MTT法檢測細胞活力

1、編輯ppt1MTT法檢測細胞活力法檢測細胞活力甘肅中醫(yī)藥大學甘肅中醫(yī)藥大學編輯ppt2MTT法目的和意義法目的和意義檢測細胞存活和生長情況檢測細胞存活和生長情況用于評價藥物產(chǎn)生的細胞毒作用用于評價藥物產(chǎn)生的細胞毒作用編輯ppt3原理原理 四唑鹽（噻唑藍）是一種能接受氫原子的染料，簡稱四唑鹽（噻唑藍）是一種能接受氫原子的染料，簡稱MTT 活細胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的活細胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT還原為難還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。溶性的藍紫色結(jié)晶物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的紫藍色結(jié)

2、晶物，用酶）能溶解細胞中的紫藍色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量，從而反映細胞的增殖情況?；罴毎麛?shù)量，從而反映細胞的增殖情況。 在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與活細胞數(shù)成正結(jié)晶物形成的量與活細胞數(shù)成正比。比。編輯ppt4活細胞+MTT琥珀酸脫琥珀酸脫氫酶氫酶紫藍色結(jié)晶物 Formazan編輯ppt5貼壁細胞操作步驟貼壁細胞操作步驟 1. 接種細胞：用接種細胞：用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，用含血胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，用含血清的培養(yǎng)液配成清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液

3、單個細胞懸液，以每孔，以每孔2000-3000個細胞接個細胞接種于種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積孔培養(yǎng)板中，每孔體積90 ul。 （邊緣孔用（邊緣孔用PBS或空白或空白培養(yǎng)基填充）。培養(yǎng)基填充）。 2. 培養(yǎng)細胞：將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)細胞：將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在孵箱中，在37、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿孔底（及飽和濕度條件下培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板孔平底板，大約，大約12h），加入濃度梯度的藥物。原則上，細胞貼壁后即），加入濃度梯度的藥物。原則上，細胞貼壁后即可加藥，每孔加藥可加藥，每孔加藥10 ul，一般設，一般設5個復孔。個復孔。 3. 5%CO2，37

4、孵育分別孵育孵育分別孵育24小時后，倒置顯微鏡下觀小時后，倒置顯微鏡下觀察。察。編輯ppt6 4. 每孔加入每孔加入10ul MTT溶液（溶液（5mg/ml，即，即0.5%MTT），繼續(xù)），繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)4h。若藥物與。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用心用PBS沖沖2-3遍后，再加入含遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。的培養(yǎng)液。 5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。 6. 每孔加入每孔加入100ul二甲基亞砜（置搖床上低速振蕩二甲基亞砜（置搖床上低速振蕩10min，使，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀結(jié)晶物充分溶解

5、。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸處測量各孔的吸光值。光值。 7.同時設置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、同時設置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔、二甲基亞砜），對照孔（細胞、培養(yǎng)液、（細胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）、二甲基亞砜）編輯ppt7懸浮細胞操作步驟懸浮細胞操作步驟： 1）將細胞離心收集后，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度大約）將細胞離心收集后，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度大約1104/ml，每孔先加，每孔先加細胞懸液細胞懸液90ul,相應梯度的藥物每孔相應梯度的藥物每孔10ul；共；共100ul加入到加入到96孔板（邊緣孔板（邊緣孔用孔用PBS填充）。每板設對照。同時設置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、填充）。每板

6、設對照。同時設置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二、二甲基亞砜），對照孔（細胞、培養(yǎng)液、甲基亞砜），對照孔（細胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），、二甲基亞砜），每組設每組設5個個復孔。復孔。 2）置）置37，5%CO2孵育孵育24小時，倒置顯微鏡下觀察。小時，倒置顯微鏡下觀察。 3）每孔加入）每孔加入10 ul MTT溶液（溶液（5 mg/ml，即，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 4）每孔加三聯(lián)裂解液（每孔加三聯(lián)裂解液（10gSDS，異丁醇異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用雙蒸用雙蒸水溶解配成水溶解配成100ml）過夜，）過夜， 第二天早晨置搖床上低速振蕩第二天早晨置搖床上低速

7、振蕩10 min，使，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm測量各孔的吸光值。測量各孔的吸光值。編輯ppt8藥物的配制 濃度 體積 過濾編輯ppt9MTT的配制的配制 MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。尤其當避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。尤其當MTT變?yōu)榛揖G色變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。時就絕對不能再用了。

8、 MTT有致癌性，用的時候小心有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配配成的成的MTT需要無菌，需要無菌，MTT對菌很敏感；往對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有孔板加時不避光也沒有關系，因為時間較短。關系，因為時間較短。編輯ppt10實驗結(jié)果SS軟件進行方差分析，p0.05時為相差顯著，p0.01時為相差非常顯著?？梢砸詴r間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生線曲線，專門公式求IC50（半數(shù)抑制濃度）?；蛴嬎阋种坡?。OD對照組-OD實驗組抑制率% = OD對照組100 %編輯ppt11實驗結(jié)果公式如下： lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-P

9、n)/4)Xm:lg 最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應率之和Pm:最大陽性反應率Pn:最小陽性反應率編輯ppt12舉例 藥物濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001umol/l，稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 計算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=

10、0.00025編輯ppt13注意事項注意事項 1 選擇適當?shù)募毎臃N濃度。選擇適當?shù)募毎臃N濃度。在進行在進行MTT試驗前，對每試驗前，對每一種細胞都應測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)一種細胞都應測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線，然后確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和條件下的生長曲線，然后確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間。培養(yǎng)時間。2 設空白對照，設空白對照，與試驗平行設不加細胞只加培養(yǎng)液的空與試驗平行設不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。最后比色時，以空白孔調(diào)零。白對照孔。最后比色時，以空白孔調(diào)零。 編輯ppt14實驗前應明確的問題實驗前應明確的問題 1.選擇適當?shù)募毎?/p>

11、接種濃度。選擇適當?shù)募毎臃N濃度。一般情況下，一般情況下，96孔培養(yǎng)孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細胞長滿時約有板的一內(nèi)貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿。這樣，才能保證，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶結(jié)晶形成酌量與細胞數(shù)呈的線性關系

12、。否則細胞數(shù)太多敏感性形成酌量與細胞數(shù)呈的線性關系。否則細胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。降低，太少觀察不到差異。編輯ppt152.藥物濃度的設定。藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結(jié)果一定要多看文獻，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。度根本不是藥物的有效濃度和時間。3. 時間點的設定。時間點的設定。在不同時間點的測定在不同時間點的測定OD值，輸入值，輸入excel表，最

13、后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。抑制表現(xiàn)的最明顯）。編輯ppt164.培養(yǎng)時間。培養(yǎng)時間。100ul的培養(yǎng)液對于的培養(yǎng)液對于10的的45次方的增次方的增殖期細胞來說，很難維持殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，如果營養(yǎng)不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，期而趨于靜止，

14、影響結(jié)果，我們是在我們是在48h換液的。換液的。 5.MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力，不法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細胞絕對數(shù)。能測定細胞絕對數(shù)。做做MTT時，盡量無菌操作，因時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致為細菌也可以導致MTT比色比色OD值的升高。值的升高。 編輯ppt17 7.實驗時應設置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。實驗時應設置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加調(diào)零孔加培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養(yǎng)液、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，

15、而加藥組加入不同濃度的藥物。的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。 8.避免血清干擾。避免血清干擾。用含用含15胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞時，胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10胎牛血清的培胎牛血清的培養(yǎng)液進行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。養(yǎng)液進行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。編輯ppt18關于細胞的接種關于細胞的接種(鋪板鋪板) 細胞過了細胞過了30代以后就不要用了代以后就不要用了;培養(yǎng)板要用好的（最好進口培養(yǎng)板要用好

16、的（最好進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。 接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種, 且而細胞過密或且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而。故而MTT細胞密度多采用細胞密度多采用10000/ml，100ul/孔?？?。 細胞密度要根據(jù)不同細胞的特點來定。細胞密度要根據(jù)不同細胞的特點來定。 懸浮細胞每孔的細懸浮細胞每孔的細胞數(shù)可達到胞數(shù)可達到105,貼壁細胞可為貼壁細胞可為103-104。編輯ppt19 MTT本身就是比較粗的實驗

17、，增殖率本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不左右的波動都不算奇怪。特別是新手，算奇怪。特別是新手，20的波動也是常見的，所以很可的波動也是常見的，所以很可能是技術原因引起的，特別是能是技術原因引起的，特別是種板技術一定要過關種板技術一定要過關。 注意注意細胞懸液一定要混勻細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉淀下來，導致每，已避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數(shù)量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加孔中的細胞數(shù)量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。另外，吹散次數(shù)過樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。另外，吹散次數(shù)過多也會影響細胞活力。所以要熟練鞋、快些上板

18、。多也會影響細胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。編輯ppt20如何清除上清如何清除上清 直接吸出：直接吸出：加加DMSO前要把液體吸掉，但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能前要把液體吸掉，但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會吸去，可在這之前先用平板離心機離心會吸去，可在這之前先用平板離心機離心96孔板，孔板，2000r，5分鐘，分鐘，然后吸掉上清然后吸掉上清(如果是懸浮細胞，則推薦此法如果是懸浮細胞，則推薦此法,懸浮細胞要離心懸浮細胞要離心2500rpm10min.且其做且其做MTT最好用圓底型最好用圓底型96孔板孔板,清除上清時注意清除上清時注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉,建議各孔吸棄建議各孔

19、吸棄150-160ul即可即可)。 翻轉(zhuǎn)倒扣法：翻轉(zhuǎn)倒扣法：可以直接將板翻轉(zhuǎn)倒扣（墊幾層濾紙）可以直接將板翻轉(zhuǎn)倒扣（墊幾層濾紙）23次，比次，比用用“吸吸”的辦法更不容易使細胞脫離出來?？梢暂p拍，或者傾斜一點的辦法更不容易使細胞脫離出來?？梢暂p拍，或者傾斜一點幫助吸液，但前提是細胞貼壁要比較牢。幫助吸液，但前提是細胞貼壁要比較牢。編輯ppt21加入加入DMSO 在同一批實驗中最好不要更換在同一批實驗中最好不要更換DMSO。加加DMSO前把孔中液體盡量棄前把孔中液體盡量棄干凈如果培養(yǎng)液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養(yǎng)液，這樣在檢干凈如果培養(yǎng)液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養(yǎng)液，這樣在檢測時可以盡量去除