制藥工程專業(yè)微生物實驗講義

1、實驗1: 顯微鏡的使用及細(xì)菌形態(tài)的觀察（2學(xué)時）目的要求(1) 熟悉普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及各部分的功能。(2) 學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。1. 基本原理顯微鏡由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。ß 油鏡物鏡的基本原理微生物學(xué)研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡（16mm，10×）、高倍物鏡（4mm，4045×）和油鏡（18 mm，95100×）三種。油鏡通常標(biāo)有黑圈或紅圈，也有的以“OI字樣表示，它是三者中放大倍數(shù)最大的。根據(jù)使用不同放大倍數(shù)的目鏡，可使被檢物體放大10002 000多倍。油鏡的焦距和工作距離（標(biāo)本在焦點上看得最清晰時，物鏡與樣品之間的

2、距離）最短，光圈則開得最大，因此，在使用油鏡觀察時，鏡頭離標(biāo)本十分近，需特別小心。使用時，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=152，與玻璃相同。當(dāng)光線通過載玻片后，可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系，當(dāng)光線通過玻片后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這樣就減低了視野的照明度。利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數(shù)值孔徑，因為顯微鏡的放大效能是由其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。所謂數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡口角）的一半正弦，乘上玻片與物

3、鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，可用下列公式表示：NAn·sin式中 NA=數(shù)值孔徑；n=介質(zhì)折射率；=最大入射角的半數(shù)，即鏡口角的半數(shù)。因此，光線投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大（圖-5），該角度的大小決定于物鏡的直徑和焦距。同時，的理論限度為90°，sin90°=1，故以空氣為介質(zhì)時（n=1），數(shù)值孔徑不能超過1，如以香柏油為介質(zhì)時，則n增大，其數(shù)值孔徑也隨之增大。如光線入射角為120°，其半數(shù)的正弦為sin60°=087，則：以空氣為介質(zhì)時：NA=1×087=087以水為介質(zhì)時：NA=133×087=115以香柏油

4、為介質(zhì)時：NA=152×087=132顯微鏡的分辨力是指顯微鏡能夠辨別兩點之間最小距離的能力。它與物鏡的數(shù)值孔徑成正比，與光波長度成反比。因此，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，光波波長越短，則顯微鏡的分辨力愈大，被檢物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)也愈能明晰地區(qū)別出來。因此，一個高的分辨力意味著一個小的可分辨距離，這兩個因素是成反比關(guān)系的，通常有人把分辨力說成是多少微米或納米，這實際上是把分辨力和最小分辨距離混淆起來了。顯微鏡的分辨力是用可分辨的最小距離來表示的。式中=光波波長。我們?nèi)庋鬯芨惺艿墓獠ㄆ骄L度為055m，假如數(shù)值孔徑為065的高倍物鏡，它能辨別兩點之間的距離為042m。而在042m以下的兩點之間的

5、距離就分辨不出，即使用倍數(shù)更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用數(shù)值孔徑更大的物鏡，增加其分辨力才行。例如用數(shù)值孔徑為125的油鏡時，能辨別兩點之間的因此，我們可以看出，假如采用放大率為40倍的高倍物鏡（NA=065），和放大率為24倍的目鏡，雖然總放大率為960倍，但其分辨的最小距離只有042m。假如采用放大率為90倍的油鏡（NA=125），和放大率為9倍的目鏡，雖然總的放大率為810倍，但卻能分辨出022m間的距離。2. 材料及器材顯微鏡、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、各種細(xì)菌微生物制片標(biāo)本、吸水紙、紗布、瓷盤、酒精燈、接種工具、打火機(jī)、試劑瓶、牙簽等。3. 方法與步驟(1

6、) 觀察前的準(zhǔn)備A. 置顯微鏡于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約34cm。鏡檢者姿勢要端正，一般用左眼觀察，右眼便于繪圖或記錄，兩眼必須同時睜開，以減少疲勞，亦可練習(xí)左右眼均能觀察。B. 調(diào)節(jié)光源，對光時應(yīng)避免直射光源，因直射光源影響物像的清晰，損壞光源裝置和鏡頭，并刺激眼睛。如陰暗天氣，可用日光燈或顯微鏡燈照明。調(diào)節(jié)光源時，先將光圈完全開放，升高聚光鏡至與載物臺同樣高，否則使用油鏡時光線較暗。然后轉(zhuǎn)下低倍鏡觀察光源強(qiáng)弱，調(diào)節(jié)反光鏡，光線較強(qiáng)的天然光源宜用平面鏡；光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡。在對光時，要使全視野內(nèi)為均勻的明亮度。凡檢查染色標(biāo)本時，光線應(yīng)強(qiáng)；檢查未染色標(biāo)本時，光線不

7、宜太強(qiáng)?？赏ㄟ^擴(kuò)大或縮小光圈、升降聚光器、旋轉(zhuǎn)反光鏡調(diào)節(jié)光線。(2) 低倍鏡觀察找目的物(3) 高倍鏡觀察將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，在轉(zhuǎn)換物鏡時，需用眼睛在側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后由目鏡觀察，并仔細(xì)調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜，同時用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒至物像出現(xiàn)后，再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至物像清晰為止，找到最適宜觀察的部位后，將此部位移至視野中心，準(zhǔn)備用油鏡觀察。(4) 油鏡觀察A. 用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒提起約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。B. 在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。C. 從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標(biāo)本相接，應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)本上，更不可用

8、力過猛，否則不僅壓碎玻片，也會損壞鏡頭。D. 從接目鏡內(nèi)觀察，進(jìn)一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現(xiàn)物像為止，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如油鏡已離開油面而仍未見物像，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作至物像看清為止。E. 用同樣的方法觀察枯草芽孢桿菌染色標(biāo)本。F. 觀察完畢，上旋鏡筒。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。G. 將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。同時把聚光鏡降下，以免

9、接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險。4. 實驗作業(yè)(1) 分別繪出你在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的狀態(tài)，包括在三種情況下視野中的變化，同時注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。(2) 在使用高倍鏡和油鏡進(jìn)行調(diào)焦時，應(yīng)將鏡筒徐徐上升還是下降？為什么？(3) 用油鏡觀察時，為什么要在載玻片上滴加香柏油？實驗2: 細(xì)菌的革蘭氏染色（2學(xué)時）1. 目的要求(1) 學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)，掌握細(xì)菌的革蘭氏染色方法。(2) 鞏固顯微鏡的使用方法。2. 基本原理所謂單染色法是利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。此法操作簡便，適用于菌體一般形態(tài)的觀察。在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)

10、胞通常帶負(fù)電荷，所以常用堿性染料進(jìn)行染色。堿性染料并不是堿，和其他染料一樣是一種鹽，電離時染料離子帶正電，易與帶負(fù)電荷的細(xì)菌結(jié)合而使細(xì)菌著色。例如，美藍(lán)（亞甲藍(lán)）實際上是氯化亞甲藍(lán)鹽（縮寫為MBC），它可被電離成正、負(fù)離子。帶正電荷的染料離子可使細(xì)菌細(xì)胞染成藍(lán)色。常用的堿性染料除美藍(lán)外，還有結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、番紅（又稱沙黃）等。細(xì)菌體積小，較透明，如未經(jīng)染色常不易識別，而經(jīng)著色后，與背景形成鮮明的對比，使易于在顯微鏡下進(jìn)行觀察。革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱

11、為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。3、材料及器材(1) 載玻片，接種環(huán)，雙層瓶，

12、生理鹽水，嗜堿性美藍(lán)染色液，石炭酸復(fù)紅染色液；顯微鏡、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、吸水紙、紗布、瓷盤、酒精燈、接種工具、打火機(jī)、試劑瓶、牙簽等、培養(yǎng)箱、滅菌鍋、革蘭氏染色液。(2) 白萄球菌，枯草芽孢桿菌菌種、大腸桿菌菌種、金黃色葡萄球菌菌種、乳酸菌種4 方法與步驟A、革蘭氏染色(1) 涂片將培養(yǎng)1416小時的枯草芽孢桿菌和培養(yǎng)24小時的大腸桿菌分別作涂片（注意涂片切不可過于濃厚），干燥、固定。固定時通過火焰12次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。(2) 初染 加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。(3) 媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。(4) 脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背

13、景，用95酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約2030秒鐘，立即用水沖凈酒精。(5) 復(fù)染 用番紅液染12分鐘，水洗。(6) 鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。(7) 同法在一載玻片上以大腸桿菌與枯草芽孢桿菌混合制片，作革蘭氏染色對比。革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。5、實驗作業(yè)(1) 在你所作的革蘭氏染色制片中，大

14、腸桿菌和枯草芽孢桿菌各染成何色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌？(2) 作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？(3) 當(dāng)你對一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？(4) 繪圖實驗3：細(xì)菌的芽孢染色（2學(xué)時）1. 目的要求學(xué)習(xí)并掌握芽孢染色法。觀察細(xì)菌的鞭毛2. 基本原理芽孢染色法是利用細(xì)菌的芽孢和菌體對染料的親合力不同的原理，用不同染料進(jìn)行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當(dāng)先用一弱堿性染料，如孔雀綠或堿性品紅在加熱條件下進(jìn)行染色時，此染料不僅可以進(jìn)入菌體，而且也可以進(jìn)入芽孢，進(jìn)入

15、菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出，若再用復(fù)染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。3. 材料及器材(1) 枯草芽孢桿菌，蠟狀芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌、鞭毛菌裝片(2) 孔雀綠染液，番紅水溶液，苯酚品紅溶液，黑色素溶液等。載玻片，接種環(huán)，雙層瓶，生理鹽水，嗜堿性美藍(lán)染色液，石炭酸復(fù)紅染色液；顯微鏡、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、吸水紙、紗布、瓷盤、酒精燈、接種工具、打火機(jī)、試劑瓶、牙簽等、培養(yǎng)箱、滅菌鍋、革蘭氏染色液。4. 方法與步驟方法1、（1） 將培養(yǎng)24小時左右的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌，作涂片、干燥、固定。（2） 滴加35滴孔雀綠染液于已固定的

16、涂片上。（3） 用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時可添加少許染液。加熱時間從染液冒蒸汽時開始計算約45分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約76）染10分鐘。（4） 傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。（5） 用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗。（6） 待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。觀察細(xì)菌的鞭毛裝片。5. 實驗作業(yè)結(jié)果繪圖表示你觀察到的兩種芽孢桿菌的芽孢在形狀、大小、著生位置上有什么不同？繪鞭毛菌圖實驗4: 放線菌、酵母菌和霉菌的形態(tài)觀察（2學(xué)時）1. 目的要求掌握觀察放線菌、酵母菌和霉菌形態(tài)的基本方法，并觀察其形態(tài)特

17、征。2. 基本原理酵母菌是多形的、不運(yùn)動的單細(xì)胞微生物，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)已有明顯的分化，菌體比細(xì)菌大。繁殖方式也較復(fù)雜，無性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母屬是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通過接合產(chǎn)生子囊孢子。本實驗通過用美藍(lán)染色制成水浸片，和水-碘水浸片來觀察生活的酵母形態(tài)和出芽生殖方式。美藍(lán)是一種無毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的，而還原型是無色的，用它來對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色，由于細(xì)胞中新陳代謝的作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以酵母的活細(xì)胞無色，而對于死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。因此，用美藍(lán)水

18、浸片不僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細(xì)胞。但美藍(lán)的濃度、作用時間等均有影響，應(yīng)加注意。霉菌菌絲較粗大，細(xì)胞易收縮變形，而且孢子很容易飛散，所以制標(biāo)本時常用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。此染色液制成的霉菌標(biāo)本片其特點是：(a)細(xì)胞不變形；(b)具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長時間；(c)溶液本身呈藍(lán)色，有一定染色效果。霉菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)，常用載玻片觀察，此法是接種霉菌孢子于載玻片上的適宜培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后用顯微鏡觀察。此外，為了得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)還可利用玻璃紙透析培養(yǎng)法進(jìn)行觀察。此法是利用玻璃紙的半透膜特性及透光性，將霉菌生長在覆蓋于瓊脂培養(yǎng)基表面的玻璃紙上，然后將

19、長菌的玻璃紙剪取一小片，貼放在載玻片上用顯微鏡觀察。放線菌的插片培養(yǎng)法：放線菌的菌絲沿蓋玻片生長，可清楚觀察菌絲呈管狀，孢子絲的形態(tài) 3、材料及器材(1) 曲霉，青霉，根霉，毛霉、5406放線菌培養(yǎng)物及裝片(2) 乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，查氏培養(yǎng)基平板，馬鈴薯培養(yǎng)基；顯微鏡，載玻片，接種環(huán)，雙層瓶，生理鹽水，、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、吸水紙、紗布、瓷盤、酒精燈、接種工具、打火機(jī)、試劑瓶、牙簽等、培養(yǎng)箱、滅菌鍋、冰箱、超凈工作臺、蓋玻片等4、方法與步驟放線菌的觀察：在載玻片上滴一滴香柏油-抽出培養(yǎng)好的蓋玻片-檫凈背面-放在玻片上-低倍鏡下找一條白白的粉線-高倍鏡下觀察。 在高倍鏡下觀察放線菌裝片。

20、霉菌的觀察于潔凈載玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液-用解剖針從霉菌菌落的邊緣處取小量帶有孢子的菌絲置染色液中，再細(xì)心地將菌絲挑散開-小心地蓋上蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡-置顯微鏡下先用低倍鏡觀察，必要時再換高倍鏡。 在低倍鏡或高倍鏡下觀察霉菌裝片。5、 實驗作業(yè)(1) 繪圖說明你所觀察到的霉菌形態(tài)特征、放線菌的形態(tài)(2) 比較細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌形態(tài)上的異同 實驗5: 培養(yǎng)基的配制和高壓蒸汽滅菌（2學(xué)時）1. 目的要求3、 了解培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過程。4、 了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。5、 熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關(guān)準(zhǔn)備工作及操作

21、方法。2. 基本原理培養(yǎng)基是人工地將多種物質(zhì)按各種微生物生長的需要配制而成的一種混合營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)或分離各種微生物。因此，營養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)當(dāng)有微生物所能利用的營養(yǎng)成分（包括碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長因素）和水。根據(jù)微生物的種類和實驗?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。3. 材料及器材(1) 藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、馬鈴薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O等。(2) 高壓蒸汽滅菌器、恒溫干熱滅菌箱、細(xì)菌過濾器、紫外線殺菌燈、其它：天平、牛角匙、電爐、1N HCl、1N NaOH、pH試紙、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、帶

22、玻璃珠的三角瓶、帶棉塞的無菌試管、無棉塞的空試管、培養(yǎng)皿、吸管、各種包裝紙、防水紙、繩索、棉花、標(biāo)簽、試管架、扎線、橡皮筋、記號筆、紗布等4. 方法與步驟(1) 培養(yǎng)基的配制：A. 培養(yǎng)基的種類據(jù)組成成分可分為：合成培養(yǎng)基：由各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成。半合成培養(yǎng)基：有一部分純化學(xué)物質(zhì)和另一部分天然物質(zhì)配制而成。天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機(jī)物配制而成。從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為：液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2%左右的凝固劑的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基或農(nóng)副產(chǎn)品培養(yǎng)基。半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.5-1%凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。常用凝固劑為瓊脂（

23、其次為明膠）B. 培養(yǎng)基的配制方法和步驟稱量：按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解調(diào)pH值：用1N NaOH或1N HCl調(diào)pH，用pH試紙對照加瓊脂溶化：加熱過程中要不斷攪拌，可適當(dāng)補(bǔ)水分裝：注意不要污染棉塞包扎成捆，掛上標(biāo)簽，注明何種培養(yǎng)基滅菌備用：培養(yǎng)基滅菌后必須在370C下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長，方可使用 (2) 分離培養(yǎng)微生物常用器皿的準(zhǔn)備：清洗一些玻璃儀器：如三角燒瓶、試管、培養(yǎng)皿、吸管等棉塞的制作及包裝培養(yǎng)皿和吸管等(3) 加壓蒸汽滅菌法其步驟如下:接通電源，進(jìn)行加熱。排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待排出大氣后關(guān)閉排氣

24、閥。當(dāng)壓力達(dá)15bl/in2（即1.05kg/cm2）時，此時滅菌器內(nèi)的溫度為1210C，維持20min。對熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物時，應(yīng)適當(dāng)降低壓力，延長時間。滅菌時間一到，切斷電源，待壓力降至零時，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品。(4) 培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法間歇滅菌法:待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，連續(xù)3d重復(fù)進(jìn)行。在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養(yǎng)基）放在370C恒溫條件下培養(yǎng)過夜，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，以便下次蒸煮時殺滅。5. 實驗作業(yè)(1) 固體培養(yǎng)基加瓊脂后加熱溶化時要注意哪些問題？(2) 培

25、養(yǎng)基中加瓊脂的作用是什么？(3) 干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和間歇滅菌的場合有何不同？(4) 如何檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底？實驗6: 理化因素對微生物的影響（2學(xué)時）1. 目的要求了解紫外線、化學(xué)試劑、抗生素的殺菌作用2. 基本原理各種外界因素如紫外線、化學(xué)試劑、抗生素對微生物的生長有抑制甚至殺滅作用。紫外線具有殺菌能力，但穿透力不強(qiáng)。許多化學(xué)試劑能使蛋白質(zhì)變性、妨礙代謝中某些重要酶的活力或損毀細(xì)胞膜等?？股啬苓x擇性的妨礙細(xì)菌代謝過程中某一或幾個環(huán)節(jié)。3. 材料及器材菌種：大腸桿菌、葡萄球菌培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基試劑：碘伏、過氧乙酸，、龍膽紫、84消毒液、青霉素、慶大霉素、HgCL2其它：星形黑色

26、亮光紙片、無菌濾紙片、鑷子、無菌棉簽、紫外燈、接種箱4. 方法與步驟紫外線用棉簽蘸取菌液致密接種于營養(yǎng)瓊脂平板上。把鑷子在火焰上迅速通過23次以殺滅其表面雜菌，鑷取“H”或“五角形”黑紙片貼于培養(yǎng)基的中央。打開平皿蓋，至于紫外燈管下直接照射30min。揭去黑紙片，把紙片丟棄于消毒缸內(nèi)。蓋好皿蓋，2837培養(yǎng)1824h后觀察結(jié)果?？梢姷脚囵B(yǎng)基上出現(xiàn)與黑紙片形狀相同的“H”或“五角形”菌苔，其余部分沒有細(xì)菌生長?；瘜W(xué)試劑用棉簽蘸取菌液致密接種于營養(yǎng)瓊脂平板上。用無菌鑷子夾取4個圓形無菌濾紙片，分別浸于碘伏、過氧乙酸、龍膽紫、84消毒液內(nèi)，再一一取出，分別放在已接有細(xì)菌的平板上，各紙片間距離大小大致

27、相等。2837培養(yǎng)1824h后觀察各消毒紙片周圍有無抑菌圈，并比較抑菌圈大小?？股赜妹藓灧謩e蘸取兩種菌液接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，一個平板接種一種菌。用無菌鑷子夾取2個圓形無菌濾紙片，分別浸于青霉素、慶大霉素內(nèi)，再一一取出，分別放在已接有細(xì)菌的平板上，各紙片間距離大小大致相等。2837培養(yǎng)1824h后觀察結(jié)果，測量抑菌圈直徑。5. 實驗作業(yè)記錄抑菌圈大小青霉素鏈霉素碘酒過氧乙酸龍膽紫HgCI2大腸桿菌mmmmmmmmmmmm葡萄球菌mmmmmmmmmmmm附錄1： 染色液的配制一、呂氏(Loeffler)堿性美藍(lán)染液 A液：美藍(lán)(methylene blue) 06g95%酒精 30mlB液：K

28、OH 001g蒸餾水 100ml分別配制A液和B液，配好后混合即可。二、齊氏(Ziehl)石炭酸復(fù)紅染色液 A液：堿性復(fù)紅(basic fuchsin) 03g95%酒精 10mlB液：石炭酸 50g蒸餾水 95ml將堿性復(fù)紅在研缽中研磨后，逐漸加入95%酒精，繼續(xù)研磨使其溶解，配成A液。將石炭酸溶解于水中，配成B液?；旌螦液及B液即成。通常可將此混合液稀釋510倍使用，稀釋液易變質(zhì)失效，一次不宜多配。三、革蘭氏(Gram)染色液 1草酸銨結(jié)晶紫染液A液：結(jié)晶紫(crystal violet) 2g95%酒精 20mlB液：草酸銨(ammonium oxalate) 08g蒸餾水 80ml混合

29、A、B二液，靜置48小時后使用。2盧戈氏(Lugol)碘液碘片 10g碘化鉀 20g蒸餾水 300ml先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加足水分。395%的酒精溶液。4番紅復(fù)染液番紅(safranine O) 25g95%酒精 100ml取上述配好的番紅酒精溶液10ml與80ml蒸餾水混勻即成。四、芽孢染色液 1孔雀綠染液孔雀綠(malachite green) 5g蒸餾水 100ml2番紅水溶液番紅 05g蒸餾水 100ml3苯酚品紅溶液堿性品紅 11g無水酒精 100ml制法取上述溶液10ml與100ml5%的苯酚溶液混合，過濾備用。4黑色素(nigrosi

30、n)溶液水溶性黑色素 10g蒸餾水 100ml稱取10g黑色素溶于100ml蒸餾水中，置沸水浴中30分鐘后，濾紙過濾二次，補(bǔ)加水到100ml，加05ml甲醛，備用。五、莢膜染色液1黑色素水溶液黑色素 5g蒸餾水 100ml福爾馬林(40%甲醛) 05ml將黑色素在蒸餾水中煮沸5分鐘，然后加入福爾馬林作防腐劑。2番紅染液與革蘭氏染液中番紅復(fù)染液相同。六、鞭毛染色液 A液：單寧酸 5gFeCl3 15g蒸餾水 100ml福爾馬林(15%) 20mlNaOH(1%) 10ml配好后，當(dāng)日使用，次日效果差，第三日則不宜使用。B液：AgNO3 2g蒸餾水 100ml待AgNO3溶解后，取出10ml備用，

31、向其余的90mlAgNO3中滴入濃NH4ON，使之成為很濃厚的懸浮液，再繼續(xù)滴加NH4OH，直到新形成的沉淀又重新剛剛?cè)芙鉃橹埂Ｔ賹溆玫?0mlAgNO3慢慢滴入，則出現(xiàn)薄霧，但輕輕搖動后，薄霧狀沉淀又消失，再滴入AgNO3，直到搖動后仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀為止。如所呈霧不重，此染劑可使用一周，如霧重，則銀鹽沉淀出，不宜使用。九、乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液石炭酸 10g乳酸(比重121) 10ml甘油 20ml蒸餾水 10ml棉藍(lán)002g將石炭酸加在蒸餾水中加熱溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉藍(lán)，使其溶解即成。 附錄2 ： 培養(yǎng)基 1、牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏0.3克 ，蛋白胨1.0克，氯化鈉 0.5克，瓊脂 1.5克，水 100毫升在燒杯內(nèi)加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉，用蠟筆在燒杯外作上記號后，放在火