取增菌液 1 環(huán)，劃線接種于亞硫酸鉍瓊脂平板一個和 DHL 瓊脂平板（或HE 瓊脂平板）一個。兩種增菌液可同時劃線接種在一個平板上。于 36 士 1分別培養(yǎng)1824h（ DHL、 HE、 S S）或 4048h（ BS） ，觀察各個平板上生長的菌落。沙門24氏菌屬亞屬、IV、V 和亞屬在各個平板上的菌落特征見表 11。 表 1- 1 沙門氏菌屬各亞屬在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板 亞屬、 亞屬

43、（即亞利桑那菌） 亞硫 產(chǎn) H2S，菌落為黑色，有金屬光澤， 酸鉍 棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈 瓊脂 黑色或棕色；有些菌株不產(chǎn)生 H2S，形 黑色菌落，有金屬光澤 成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變 無色半透明，產(chǎn) H2S，菌落中心帶黑色 乳糖遲緩陽性或陰性的菌株，與亞屬DHL 瓊脂 或幾乎全黑色 、相同；乳糖陽性的菌 株粉紅色，中心帶黑色 藍綠色或藍色，多數(shù)菌株產(chǎn) H2S，菌落 乳糖陽性的菌株為黃色，中心黑色或 HE 瓊脂 中心黑色或幾乎完全黑色 幾乎全黑色；乳糖遲緩陽性或陰性的 菌株為藍綠色或藍色，中心黑色或幾 乎全黑色 （三）生化試驗 挑取選擇性瓊脂平板上的可疑菌落，接種于三糖鐵瓊脂上

44、。一般應多挑幾個菌落，以防遺漏。在三糖鐵瓊脂上，各個菌屬的主要反應結(jié)果見表 12。表 1-2 腸桿菌科各菌屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應結(jié)果斜面 底層 產(chǎn)氣 H2S 可 能 的 菌 屬 + +/ + 沙門氏菌屬、變形桿菌屬、拘櫞酸桿菌屬、愛德華桿菌屬 + + +/ + 沙門氏菌亞屬，枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬 + + 沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬 + +/ 傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、埃希氏菌屬 、摩根氏菌屬、普羅菲登斯菌屬 + + +/ 埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬 *：+陽性；陰性； +/多數(shù)陽性，少數(shù)陰性上表說明，在三糖鐵瓊脂內(nèi)只有斜

45、面產(chǎn)酸并同時 H2S 陰性的菌株可以排除，其他的反應結(jié)果均有沙門氏菌的可能，同時也均有不是沙門氏菌的可能，因此都要做幾項最低限度25的生化實驗，必要時作抹片染色鏡檢應為革蘭氏陰性短桿菌，氧化酶實驗應為陰性。在接種三糖鐵瓊脂的同時，再接種蛋白胨水（供作靛基質(zhì)試驗） 、pH72 尿素瓊脂、KCN 培養(yǎng)基和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基各一管，于 36 士 1培養(yǎng) 1824h，必要時可延長至 48h，判定結(jié)果。按反應序號分類，沙門氏菌屬的結(jié)果屬于 A1、A 2 和B1，其他五種反應結(jié)果均可以排除，詳見表 13。表 1-3 腸桿菌科各屬生化反應初步鑒定表反應序號 H2S 靛基質(zhì) pH7.2 KCN

46、 賴氨酸 判 定 屬 尿素 脫梭酶 A1 + + 沙門氏菌屬 A2 + + + 沙門氏菌屬（少見） 、愛德華氏菌屬A3 + + + 枸櫞酸桿菌屬、奇異變形桿菌A4 + + + + 普通變形桿菌B1 + 沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、甲型副傷寒 沙門氏菌、志賀氏菌屬B2 + + 埃希氏菌屬、志賀氏菌屬 + B3 +/ + + 克雷伯氏菌各屬、陰溝腸桿菌、枸櫞酸 + + + 桿菌屬B4 + +/ + 摩根氏菌屬、普羅菲斯菌屬 *：（1）三糖鐵瓊脂底層均應產(chǎn)酸，不產(chǎn)酸者可排除。斜面產(chǎn)酸與產(chǎn)氣可不限。（2）KCN 和賴氨酸可選用其中一種，但不能判定結(jié)果時，仍需補做另一項。反應序號 A1，典型反應判定為沙門氏

47、菌，如尿素、KCN 和賴氨酸三項中有一項異常，可按表 1-3 附（一）仍可判為沙門氏菌；如有兩項異常，則按 A3 判定為枸櫞酸桿菌。表 1-3 附（一）PH7.2 尿素 KCN 賴氨酸 判 定 結(jié) 果 甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學鑒定結(jié)果） + + 沙門氏菌屬亞屬 N 或 V（要求符合本亞屬生化特性）+ + 沙門氏菌個別變種（要求血清學鑒定結(jié)果）反應序號 A2，可先做噬菌體鑒定，當噬菌體不感染時，補做甘露醇和山梨醇實驗，按表 1-3 附（二）判定結(jié)果。26 表 1-3 附（二） 甘露醇 山梨醇 判 定 結(jié) 果 + + 沙門氏菌屬靛基質(zhì)陽性變種（要求血清學鑒定結(jié)果） 愛德華氏菌屬 反應序號 B

48、1 三糖鐵斜面產(chǎn)酸的菌株可首先排除，不產(chǎn)酸者可先做噬菌體感染，當噬菌體不感染時，補做鳥氨酸、ONPG、水楊苷、棉子糖和半固體動力實驗，按表 1-3 附（三）判定結(jié)果。 表 1-3 附（三） 賴氨酸 鳥氨酸 ONPG 水楊苷 棉子糖 動力 判定結(jié)果 + + + 沙門氏菌屬 志賀氏菌 + + 宋內(nèi)氏志賀氏菌d d d d d d 埃希氏菌屬 *：判定結(jié)果時應注意傷寒沙門氏菌鳥氨酸，甲型副傷寒沙門氏菌賴氨酸，雞沙門氏菌無動力，表中 d 表示有不同的反應結(jié)果，如果未做 KCN 時，常需做 VP 試驗（2225，4d）哈夫尼亞菌屬為陽性。 必要時按表 3-4 進行沙門氏菌亞屬或其他亞屬的鑒定。 表 3-

49、4 沙門氏菌亞屬的鑒定項目 亞 屬 乳糖 /（+） ONPG + +衛(wèi)矛醇 + + +KCN + +丙二酸鈉 + + 水楊苷 + *：（+） 遲緩陽性四 噬菌體鑒定1 P22 噬菌體的增值，檢測和保存11 P22噬菌體增值：用SM液10倍遞減稀釋噬菌體原液，按101，102，103，104 稀釋。挑取單個標準沙門氏菌落接種10mL LB培養(yǎng)液，37振蕩培養(yǎng)8h，使其濃度達到108CFU。各取0.1ml噬菌體稀釋液分別加入10 ml細菌培養(yǎng)液中，37、20min靜止使噬菌體吸附于細菌。然后，37振蕩培養(yǎng)58h，可見裂解發(fā)生。然后加入0.1ml氯仿，振蕩混勻271020min，6500rmin離心

50、20 min，棄去細胞和細胞碎片，吸取上清液以 022 m濾膜過濾即得較純的噬菌體液，4保存。同時，用不加噬菌體的細菌做培養(yǎng)對照。12 噬菌體的檢測：在無菌操作臺上，取01 mL細菌增菌液于LB培養(yǎng)基上，涂布，待干燥 后，取008 mL噬菌體液分滴滴于其上，待干燥后，倒置于37溫箱培養(yǎng)過夜后觀察結(jié)果。如果原液內(nèi)有噬菌體存在，則在滴加原液處無菌生長，呈蠶食狀的空斑，即噬菌斑。若無噬菌斑出現(xiàn)，則表示無噬菌體。13 噬菌體滴度測定：用SM 緩沖液將噬菌體原液分別稀釋成原濃度的101107 倍，分別吸取7個不同稀釋度的噬菌體各10l與190l增菌液混合，然后加入到盛有4550 mL且保溫約4550的半

51、固體上層培養(yǎng)基（0.7%瓊脂）試管中，混勻倒入固體瓊脂平板（1.5%瓊脂）上制成雙層平板，待上層培養(yǎng)基凝固后，倒置，37培養(yǎng)過夜。隨后，計算不同平板上噬菌斑，滴度計算公式為：滴度(PFUm1)噬斑數(shù)稀釋倍數(shù)10014 噬茵體的保存： 加入少量氯仿后，4 可保存噬菌體數(shù)年。另外，室溫、4 及液氮對噬菌體的保存與低溫凍干后4 冰箱保存的經(jīng)典方法之間并無明顯差別。2 需注意的問題（1） SM液配制方法：NaCl 5.8g，MgSO47H2O 2g，1M TrisHCL（PH7.5）50ml，2%明膠 5ml，加ddH2O 至1000ml。15lbf/in2高壓滅菌20min。（2） 噬菌體和細菌的混

52、合比例即感染指數(shù)：Multiplicity of infection (MOF): 0.01-0.1（3）防止傳導過程中，噬菌體對細菌溶原化。在噬菌體吸附與細菌后加入1ml LB培養(yǎng)過程中可加入10mM EGTA。另外，在篩選平板中也加入10mM EGTA。由于EGTA可鰲合鈣離子，而鈣離子是噬菌體吸附細菌必要離子。28附錄附錄: :培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑1 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液1.1 成分磷酸二氫鉀（KH2PO4） 34.0 g蒸餾水 500 mLpH 7.21.2 制法貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH

53、，用蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液 1.25 mL，用蒸餾水稀釋至 1 000 mL，分裝于適宜容器中，121 高壓滅菌 15 min。2 無菌生理鹽水無菌生理鹽水2.1 成分氯化鈉 8.5 g蒸餾水 1 000 mL2.2 制法稱取 8.5氯化鈉溶于 1 000 mL 蒸餾水中，121 高壓滅菌 15 min。3 3 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LSTLST）肉湯）肉湯3.1 成分胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g氯化鈉 5.0 g乳糖 5.0 g磷酸氫二鉀（K2HPO4） 2.75 g磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2.75 g月桂基硫酸鈉 0.1 g蒸

54、餾水 1 000 mLpH 6.80.23.2 制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié) pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 高壓滅菌15 min。4 1 mol/L NaOH4.1 成分NaOH 40.0 g蒸餾水 1000 mL294.2 制法稱取40 g氫氧化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 高壓滅菌15 min。5 1 mol/L HCl5.1 成分HCl 90 mL蒸餾水 1 000 mL5.2 制法移取濃鹽酸90 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，121 高壓滅菌15 min。6 GN增菌液增菌液6.1 成分 (配置1000ml)胰蛋白胨 20g葡萄糖 1

55、g磷酸氫二鉀（K2HPO4） 1.5 g磷酸二氫鉀（KH2PO4） 4g甘露醇 2g枸櫞酸鈉 5g去氧膽酸鈉 0.5g氯化鈉 5gpH 7.0將上述成分溶解于1000ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH, 121 高壓滅菌15 min。7 7 伊紅美藍瓊脂伊紅美藍瓊脂(EMB)(EMB) (配置1000ml)蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氫二鉀 2g瓊脂 15g伊紅 0.4g美藍 0.065gpH值7.1 0.2將上述成分溶解于1000ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH, 121 高壓滅菌15 min。8 8 葡萄糖蛋白胨水葡萄糖蛋白胨水葡萄糖 0.5g蛋白胨 0.5gK2HPO4 0.2g，水 100 ml，pH 7

56、.2-7.4 9 三糖鐵（三糖鐵（TSI）瓊脂）瓊脂9.1 成分蛋白胨 20.0 g牛肉膏 5.0 g乳 糖 10.0 g蔗 糖 10.0 g葡萄糖 1.0 g硫酸亞鐵銨（含6 個結(jié)晶水） 0.2 g30酚 紅 0.025 g 或5.0 g/L 溶液 5.0 mL氯化鈉 5.0 g硫代硫酸鈉 0.2 g瓊 脂 12.0 g蒸餾水 1 000 mLpH 7.40.29.2 制法除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400 mL 蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。另將瓊脂加入600 mL蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑，混勻，分裝試管，每管約2 mL4 mL，高壓滅菌121 10 mi

57、n 或115 15 min，滅菌后置成高層斜面，呈桔紅色。1010 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑10.1 蛋白胨水蛋白胨（或胰蛋白胨） 20.0 g氯化鈉 5.0 g蒸餾水 1 000 mLpH 7.40.2將上述成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝小試管,121 高壓滅菌15 min。10.2 靛基質(zhì)試劑10.2.1 柯凡克試劑：將5 g 對二甲氨基甲醛溶解于75 mL 戊醇中,然后緩慢加入濃鹽酸25 mL。10.2.2 歐-波試劑：將1 g 對二甲氨基苯甲醛溶解于95 mL95乙醇內(nèi)。然后緩慢加入濃鹽酸20mL。10.3 試驗方法挑取小量培養(yǎng)物接種,在36 1 培養(yǎng)1 d

58、2 d，必要時可培養(yǎng)4 d5 d。加入柯凡克試劑約0.5 mL，輕搖試管,陽性者于試劑層呈深紅色；或加入歐-波試劑約0.5 mL，沿管壁流下，覆蓋于培養(yǎng)液表面,陽性者于液面接觸處呈玫瑰紅色。注：蛋白胨中應含有豐富的色氯酸。每批蛋白胨買來后，應先用已知菌種鑒定后方可使用。11 7.5%氯化鈉肉湯氯化鈉肉湯11.1 成分蛋白胨 10.0 g牛肉膏 5.0 g氯化鈉 75 g蒸餾水 1 000 mLpH 7.411.2 制法將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，每瓶225 mL，121 高壓滅菌15 min。12 血瓊脂平板血瓊脂平板12.1 成分豆粉瓊脂（pH7.47.6） 100 mL脫纖維羊血（

59、或兔血） 5 mL10 mL12.2 制法加熱溶化瓊脂，冷卻至50 ，以無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，傾注平板。1313 兔血漿兔血漿31取檸檬酸鈉3.8 g，加蒸餾水100 mL,溶解后過濾，裝瓶，121 高壓滅菌15 min。兔血漿制備：取3.8%檸檬酸鈉溶液一份，加兔全血四份，混好靜置 (或以3000 r/min 離心30 min)，使血液細胞下降，即可得血漿14 營養(yǎng)瓊脂小斜面營養(yǎng)瓊脂小斜面14.1 成分蛋白胨 10.0 g牛肉膏 3.0 g氯化鈉 5.0 g瓊脂 15.0 g20.0 g蒸餾水 1 000 mLpH 7.27.414.2 制法將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入1

60、5%氫氧化鈉溶液約2 mL調(diào)節(jié)pH至7.27.4。加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化，分裝13 mm130 mm管，121 高壓滅菌15 min。15 革蘭氏染色液革蘭氏染色液15.1 結(jié)晶紫染色液15.1.1 成分結(jié)晶紫 1.0 g95乙醇 20.0 mL1草酸銨水溶液 80.0 mL15.1.2 制法將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。15.2 革蘭氏碘液15.2.1 成分碘 1.0 g碘化鉀 2.0 g蒸餾水 300 mL15.2.2 制法將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300 mL。15.3 沙黃復染液15.3.1 成分沙黃 0.25 g