2019年無載體固定化酶的生物催化

1、【綜述】無載體固定化幅的生物催化Ulrich Roessl Jozef Nahalka Bernd Nidetzky摘要首先回顧無載體不溶性酶的制備方法。交聯(lián)酶聚集體技術(shù)現(xiàn)已用于大量的合 成反應(yīng)。在沉淀和交聯(lián)所需但具有潛在致變性化學(xué)品缺失的情況下，融合蛋白會將目的酶的相對選擇性聚集體或甚至其自組系統(tǒng)轉(zhuǎn)為不溶性微粒，因而具有強勁的發(fā)展動力。在選定的生物轉(zhuǎn)化中，用于多輪間歇式反應(yīng)不溶蛋白顆粒的回收已 經(jīng)得到論證。然而，對于全連續(xù)生物催化過程應(yīng)用來說，低耐機械應(yīng)力和高壓縮性依然是無載體酶顆粒所需要考慮的問題。關(guān)鍵詞：生物催化；無載體；固定化；交聯(lián)酶聚集體；下拉域；自組系統(tǒng)引言不溶性酶制劑對于工業(yè)生物

2、轉(zhuǎn)化是一種有用的催化劑。與可溶性酶相比，不溶性酶更易于分離和循環(huán)利，且有利于連續(xù)過程的開發(fā)，因此往往是規(guī)?；a(chǎn) 操作過程的首選催化劑（Buchholz等，2005; Bommarius和Riebel, 2005）。原 本可溶性的酶通常將其附著在不溶性載體的表面，使其成為不可溶性酶，這個過程稱為固定化（Cao等，2003; Cao, 2005; Sheldon, 2007a）。由于不同的可用 載體和各種固定化策略，因此固定化方法在一般程序的基礎(chǔ)上衍發(fā)展了許多其他 方法（Cao等，2003; Cao, 2005）。將酶包埋在有機凝膠（Buchholz等，2005; Cao, 2005）或無機凝膠

3、（Betancor和Luckarift, 2008）中，成為對載體介導(dǎo)周 定化酶的一種特殊模式。關(guān)于載體約束不溶性酶，一個經(jīng)常被提及的問題是，與 基本制劑相比，其特異活性降低，但在可操作條件下可以提高其壽命和穩(wěn)定性。 盡管最近有一些相關(guān)方面的顯著成果（Hanefeld等，2009）,但現(xiàn)在依然不清楚 固定化酶活性和穩(wěn)定性增加或減少的分子依據(jù)?？上У氖牵瑸閮?yōu)化催化性能而對 酶固定化進行設(shè)計時，在很大程度依然依靠經(jīng)驗經(jīng)驗（Sheldon, 2007a）。固定化不溶性酶還有兩個主的要缺點。大量的非催化物質(zhì)（大約占生物催化劑總量的90%被應(yīng)用于固定化酶反應(yīng)器，但是當(dāng)所采用的酶特異活性很低的時 候，就可

4、能產(chǎn)生很嚴(yán)重的問題；止匕外，所采用的載體通常比要固定的酶價格更昂 貴。因此，如果將酶沉淀制成不溶性顆粒，并且能很好地保留可溶性酶的特異活 性，同時能有效地應(yīng)對機械應(yīng)力，這樣就可以獲得異種生物催化劑， 而由固體載 體產(chǎn)生的難題也可已部分消除。本文綜述了無載體固定化酶方法的最新研究進 展。根據(jù)酶蛋白聚合過程中生物的識別和特異性，對所報道的的方法進行區(qū)分。交聯(lián)酶聚集體制備固體制劑主要通過沉淀或結(jié)晶的方法。 通常與雙功能試劑相連接，如戊 二醛，以使得在應(yīng)用中來穩(wěn)定不溶物，使之處于懸浮狀態(tài)。交聯(lián)酶晶體和聚集體 已廣泛地成功應(yīng)用與生物催化。交聯(lián)酶晶體方法（CLECS,出現(xiàn)于20世紀(jì)60年代（Quiocho

5、和Richards, 1964）,已經(jīng)應(yīng)用到有限幾種酶上，包括核糖核酸酶A,枯草桿菌酶，竣肽酶，乙醇脫氫酶及一些脂肪酶（Cao等，2003）。CLECS寸于由加熱、有機溶劑和蛋白 質(zhì)水解引起的變性，通常表現(xiàn)出良好的抗性（Sheldon, 2007b）。在某些情況下， 可以通過改變結(jié)晶和交聯(lián)的條件，來調(diào)節(jié)結(jié)晶大小和剩余特異活性（ Margolin, 1996年）。通過鼻疽菌脂肪酶已經(jīng)表明，以表面活性劑或B-環(huán)糊精為CLECs涂層，可以進一步提高酶使用壽命和操作穩(wěn)定性（ Rajan和Abraham, 2008年）。 當(dāng)前CLEC技術(shù)使用范圍主要受到（純）酶成功結(jié)晶需求的限制。不溶性催化劑也可以在溶

6、液中直接交聯(lián)進行制備（CLEs）。但是由此產(chǎn)生的 酶制劑很難處理，并且具有機械不穩(wěn)定性。沉淀要求許多工藝參數(shù)的微妙平衡（蛋 白質(zhì)和交聯(lián)劑濃度、pH值、溫度、離子強度、混合等），因此通常是不可再現(xiàn)的 （Cao等，2003）。認(rèn)識到CLECs和CLEs的局限性后，Cao等人（2000年）提出交聯(lián)酶聚集 體技術(shù)，并對其進行商業(yè)化（）。原本的縮寫CLEA,現(xiàn)在也已登記為商標(biāo)名稱。CLEAsft初用于青霉素G?；?，隨后應(yīng)用 于大量其他酶（如脂肪酶，蛋白酶，酰胺酶，酯酶，植酸酶，氧鼠酶）。制備CLEAs 的一般程序涉及酶（微）聚集體或多酶結(jié)合體的鹽誘導(dǎo)或溶劑誘導(dǎo)，然后通過化 學(xué)交聯(lián)得到穩(wěn)定的全蛋白沉淀。

7、例如，硫酸錢，叔丁基酒精或聚乙二醇有助于引 起青霉素G酰化酶的聚集。同樣根據(jù)所采用的特定酶要求，交聯(lián)試劑也會有所不 同（Mateo等，2004; Kuba'c等，2008）,但最常用的還是戊二醛。CLEAs很適 合于有機溶劑中的生物催化（Cao等，2000）。兩種或更多的酶原則上可以共同 聚合，形成所謂的CLEAs化合物（Mateo等，2006）。含有果膠酶、木聚糖酶和 纖維素酶活性的CLEA玳合物制劑便是一個顯著的成功例子（Dalal等，2007）。 CLEAs化合物可能會成為所需的多用途催化劑，也可能會有助于實現(xiàn)多步生物 催化轉(zhuǎn)化（Va巾adi等，2008）。雖然CLEAs可以不必

8、將所需酶進行結(jié)晶，但仍然有其本身的不足，即對于 每種酶，必須精確建立酶和交聯(lián)劑之間的聯(lián)系。這也就意味著必須作出很大的努 力來用于條件優(yōu)化，如下討論。止匕外，在大多數(shù)情況下，一些粗蛋白需要在沉淀 之前對其進行純化。聚集和交聯(lián)的條件在CLEAs制備過程中,通過高通量實驗有利于不同的相互作用工藝參數(shù)（沉淀劑及其濃度、交聯(lián)劑等）的優(yōu)化（Schoevaart等，2004）。最大程度保持可溶 性酶的特異活性是所需考慮的最主要問題。但是，像結(jié)構(gòu)特性、孔隙率和抗機械應(yīng)力也同等重要（Yu等，2006）。沉淀劑的最適選擇通常要以實驗為依據(jù)，但也 可以利用蛋白質(zhì)純化中長期積累的經(jīng)驗（Bommarius和Riebel

9、, 2005）, 一些研究強調(diào)了 CLEAs制備過程中沉淀劑的重要性（Lo'pez-Serrano等，2002）。雖然高活性小分子戊二醛被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)交聯(lián)，但它通常也會造成酶活性的嚴(yán)重?fù)p失。在使用高濃度戊二醛的時候，這種現(xiàn)象尤其突出（Schoevaart等， 2004）。其原因為必需功能基團的化學(xué)修飾或者由衍生誘導(dǎo)的一般變性，因此在 交聯(lián)過程中通過添加底物或配體可以提供有益的保護。商業(yè)化聚合體聚醛由葡聚 糖氧化得到，長度約100-200kDa,可以用其來替代戊二醛。由青霉素 G?；?（Mateo等，2004）表明，由于存在尺寸排阻，所以與戊二醛相比，右旋糖酊聚 醛對酶的滲透受到限

10、制，酶的活力保持也可能會隨之顯著改善。一些酶在 CLEA 的過程中會因戊二醛的使用而失活，但卻可以通過右旋糖酊聚醛進行成功交聯(lián)， 如乙醇脫氫酶、部分月青水解酶和月青水合酶等（Kuba'c等，2008）。在交聯(lián)過程中，添加牛血清白蛋白（BSA或聚乙烯亞胺有兩個作用，一是 穩(wěn)定酶活性；二是提供與戊二醛反應(yīng)的氨基。有牛血清白蛋白存在的條件下，用 交聯(lián)的方法制備某脂肪酶、青霉素 G酰化酶及漆酶的CLEAH劑，其特異活性和 抗高溫及化學(xué)變性等性能有顯著提高（Shah等，2006; Cabana等，2007）。氨基 戊二?；傅谋砻嫒狈Π被@不利于應(yīng)用“常規(guī)”方法來制備 CLEAs o使用 聚乙

11、烯來提供額外的交聯(lián)的位點，可以得到這種酶的穩(wěn)定CLEAs（ Lo'pez-Gallego 等，2005）。至少對于部分CLEAs來說，其分子大小依然起重要作用，而由此產(chǎn)生的結(jié) 構(gòu)特性與過程優(yōu)化密切相關(guān)。禹等人（2006年）顯示，霍香念珠菌脂肪酶顆粒 CLEAs的最適活性，顆粒直徑約為40-50 lm 0 CLEA的大小控制很困難，因為所 有工藝參數(shù)本質(zhì)上的（可能）影響都必須必須加以考慮。用CO2膨脹逆轉(zhuǎn)膠束來制備樹突狀胰蛋白酶 CLEAs制劑成為當(dāng)前令人感興趣的進展，CO2膨脹逆轉(zhuǎn) 膠束可以由二（2-乙基己基）磺酸鈉和異辛烷進行制備得到（Chen等，2006）。 在提高CO2壓力條件下

12、，逆轉(zhuǎn)膠束中的胰蛋白酶沉淀可以隨后與戊二醛進行交 聯(lián)。由此產(chǎn)生的CLEAs大小在7-38nm之間，并可通過調(diào)節(jié)水/表面活性劑比率 和酶濃度來調(diào)整其大小。在某些例子中，樹突狀 CLEAs特異活性超過了常規(guī)制 備 CLEAs。操作穩(wěn)定性已發(fā)表的有關(guān)CLEAs的著作主要關(guān)注于生物催化在有機合成方面的應(yīng)用 （Sheldon, 2007b）,而CLEAs在其（連續(xù)）過程中的詳細(xì)生物工程分析則比較 欠缺。一些作者們已經(jīng)認(rèn)識到 CLEAs對機械應(yīng)力抵抗力弱的問題，例如采用攪 拌（Khare等，1991; Kim等，2007）。青霉素G?；窩LEAs被包埋在由聚氯 乙烯制備的聚合物基體內(nèi)（Wilson等，2

13、004）,也就是所謂的 LentiKats （Jekel 等，1998）。由此得到的酶制劑在搖動的條件下，在緩沖里相當(dāng)穩(wěn)定（50天），并且在雙氧水（70%的v/V）中抵抗細(xì)菌滋生達(dá)數(shù)百個小時。包埋可導(dǎo)致酶活降 低到自由CLEAs的60% （Wilson等，2004）。另一種穩(wěn)定CLEAW抵對機械應(yīng)力 的方法是將其包埋到分層有序介孔硅膠中。在嚴(yán)格的搖動條件下a-糜蛋白酶和脂肪酶的穩(wěn)定性提高了十倍以上（Kim等，2007）?？傊珻LEAs已經(jīng)在生物催化領(lǐng)域被廣泛認(rèn)知，并證明了其在小規(guī)模有機 合成制備方面的作用。如果進行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，這種技術(shù)將具有廣闊的應(yīng)用范圍， 而且原則上可適用于任何酶。然而還有

14、一點目前尚不清楚，那就是在工業(yè)規(guī)模的 生物轉(zhuǎn)化中，常規(guī)方法準(zhǔn)備的 CLEAs是否足以與載體約束不溶性酶制劑進行競 爭，例如B -內(nèi)酰胺類抗生素的工業(yè)轉(zhuǎn)化。 但CLEAs很適合現(xiàn)有的包埋技術(shù)，這可以使其對于操作壓力因素有更好的抵抗性能。至于將CLEAs應(yīng)用在連續(xù)操作過程的固化床或流化床，這一點還需要在以后進一步論證（ Hara, 2007； Aytar 和Bakir, 2008; Va巾adi等，2008）。某具有熱穩(wěn)定性的 C -內(nèi)酰胺酶CLEAsft近 被應(yīng)用于由毛細(xì)管柱微構(gòu)建的流動微反應(yīng)器（Hickey等，2009）。這個高度微型 化的反應(yīng)體系可應(yīng)用于底物篩選和酶動力學(xué)描述，并且CLEA散

15、反應(yīng)器在連續(xù)過程條件下呈現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性（Hickey等，2009）。微流化反應(yīng)器所包含的固定 化酶也許以CLEAs形式存在，該反應(yīng)器很可能成為有助于生物催化過程開發(fā)的一 般工具（Hickey 等，2007； Thomsen 和 Nidetzky, 2009; Schwarz 等，2009）。選擇性下拉域CLEA生產(chǎn)的一個顯著改善是聚合過程的分子設(shè)計，能夠體現(xiàn)其生物識別和 特異性的原理。這樣不僅不必優(yōu)化酶的沉淀條件，也使得在不溶性蛋白形成過程 中，酶活保持和最終顆粒大小更加易于控制。有些酶在生產(chǎn)重組蛋白的條件下易于聚集（以包涵體形式），一個廣泛應(yīng)用的方法是將其融合到一種高可溶性蛋白，以提高目的

16、蛋白的溶解度。如麥芽糖結(jié)合蛋白（Kapust和Wangh, 1999）,作者建議采用反向途徑來生產(chǎn)酶聚集體。從 概念上講，嵌合蛋白是將目的酶融合到一種低溶解性蛋白，如纖維素結(jié)合的噬纖維桿菌（CcCBM （Naha'lka和Nidetzky, 2007）。蛋白質(zhì)在異源宿主（如大腸桿 菌）中進行表達(dá)，往往會通過CcCBMfr子間的自我聚集來誘導(dǎo)折疊的嵌合蛋白進 行選擇性下拉。當(dāng)然，至于包涵體中的酶具有催化活性， 因此并不是完全沒用的 觀點，這也不是首次提出。Villaverde和Carrio' （2003年）關(guān)于包涵體蛋白質(zhì)沉 積動力學(xué)的重大研究表明，在這種聚集體蛋白中生物功能依然

17、保持的這一現(xiàn)象實 際上是相當(dāng)普遍的。下拉域的首例應(yīng)用是采用來源于三角酵母屬變種（TvDAO ）的二聚體黃素 酶D-氨基酸氧化酶（Naha'lka和Nidetzky, 2007）。CcCBM結(jié)合到酶的N端后， 在大腸桿菌BL21 （DE3）中合成的TvDAO幾乎完全轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)蛋白顆粒。在 相同條件下生產(chǎn)重組蛋白時，酶缺陷型 CcCBM幾乎完全溶解可溶性，這表明下 拉域有效地完成了所預(yù)期的溶解度開關(guān)功能。CcCBM-TvDAO顯示出可溶性純氧化酶的約40%特異活性。氧化酶聚集體的高水平活性之所以顯著的原因主要 有兩個，首先，盡管TvDAO結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，但CcCBM對其折疊和功能影響很?。黄浯?/p>

18、，聚集體的整體催化活性并沒有因傳質(zhì)效應(yīng)而受到嚴(yán)重?fù)p害，或者換句話說，這種不溶性酶更容易接近其底物 D-氨基酸和。2。利用SDS-PAGE分析表明，分 離出的CcCBM-TvDAO制劑主要含目的蛋白。在鼓泡生物反應(yīng)器中進行D-甲硫氨酸轉(zhuǎn)化時，CcCBM-TvDAO 顯示對微晶纖維素的弱親和力，而且實際上比可 溶性氧化酶更加穩(wěn)定。將 CcCBM-TvDAO 包埋會提高其額外穩(wěn)定性（Naha'lka 和 Nidetzky, 2007）。Naha'lka和同他的事已經(jīng)論證了 CcCBM多功能下拉域的范圍。最近他們制 得一些具有催化活性的聚合體，包括麥芽糊精磷酸化酶（焦酚火球菌）（Nah

19、a'lka, 2008）、唾液酸醛縮酶（SAA;大腸桿菌K-12） （Naha'lka等，2008）和聚激酶 （PPK； Silicibacter pomeroyi） （ Naha'lka 和 Patoprsty, 2009）,并且很好地保持 了各自可溶性酶的特異活性（C8%）。CcCBM-SA順?？梢赃M一步包埋到與戊二 醛交聯(lián)穩(wěn)固的海藻酸鈉水凝膠中（Naha'lka等，2008）。不溶性SAA催化劑仍然 具有部分活性（51%）,而且在合成神經(jīng)氨酸的重復(fù)分批生產(chǎn)（20輪轉(zhuǎn)化）中顯 示出很高的操作穩(wěn)定性和良好的回收率。它可以冷凍干燥，并且重新水合后幾乎可以保持全部

20、活性。在這個例子中，其與CcCBM-PPK的共同作用還顯示了目的 酶可選擇性下拉域的另一個重要優(yōu)勢，通過對不溶性蛋白組分的簡單清洗，就可以有效消除大腸桿菌背景對磷酸酶活性的污染（Naha'lka, 2008）。在一份最近與生物催化無關(guān)的研究中,CcCBM被應(yīng)用于制備不同凝集素的功能聚集體（Naha'lka, 2009）。一種酶標(biāo)平板檢測法最近正發(fā)展起來，在這種方法中不溶性凝集素以高通量形式應(yīng)用于糖蛋白識別。在檢測條件下，兩種結(jié)合唾液酸的凝集素之間的CcCBM®合表現(xiàn)呈“粘合”（沉淀）唾液酸化蛋白，這將使得在凝集素 多價結(jié)合發(fā)生時，會有積極的響應(yīng)讀出（Naha'

21、lka, 2009）?？傊?，作為下拉域融合到CcCBM似乎是用來生產(chǎn)不溶性、高活性各種酶聚 集體的一種通用方法。將CcCBM酶非共價吸附于纖維素上有利于從液體中進行 分離（Naha'lka和Nidetzky, 2007）。然而，可能需要更多的加工步驟（包埋、 交聯(lián)）來最終獲得運作穩(wěn)健的生物催化劑。由于在下拉域的控制下，聚集體不可 能提高酶的內(nèi)在穩(wěn)定性。如果極端的工藝條件（如高溫度或高鹽等）不會引起不 必要的降解，應(yīng)用（熱）穩(wěn)定催化劑具有明確的潛在可能性 （Littlechild等，2007）自組系統(tǒng)自組系統(tǒng)以脂類和非天然聚合物而被熟知（Graff等，2004）,對于越來越多 的蛋白質(zhì)來

22、說，自組成不溶性有序結(jié)構(gòu)成為其特點（ Bayley等，2004； Hampp 和Oesterhelt, 2004； Sleytr等，2004）。在嵌合蛋白中，將目的酶融合到具有自 組能力的模塊中，這樣可能得到的酶便于界定，或許是類結(jié)晶交聯(lián)狀態(tài)。自組系 統(tǒng)性能的開發(fā)會實現(xiàn)對酶顆粒大小和形狀相對精確的控制。雖然其他蛋白或肽鏈（從目的酶上分里得到）也為所需要的產(chǎn)物，但在這里不作考慮。融合到細(xì)胞表層蛋白細(xì)胞表層（S-層）是古細(xì)菌和細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中常見的“蛋白隔膜”（Schuster 等，2008）。它們有類格子外觀，是通過自組過程形成的。在懸浮液和不同界面 上，分離得到的天然 S-層蛋白單位能夠再結(jié)晶

23、成為精確的單層形式。S-層蛋白的這些屬性極大地促進了（納米）生物技術(shù)應(yīng)用的范圍（ Sleytr等，2007）。雖 然融合到S-層蛋白被應(yīng)用于蛋白質(zhì)序列開發(fā)（Tang等。2008年）及其他分析目 的（Sleytr等，2007）,但也有一些例子顯示S -層技術(shù)可應(yīng)用于酶固定化和生物 催化劑的開發(fā)。然而，各種 S層融合有一個需要注意的共同特點，即嵌合蛋白 各組份原有功能的保持，也就是指自組系統(tǒng)性能和各自生物活性（ Sleytr等， 2007） 0將嗜熱多糖酶（LamA,焦球菌）融合到芽抱桿菌 S-層蛋白SbpA,在大腸 桿菌中制成不溶性聚集體，可惜的是沒有進行特征化。然而，經(jīng)過化學(xué)展開溶 解和復(fù)性，

24、SbpA LamA融合已成功地固定在不同載體上 （Tschiggerl等，2008）。 脂質(zhì)體具有酶和S-層蛋白自組融合的特征，成為一種獲得潛在有用生物催化劑 的可行性方法。脂質(zhì)體大小易于調(diào)節(jié)，這使得固定化酶制劑的設(shè)計具有靈活性。將1-磷酸-葡萄糖胸甘酸轉(zhuǎn)移酶融合到了嗜熱脂肪地芽抱桿菌S-層蛋白SgsE的C端，Schaffer等（2007年）也證明了不溶性脂質(zhì)體載體催化劑回收的可能性。需要注意的是，在大腸桿菌或其他宿主（釀酒酵母或 HeLa細(xì)胞）中生產(chǎn)S- 層融合蛋白時，通常會產(chǎn)生由胞內(nèi)自組系統(tǒng)或聚集引起的不溶性產(chǎn)物（ Blecha 等，2005）。這些“包涵體”可能會有助于制備無載體不溶性酶

25、。融合到其他骨架蛋白形成高分子量組件的蛋白質(zhì)，已用來顯示不溶性超分子結(jié)構(gòu)表面的催化模 塊。相關(guān)例子有白楊（歐洲山楊）的長 145.8 kDa的應(yīng)激蛋白SP1, SP1構(gòu)成環(huán) 狀同十二基（Wang等，2002）,對極端條件具有高耐性，如低和高 pH高溫（Tm 107C）、有機溶劑和各種蛋白酶（Wang等，2006）。將SP1融合到黑曲霉葡萄糖 氧化酶（Gox）,在大腸桿菌中產(chǎn)生不溶性聚集體結(jié)構(gòu)，因此與天然氧化酶相比， 沉淀酶在本質(zhì)上極大地改善了其穩(wěn)定性。葡萄糖氧化酶 -SP1的非催化物質(zhì)僅占 總顆粒的10% （重量/重量）。將葡萄糖氧化酶-SP1組裝成納米管結(jié)構(gòu)，每管含 有數(shù)百個酶分子（Heym

26、an等，2007）。在在另一正在初步準(zhǔn)備的例子中，南極假絲酵母脂肪酶 B的蛋白顆粒設(shè)計 是將其連接到馬鈴薯病毒衣殼蛋白上（Carette等，2006）。通過在煙草中進行融 合蛋白與原衣殼蛋白的共同表達(dá)來獲得不溶性病毒蛋白， 具顯示出以對硝基苯酚 己酸為底物的酯酶催化活性。融合到彈性蛋白樣多肽不同長度的彈性蛋白樣多肽（ELPs）含有五肽重復(fù)序列Val-Pro-Gly-Xxx-Gly , 其Xxx可以是任何氨基酸（Meyer和Chilkoti , 1999）,彈性蛋白樣多肽超過轉(zhuǎn) 變溫度加熱會發(fā)生可逆沉淀。許多ELP融合開發(fā)目的是通過從宿主細(xì)胞粗提取物 中選擇性沉淀，以利于重組蛋白的下游處理（Me

27、yer等，2001）。該技術(shù)在生物 催化方面有良好前景，但尚未在該領(lǐng)域廣泛應(yīng)用（Fujita等，2009）。設(shè)想的一般 過程是首先形成ELP-酶聚集體，然后通過交聯(lián)進行穩(wěn)定。彈性蛋白樣多肽的交 聯(lián)方法在文獻(xiàn)中已有提及（Lim等，2007）。融合到蛋白質(zhì)結(jié)合聚羥基脂肪酸酯顆粒聚羥基脂肪酸酯（PHAs）是天然聚酯纖維，存在于各種以其為能量儲存的 細(xì)菌中（Madison和Huisman, 1999）。大量生物塑料材料可以由 PHA制備（Lu 等，2009）。PHAs值得關(guān)注和開發(fā)的一個特點是生物合成酶（PHA合成酶）依 然會與聚酯顆粒保持共價結(jié)合。PHA合成酶可以在許多宿主生物體中進行表達(dá) （Reh

28、m, 2003）。因此，含有活性PH*成酶的融合蛋白會在重組生產(chǎn)過程中產(chǎn) 生PHA并同時將其自身附著在聚酯顆粒上。使用B-半乳糖甘酶-PHA合成酶融合蛋白可以說明此概念（用于生物催化）（Peters和Rehm, 2006）。伊半乳糖甘 酶與聚酯顆粒間三明治式結(jié)合也已得到說明，其顯示了 PHA與抗&半乳糖甘酶scFv （抗體的單鏈可變區(qū)）之間的融合（Grage和Rehm, 2008）。雖然也可能有 助于分析，但就目的酶連接到 PHAs所用的簡單步驟而言，似乎更適應(yīng)于生物催化。通過與種子凝集素融合可能是替代 PHAs固定化酶的一種方法。種子凝集素 是小分子（14-30 kDa）雙性蛋白，是

29、與 PHA-顆粒相關(guān)蛋白質(zhì)組的主要成分（Moldes等，2004; Neumann等，2008）。編碼與種子凝集素融合和 PHA生物合 成酶相關(guān)基因的共同表達(dá)，會使得固定于 PHA顆粒上的所需酶具有活性。（自動）仿生硅膠包埋硅藻筒藻中的親硅酸多肽可以誘導(dǎo)二氧化硅從單硅酸溶液中沉淀（ Kro等， 2002）。親硅酸多肽的重復(fù)單位 R5肽（H2N-SSKKSGSYSGSKGSKRRIL -COOH）, 可用以固定丁酰膽堿酯酶。高活性和穩(wěn)定性的生物硅球也已經(jīng)可以制備得到（Luckarift等，2004）。在室溫和溫和化學(xué)反應(yīng)條件下，往含有酶和硅酸的溶液 中添加R5多肽，可以提高其生物親硅酸性（Nai

30、k等，2004）。最近通過使用R5 融合，可以在大腸桿菌中將磷酸二酯酶和有機磷水解肽制成固定化酶制劑。每種融合蛋白都由硅縮聚開始，且酶的活性（69-97%）均保留在由此產(chǎn)生的硅微球 體中（Marner等，2009）。添加絡(luò)合多肽（His） 6-tag的金屬離子會使得硅化不 溶晶體可以從粗細(xì)胞提取物中直接回收，D-氨基酸氧化酶也同樣適用（Chien和 Lee, 2007）。結(jié)論表一制備無載體不溶性酶制劑各方法的半定量比較CLECsCLEAsPull-downdomainsS-layersSilaffins活力保持1+ +a+ - +e+l +m+o+q再利用難易度2+b+f+m-+n+o+r回收

31、后活力3+b+g,h +i+l+o+r機械穩(wěn)定性4+a+j7+ln.s.n.s.熱穩(wěn)定性5+a+f+n+P+q+s保存穩(wěn)定性6+c8+k +i+l9+o+s生產(chǎn)步驟購買酶/生產(chǎn)，結(jié)晶，交聯(lián)d購買酶/生產(chǎn)，沉淀，交聯(lián)j克隆+表達(dá)，產(chǎn) 品分離，交聯(lián)（包埋）n克隆+表達(dá)，產(chǎn)品分離，自組p克隆+表達(dá)，產(chǎn)品分離，硅酸化qCLECs交聯(lián)酶結(jié)晶,CLEAs交聯(lián)酶聚集體.1 .天然酶的 0-75% : +', 75-100% : +',三 100% : +'。2,離心大于5000Xg :三5000X g :三1500Xg,采用沉降或連續(xù)流動體系:HIP '。3 .第二次循環(huán)&l

32、t; 100% :接近10次循環(huán)：+ +', 10次以上循環(huán)100% : +'。4 .攪拌條件下全活力保持三1天：+:三2天：+ +', >2天：+', 'n.s不精確。5 .與天然酶相比，在高溫條件下半衰期的延長，三5倍：+;三10倍：+ +', >10 倍：+'。6 .假定保存時酶活呈指數(shù)衰減，衰減常數(shù)后0.2month-1: +>0.02month-1：+人三0.02 month-1或者適于凍干法：+'。7 . CLEAs包埋于 LentiKats中。8 .涂有表面活性劑的CLECs。9 .可用凍干法，但為

33、表明保存時間。a Margolin (1996), b Haering and Schreier(1998), c Rajan and Abraham (2008), d Roy and Abraham (2006), e Lopez-Serrand (2002), f Dalal等(2007), g Cabirol等 (2008), h Zha冷(2008), i Rajendhran and Gunasekaran (2007), j Wilson (2004), k Aytar and Bakir (2008), l Naha lka 等(2008), m Nahalka (2008),

34、 n Naha lka a nd Nidetzky (2007), o Scha ffer 等.(2007),p Tschiggerl et al. (2008), q Marners (2009), r Chien and Lee (2007), s Poulsen (2007)表1在半定量的基礎(chǔ)上，使用不同的標(biāo)準(zhǔn)，比較了本文所討論的無載體固定 化方法，并對其關(guān)于生物催化劑制備及工藝操作的利弊進行了總結(jié)。在可用方法當(dāng)中，顯然CLEAK術(shù)最為先進，并被廣泛使用。而為聚集體進行的融合蛋白設(shè) 計可以改善目前CLEAs生產(chǎn)方式。所有情況都需要包埋來最終獲得機械穩(wěn)定的 生物催化劑。致謝B.N.和J.N

35、.感謝奧地利和斯洛伐克間的科學(xué)和技術(shù)之間的合作項目的支持。參考文獻(xiàn)1. Aytar BS, Bakir U (2008) Preparation of cross-linked tyrosinase aggregates. Process Biochem 43:1251312. Bayley H, Braha O, Cheley S, Gu L-Q (2004) Engineered nanopores. In: NiemeyerCM, Mirkin CA (eds) Nanobiotechnology.Wiley-VCH, Weinheim, pp 93 1123. Betancor L,

36、Luckarift HR (2008) Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis. Trends Biotechnol 26:566-5724. Blecha A, Zarschler K, Sjollema KA, Veenhuis M, Ro del G(2005) Expression and cytosolic assembly of the S-layerfusion protein mSbsC-EGFP in eukaryotic cells.Microb Cell Fact 4:285. Bommarius AS, Rie

37、bel BR (2005) Biocatalysis. Wiley-VCH,Weinheim6. Buchholz K, Kasche V, Bornscheuer UT (2005) Biocatalysts and enzyme technology. Wiley-VCH, Weinheim7. Cabana H, Jones JP, Agathos SN (2007) Preparation and characterization of cross-linked laccase aggregates and their application to the elimination of

38、 endocrine disrupting chemicals. J Biotechnol 132:2318. Cabirol FL, Tan PL, Tay B, Cheng S, Hanefeld U, Sheldon RA(2008) Linum usitatissimum hydroxynitrile lyase crosslinked enzyme aggregates: a recyclable enantioselective catalyst. Adv Synth Catal 350:232923389. Cao L (2005) Carrier-bound immobiliz

39、ed enzymes: principles,applications and design. Wiley-VCH, Weinheim10. Cao L, van Rantwijk F, SheldonRA(2000) Cross-linked enzyme aggregates: a simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase. Org Lett 2:1361 -136411. . Cao L, van Langen L, Sheldon RA (2003) Immobilised enzy

40、mes: carrier-bound or carrier-free? Curr Opin Biotechnol 14:387W9412. Carette N, Engelkamp H, Akpa E, Pierre SJ, Cameron NR,Christianen PCM et al (2006) A virus-based biocatalyst.Nat Nanotechnol 2:22622913. Chen J, Zhang J, Han B, Li Z, Li J, Feng X (2006) Synthesis of cross-linked enzyme aggregates

41、 (CLEAs) in CO2-expanded micellar solutions. Colloids Surf B 48:72 714. Chien L-J, Lee C-K (2007) Biosilicification of dual-fusion enzyme immobilized on magnetic nanoparticle. Biotechnol Bioeng 100:22323015. Dalal S, Sharma A, Gupta MN (2007) A multipurpose immobilized biocatalyst with pectinase, xy

42、lanase and cellulose activities. Chem Cent J 1:1616. Fujita Y, Mie M, Kobatake E (2009) Construction of nanoscale protein particle using temperature-sensitive elastin-like peptide and polyaspartic acid chain.Biomaterials 30:3450 W45717. Graff A, Benito SM, Verbert C, Meier W (2004) Polymer nanoconta

43、iners. In: Niemeyer CM, Mirkin CA (eds) Nanobiotechnology. Wiley-VCH, Weinheim, pp 168 T8418. Grage K, Rehm BHA (2008) In vivo production of scFv-displaying biopolymer beads using a self-assembly-promoting fusion partner. Bioconjug Chem 19:25462 19 Haering D, Schreier P (1998) Novel biocatalysts by

44、chemical modification of known enzymes: cross-linked microcrystals of the semisynthetic peroxidase seleno-subtilisin.Angew Chem Int Ed 37:2471 -247320 Hampp N, Oesterhelt D (2004) Bacteriorhodopsin and its potential in technical applications. In: Niemeyer CM,Mirkin CA (eds) Nanobiotechnology. Wiley-

45、VCH,Weinheim, pp 146 T6721. Hanefeld U, Gardossi L, Magner E (2009) Understanding enzyme immobilisation. Chem Soc Rev 38:45346822. Hara P, Hanefeld U, Kanerva LT (2007) Sol-gels and crosslinked aggregates of lipase PS from Burkholderia cepacia and their application in dry organic solvents. J Mol Cat

46、al B 50:80 -8623. Heyman A, Levy I, Altman A, Shoseyov O (2007) SP1 as a novel scaffold building block for self-assembly nanofabrication of submicron enzymatic structures. Nano Lett 7:1575 T57924. Hickey AM, Marle L, McCreedy T, Watts P, Greenway GM,Littlechild JA (2007) Immobilization of thermophil

47、ic enzymes in miniaturized flow reactors. Biochem Soc Trans 35:1621 T62325. Hickey AM, Ngamsom B, Wiles C, Greenway GM, Watts P,Littlechild JA (2009) A microreactor for the study of biotransformations by a cross-linked c-lactamase enzyme.Biotechnology J 4:510 -51626. Jekel M, Buhr A, Willke T, Vorlo

48、p K-D (1998) NeuartigeGeleinschlu?immobilisate (LentiKats) in der Biotechnologie.Chem lngenieur Technik 70:438 -44127 Kapust RB, Waugh DS (1999) Escherichia coli maltosebinding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein Sci 8:1668 -16743

49、48 Biotechnol Lett (2010) 32:341.35028. Khare SK, Vaidya S, Gupta MN (1991) Entrapment of proteins by aggregation within sephadex beads. Appl Biochem Biotechnol 27:20521629. Kim MI, Kim J, Lee J, Jia H, Na HB, Youn JK, Kwak JH,Dohnalkova A, Grate JW, Wang P, Hyeon T, Park HG,Chang HN (2007) Cross-li

50、nked enzyme aggregates in hierarchically-ordered mesoporous silica: a simple and effective method for enzyme stabilization. Biotechnol Bioeng 96:210 -21830. Kro ger N, Lorenz S, Brunner E, Sumper M (2002) Selfassembly of highly phosphorylated silaffins and their function in biosilica morphogenesis.

51、Science 298:584 右8631. . Kuba' c v D, Kaplan O, Elis v a' kova ' V, Pa ' tSHaMr,ovejvKd a V, To thova A, Lemaire M, Gallienne E, Lutz-Wahl S, Fischer L, Kuzma M, Pelantova H, van Pelt S,Bolte J, Kr v en V, Mart? ' nkova ' L (2008) Bi ofrahEifosmation amides using soluble and

52、immobilized nitrile hydratase from Rhodococcus erythropolis A4. J Mol Catal B 50:107-11332. Lim DW, Nettles DL, Setton LA, Chilkoti A (2007) Rapid cross-linking of elastin-like polypeptides with hydroxymethylphosphines in aqueous solution. Biomacromolecules 8:1463T47033. Littlechild JA, Guy J, Conne

53、lly S, Mallett L, Waddell S,Rye CA, Line K, Isupov M (2007) Natural methods of protein stabilization: thermostable biocatalysts. Biochem Soc Trans 35:155856334. Lo pez-Gallego F, Betancor L, Hidalgo A, Alonso N, Fernandez-Lafuente R, Guisa n JM (2005) Co-aggregation of enzymes and polyethyleneimine:

54、 a simple method to prepare stable and immobilized derivatives of glutaryl acylase.Biomacromolecules 6:1839T84235. Lo pez-Serrano P, Cao L, van Rantwijk F, Sheldon RA (2002)Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity:application to lipases. Biotechnol Lett 24:1379 T38336. Lu J, Tappel RC,

55、Nomura CT (2009) Mini-review: biosynthesis of poly(hydroxyalkanoates). J Macromol Sci C 49:226-24837. Luckarift HR, Spain JC, Naik RR, Stone MO (2004) Enzyme immobilization in a biomimetic silica support. Nat Biotechnol 22:211 -21338. Madison LL, Huisman GW (1999) Metabolic engineering of poly(3-hyd

56、roxyalkanoates): from DNA to plastic. Microbiol Mol Biol Rev 63:21 -53 Margolin AL (1996) Novel crystalline catalysts. Trends Biotechnol 14:223 -23039. Marner WD, Shaikh AS, Muller SJ, Keasling JD (2009) Enzyme immobilization via silaffin-mediated autoencapsulation in a biosilica support. Biotechnol

57、 Prog 25:417 -42340. Mateo C, Palomo JM, van Langen LM, van Rantwijk F,Sheldon RA (2004) A new, mild cross-linking methodology to prepare cross-linked enzyme aggregates. Biotechnol Bioeng 86:273 W7641. . Mateo C, Chmura A, Rustler S, van Rantwijk F, Stolz A,Sheldon RA (2006) Synthesis of enantiomeri

58、cally pure(S)-mandelic acid using an oxynitrilasenitrilase bienzymatic cascade: a nitrilase surprisingly shows nitrile hydratase activity.Tetrahedron 17:320W2342. Meyer DE, Chilkoti A (1999) Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.Nat Biotechnol 17:1112-111543 Meyer DE, Trabbic-Carlson K, Chilkoti A (2001) Protein purification by fusion with an environmentally responsive elastin-like polypeptide: effect of polypeptide length on the purification of thioredoxin. Biotechnol Prog 17:720