實驗6 血清甘油三酯與膽固醇的測定20151109

1、實驗實驗六六 血清血清甘油三酯與膽固醇的測定甘油三酯與膽固醇的測定酶法測定血清中的甘油三酯酶法測定血清中的甘油三酯一一. 目的要求目的要求了解血清甘油三酯酶法測定的原理了解血清甘油三酯測定的臨床意義掌握酶標(biāo)儀測定法的原理和操作二實驗原理二實驗原理血清甘油三酯的測定是血脂分析的重要內(nèi)容之一。目前，國內(nèi)多數(shù)醫(yī)院采用酶法測定。酶法又分為：一步終點比色法和兩步終點比色法。兩步法的主要優(yōu)點是消除了游離甘油的干擾。脂蛋白脂肪酶（LPL）可將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。甘油在甘油激酶催化下，生成磷酸甘油，后者在磷酸甘油氧化酶（GPO）催化下，生成磷酸二羥丙酮和H2O2。 H2O2在過氧化物酶（POD）催化下

2、與4-氨基安替比林（4-AAP）及ESPAS（3-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺）反應(yīng)生成紫色醌亞胺染料。形成的醌亞胺染料色澤強度與樣品中甘油三酯的含量成正比。測定標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和待測血清樣品反應(yīng)生成的醌亞胺染料吸光度（A）值，即可求出待測血清樣品中甘油三酯的濃量。二實驗原理二實驗原理反應(yīng)如下：CK GPOPOD甘油三酯（甘油三酯（TG）3H2O甘油甘油ATP甘油甘油-1-磷酸磷酸O2 H2O2 4-AAP ESPAS 目前，TG測定試劑盒多根據(jù)以上原理配制，用一步終點法測定。 甘油甘油3RCOOH（脂肪酸）（脂肪酸）甘油甘油-1-磷酸磷酸ADP磷酸二羥丙酮磷酸二羥丙酮H2O2醌亞胺醌亞

3、胺 染料染料 4H2O LPL三器材及試劑三器材及試劑1器材：器材： 酶標(biāo)儀，酶標(biāo)板，37度恒溫箱，移液槍。2. 試劑：試劑：一一步法步法：Tris-HCl緩沖液（pH7.6，濃度為150mmlo/L），LPL或脂肪酶（3000u/L），甘油激酶（GK）（250u/L），ATP（0.5mmol/L），磷酸甘油氧化酶（GPO）（3000u/L），過氧化物酶（POD；辣根）（1000u/L），膽酸鈉（3.5mmol/L），硫酸鎂（17.5mmol/L），4-氨基安替比林（4-AAP）（1mmol/L），4-氯酚（3.5mmol/L），Triton X-100（0.1g/L）。四四操作步驟操作步驟取

4、酶標(biāo)條1個（每個樣品2個重復(fù)），按下表操作： 試劑（試劑（ul）空白管空白管標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)管測定管測定管蒸餾水蒸餾水32.26mmol/L標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品(TG)3樣本樣本3酶試劑（工作液）酶試劑（工作液）30030030037保溫5min，空白調(diào)零，550nm處測定各孔A值。五五計算計算（標(biāo)準(zhǔn)液濃度（標(biāo)準(zhǔn)液濃度=2.26mmol/L）（mmol/L）正常參考值：正常參考值：0.561.7mmol/L，老年約為：，老年約為：2.26mmol/L。美國國家膽固醇教育計劃對空腹美國國家膽固醇教育計劃對空腹TG水平分解線的修訂意見為（水平分解線的修訂意見為（1993年）：年）：TG正常：正常：4.5mmol

5、/L胰腺炎高危：胰腺炎高危：11.3mmol/L六六注意事項注意事項試劑出現(xiàn)紅色不能再用，試劑空白吸光度A550nm0.05；兩步法37 4分鐘能完全排除游離甘油；GPO純度不高時，因其它氧化酶的存在而產(chǎn)生額外的H2O2，使得結(jié)果偏高；溫度控制、吸量的準(zhǔn)確度對結(jié)果影響較大；甘油三酯增高常見于肥胖、糖尿病、腎病綜合癥、糖原沉積癥、高血壓、冠心病等，也隨年齡而上升。降低多見于甲狀腺功能亢進、腎上腺皮質(zhì)功能低下、肝功能嚴(yán)重低下。七七臨床意義臨床意義u 血脂血脂是血漿所含脂類的統(tǒng)稱是血漿所含脂類的統(tǒng)稱血漿所含脂類統(tǒng)稱血脂，包括：甘油三酯、磷脂、膽固醇及其酯以及游離脂酸。外源性從食物中攝取 內(nèi)源性肝、脂

6、肪細(xì)胞及其他組織合成后釋放入血n定義：n來源：血脂含量受膳食、年齡、性別、職業(yè)及代謝等的影響，波動范圍很大。七七臨床意義臨床意義十二指腸下段及空腸上段。十二指腸下段及空腸上段。中鏈及短鏈脂酸構(gòu)成的TG 乳化 吸收 脂肪酶 甘油 + FFA 門靜脈 血循環(huán)腸粘膜 細(xì)胞 u 飲食飲食脂肪在小腸被吸收脂肪在小腸被吸收n 吸收部位：n 吸收方式：七七臨床意義臨床意義消化吸收和內(nèi)源性合成的脂酸，以游離的形式存在較少，大多數(shù)以酯化的形式存在于甘油三酯之中而存在于體內(nèi)。（二）甘油三酯的主要作用是為機體提供能量（二）甘油三酯的主要作用是為機體提供能量（一）甘油三酯是脂酸的主要儲存形式（一）甘油三酯是脂酸的主要

7、儲存形式1. 甘油三酯是機體重要的能量來源2. 甘油三酯是機體的主要能量儲存形式男性：21%，女性：26 1g TG = 38kJ七七臨床意義臨床意義 （三）甘油三酯是3分子長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子。甘油三酯是人體內(nèi)含量最多的脂類，大部分組織均可以利用甘油三酯分解產(chǎn)物供給能量。甘油三酯大部分是從飲食中獲得的，同時肝臟、脂肪等組織還可以進行甘油三酯的合成，在脂肪組織中貯存。（四）甘油三酯增高常見于肥胖、糖尿病、腎病綜合癥、糖原沉積癥、高血壓、冠心病等，也隨年齡而上升。降低多見于甲狀腺功能亢進、腎上腺皮質(zhì)功能低下、肝功能嚴(yán)重低下。八八思考題思考題簡述酶法測定甘油三酯的原理。正常人空腹血清TG

8、濃度是多少？說明TG的測定的臨床意義。酶法測定血清中的膽固醇酶法測定血清中的膽固醇一一. 目的要求目的要求了解血清膽固醇氧化酶法測定的原理了解血清膽固醇測定的臨床意義鞏固酶標(biāo)儀測定法的原理和操作二實驗原理二實驗原理膽固醇脂酶可將膽固醇酯水解成膽固醇和脂肪酸。膽固醇在膽固醇氧化酶催化下，生成膽甾烯酮和H2O2。H2O2在過氧化物酶（POD）催化下與4-氨基安替比林（4-AAP）及ESPAS（3-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺）反應(yīng)生成紫色醌亞胺染料。形成的醌亞胺染料色澤強度與樣品中膽固醇的含量成正比。測定標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和待測血清樣品反應(yīng)生成的醌亞胺染料吸光度（A）值，即可求出待測血清樣品中

9、總膽固醇的濃量。反應(yīng)如下：膽固醇酯（膽固醇酯（TC）H2OH2O2 4-AAP ESPAS醌亞胺醌亞胺 染料染料 H2O 膽固醇膽固醇+RCOOH膽固醇膽固醇+O24-膽甾烯酮膽甾烯酮+H2O2膽固醇脂酶膽固醇脂酶膽固醇氧化酶膽固醇氧化酶 過氧化物酶過氧化物酶三器材及試劑三器材及試劑1器材：器材：（1）酶標(biāo)儀（2）恒溫水浴箱三器材及試劑三器材及試劑2試劑試劑：四四操作步驟操作步驟取酶標(biāo)條1個（每個樣品2個重復(fù)），按下表操作： 37保溫5min，空白調(diào)零，550nm處測定各孔A值。 試劑（ul）空白孔標(biāo)準(zhǔn)孔測定孔蒸餾水35.17mmol/L標(biāo)準(zhǔn)品3樣本3酶試劑（工作液）300300300五五計算

10、計算標(biāo)準(zhǔn)液濃度標(biāo)準(zhǔn)液濃度=5.17mmol/L（mmol/L）六六相關(guān)知識與相關(guān)知識與臨床臨床意義意義 膽固醇為固醇類中的重要物質(zhì)，是環(huán)戊烷多氫菲的衍生物。膽固醇酯化的位點膽固醇酯化的位點六六相關(guān)知識與相關(guān)知識與臨床意義臨床意義 1膽固醇的生理功能是生物膜的重要成分，對控制生物膜的流動性有重要作用；是合成膽汁酸、類固醇激素及維生素D等生理活性物質(zhì)的前體。六六相關(guān)知識與相關(guān)知識與臨床意義臨床意義 2膽固醇在體內(nèi)含量及分布 含量： 約140克 分布：廣泛分布于全身各組織中大約1/4分布在腦、神經(jīng)組織肝、腎、腸等內(nèi)臟、皮膚、脂肪組織中也較多肌肉組織含量較低腎上腺、卵巢等合成類固醇激素的腺體含量較高

11、存在形式： 游離膽固醇 30% 膽固醇酯 70%六六相關(guān)知識與相關(guān)知識與臨床意義臨床意義 3膽固醇的合成部位 組織定位： 除成年動物腦組織及成熟紅細(xì)胞外， 幾乎全身各組織均可合成， （肝最旺盛 ，其次為小腸） 細(xì)胞定位： 胞液、內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 六六相關(guān)知識與相關(guān)知識與臨床意義臨床意義 4膽固醇的合成步驟 一般認(rèn)為乙酸等物質(zhì)在動物體內(nèi)是合成膽固醇的原料。限速酶：限速酶：HMGCoA還原酶還原酶u合成前體乙酸u需要NADPH和ATPu高度調(diào)控u發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)u內(nèi)質(zhì)網(wǎng)u細(xì)胞液六六相關(guān)知識與相關(guān)知識與臨床意義臨床意義 5膽固醇合成的調(diào)節(jié)限速酶限速酶HMG-CoA還原酶還原酶 酶的活性具有晝夜節(jié)律性 (午夜最高，

12、中午最低 ） 可被磷酸化而失活，脫磷酸可恢復(fù)活性 受膽固醇的反饋抑制作用 胰島素甲狀腺素能誘導(dǎo)肝甲狀腺素能誘導(dǎo)肝HMG-CoAHMG-CoA還原酶的還原酶的合成，合成，又促進膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)橛执龠M膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼峥墒寡心懝檀枷陆的懼峥墒寡心懝檀枷陆盗嚓P(guān)知識與相關(guān)知識與臨床意義臨床意義 6膽固醇的降解 目前一般認(rèn)為膽固醇主要經(jīng)由膽汁排出體外。 由于環(huán)結(jié)構(gòu)不能代謝，體內(nèi)膽固醇的清除是將其轉(zhuǎn)變成膽汁酸，在分泌到小腸以后，部分隨糞便排出。六六相關(guān)知識與相關(guān)知識與臨床意義臨床意義 7膽固醇的轉(zhuǎn)變 類固醇激素（ 腎上腺皮質(zhì)激素、孕激素、 雄激素、雌激素等） 膽固醇 膽汁酸脫氫膽固醇維生素D六六相關(guān)

13、知識與相關(guān)知識與臨床意義臨床意義 8血清膽固醇測定的臨床意義(1) 血清膽固醇濃度可作為酯類代謝的標(biāo)志，對糖尿病患者的預(yù)后有重要意義。糖尿病昏迷患者幾乎都伴有血清膽固醇濃度的增加。膽固醇增加還見于動脈粥樣硬化、腎病綜合征、總膽管阻塞及粘液性水腫。其他如肥大性骨關(guān)節(jié)炎、老年性白內(nèi)障、牛皮癬等，血清膽固醇濃度間或也有增加。（2）在惡性貧血、溶血性貧血以及甲狀腺功能亢進時，血清膽固醇含量降低，其他如感染、營養(yǎng)不良等情況下，膽固醇總量常見減低。（3）膽固醇酯系由膽固醇與脂肪酸結(jié)合而成，此反應(yīng)主要在肝臟內(nèi)進行。肝臟有實質(zhì)性病變時，膽固醇的含量可顯著地減少，同時在膽固醇總量內(nèi)所占的比例亦明顯減低，故其測定有助于肝臟疾病診斷。膽固醇酯的含量與比例日漸減低是預(yù)后不良的征兆。六六相關(guān)知識與相關(guān)知識與臨床意義臨床意義 9參考值 血清膽固醇水平與性別、年齡、飲食、生活習(xí)慣、精神因素、工作性質(zhì)、運動及吸煙等有關(guān)。 成人參考值為：2.86.0mmol/L（100230mg/dl） 血清正常上限值： 5.20mmol/L 危險閾值：5.20-6.20mmol/L 高膽固醇血癥：6.20mmol/L 六六相關(guān)知識與相關(guān)知識與臨床意義臨床意義 膽固醇增高、降低的常見疾病 膽固醇增高 膽固醇降低 家族性高膽固醇血癥 無脂蛋白血癥 LDL-R缺陷 低脂蛋白血癥 混合