生物藥物分析與檢驗(yàn)

1、生物藥物分析與檢驗(yàn)生物藥物分析與檢驗(yàn)的特點(diǎn)：1. 需要進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定、2. 需要檢查生物活性3. 需做安全性檢查4. 需做效價(jià)測(cè)定5. 要用生化法確證結(jié)構(gòu)終點(diǎn)測(cè)定法的條件：1. 必須有專一地作用該被測(cè)物質(zhì)的酶，并能得到它的制品；2. 能夠確定使這種酶反應(yīng)接近進(jìn)行完全的條件；3. 反應(yīng)中底物的減少、產(chǎn)物的增加、輔酶物質(zhì)的改變等可以借助簡(jiǎn)便的方法進(jìn)行測(cè)定高效液相色譜法的定性分析1.利用已知物質(zhì)定性的方法1 利用保留特性2 利用不同柱比較2. 色譜法與其他方法結(jié)合定性1 利用化學(xué)反應(yīng)定性2 利用選擇性檢測(cè)器定性3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)生物檢定的范圍:1. 藥物的

2、效價(jià)測(cè)定2. 體內(nèi)微量生物活性物質(zhì)的測(cè)定3. 中藥質(zhì)量的控制4. 某些有害雜質(zhì)的限度檢查基因工程藥物的特點(diǎn)：1. 分泌量極低而生理、藥理活性極高2. 具有細(xì)胞和組織特異性3. 多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)因子具有多功能性4. 細(xì)胞因子間存在復(fù)雜的相互作用5. 具有低免疫原性特殊雜質(zhì)檢查方法：物理化學(xué)區(qū)分方法1、 物理法“1. 臭味及揮發(fā)性的差異2. 顏色上的差異3. 溶解行為上的差異二、化學(xué)分析法1. 酸堿反應(yīng)2. 呈色或沉淀反應(yīng)3. 產(chǎn)生氣體4.氧化還原反應(yīng)免疫電泳技術(shù)：將瓊脂電泳與免疫擴(kuò)散結(jié)合起來(lái)，即利用電場(chǎng)作用下帶電蛋白質(zhì)在瓊脂凝膠中具有不同的遷移率，以及相同的蛋白質(zhì)具有完整的抗原性的特點(diǎn)，用于分析抗原

3、或抗體性質(zhì)的一種技術(shù)。電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。終點(diǎn)測(cè)定法：先借助酶反應(yīng)（單獨(dú)的反應(yīng)或幾種酶構(gòu)成的偶數(shù)酶反應(yīng)）使被測(cè)物質(zhì)定量地進(jìn)行轉(zhuǎn)變，然后在轉(zhuǎn)化完成后，測(cè)定底物、產(chǎn)物或輔酶物質(zhì)（第二底物）等的變化量生物檢定：利用生物體（整體動(dòng)物、離體組織/器官、細(xì)胞和微生物等）的作用以測(cè)定其效價(jià)或生物活性的一種方法。質(zhì)反應(yīng)：當(dāng)一定劑量的藥物注入動(dòng)物體內(nèi)后，觀察某一反應(yīng)或反應(yīng)的某一程度出現(xiàn)與否，只有質(zhì)的變化。量反應(yīng)：藥物對(duì)生物體所引起的反應(yīng)隨著藥物劑量的增加產(chǎn)生的量變可以測(cè)量者。雜志：指藥物中存在的無(wú)治療作用、或影響藥物穩(wěn)定性和療效、甚至對(duì)人體健康有害的物質(zhì)藥典主要包括凡

4、例、正文、附錄和索引四部分組成 生物藥物常用的定量分析法：酶法、電泳法、免疫分析法、理化測(cè)定法、生物檢定法酶分析法包括酶法分析和酶活力測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附分析法包括直接法和夾心法電泳法分為自由界面電泳、區(qū)帶電泳和高效毛細(xì)管電泳。指示液：溴酚藍(lán)用于指示電泳終點(diǎn)；甘油比重大，使樣品下沉SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的三種效應(yīng)：分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)：速度快、分辨率高、靈敏度高、柱子可反復(fù)使用、樣品容易回收要獲得較好色譜分離有兩個(gè)途徑：一是最大峰間的距離要大，二是色譜峰要窄常用的脫氣方法：真空脫氣法、煮沸脫氣法、溶劑的濾過(guò)微生物檢定法測(cè)定抗生素效價(jià)：稀釋法，濁度法，管碟法。其中我國(guó)

5、是管碟法。氯化物檢查法：用硝酸，硝酸銀硫酸鹽檢查法：用鹽酸，氯化鋇，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液： 標(biāo)準(zhǔn)硫酸鉀溶液鐵鹽檢查法：中國(guó)藥典和美國(guó)藥典采用硫氰酸鹽，英國(guó)藥典采用巰基醋酸法重金屬檢查常用的顯色劑：硫代乙酰胺、硫化鈉澄清：不超過(guò)0.5號(hào)濁度標(biāo)準(zhǔn)液的濁度時(shí)；幾乎澄清：介于0.5號(hào)至1號(hào)濁度標(biāo)準(zhǔn)液之間胰島素的含量測(cè)定：高效液相色譜法；生物活性檢查：生物測(cè)定法；生物檢定法：小鼠血糖法、小鼠驚厥法、家兔血糖法氨基酸藥物分析的含量測(cè)底1. 酸堿滴定法谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸2. 非水溶液滴定法甘氨酸、絲氨酸、亮氨酸、3. 定氮法精氨酸和天冬酰胺4. 碘量法或溴量法鹽酸半胱氨酸、L-胱氨酸5. HPLC或氨基酸自動(dòng)分

6、析儀：谷丙甘氨酸膠囊等復(fù)方制劑蛋白質(zhì)藥物分析的含量測(cè)定1. 定氮法人胎盤的蛋白質(zhì)測(cè)定2. 電泳法人血白蛋白的純度測(cè)定3. 高效液相色譜法胰島素含量測(cè)定4. 生物檢定法硫酸魚精蛋白的效價(jià)測(cè)定葡萄糖酸鈣中蔗糖或還原糖類檢查用的試劑是堿性酒石酸銅試液 蔗糖加硫酸煮沸后，用氫氧化鈉試液中和，再加亞硫酸鈉試液， 產(chǎn)生紅色沉淀葡萄糖中存在的特殊雜質(zhì)為糊精取乳糖5.0g，加熱水25ml溶解，放冷，加硝酸汞試液5ml，5分鐘內(nèi)不得產(chǎn)生白色絮狀沉淀，這是檢查蛋白質(zhì)類雜質(zhì)葡萄糖注射液的含量測(cè)定方法為旋光度法用旋光度測(cè)定法測(cè)定葡萄糖氯化鈉注射液時(shí)，加入氨試液的作用加速D葡萄糖和兩種互變異構(gòu)體互變平衡的到達(dá)葡萄糖的F

7、ehling反應(yīng)所需要的試劑是堿性酒石酸銅Keller-Kiliani反應(yīng)-去氧糖的反應(yīng) 洋地黃毒苷、地高辛（靛藍(lán)色）Kedde反應(yīng) 不飽和內(nèi)酯的反應(yīng) 去乙酰毛花苷 （紅紫色）紙色譜 地高辛1、葡萄糖注射液的鑒別反應(yīng)是Fehling反應(yīng)2、洋地黃毒苷的鑒別是Keller-Kiliani反應(yīng)3、去乙酰毛花苷的鑒別反應(yīng)是Kedde反應(yīng)4、用于地高辛鑒別和特殊雜質(zhì)檢查的方法PC特殊雜質(zhì)檢查洋地黃毒苷 洋地黃皂苷（靈敏度法）地高辛 洋地黃毒苷 （PC）脂類藥物含量測(cè)定方法1. 酸堿滴定法熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸，用氫氧化鈉滴定液2. 重量法谷固醇含量測(cè)定，加入洋地黃皂苷3. 紫外分光光度法大豆磷脂中磷，

8、比色法；膽紅素，牛黃4. 氣相色譜法魚油多不飽和酸基因工程藥物的指控要點(diǎn)和主要方法（論述）1.1 原材料 ：主要是對(duì)目的基因、表達(dá)載體及宿主細(xì)胞（如細(xì)菌、酵母、哺乳細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞）的檢查，以及使用它們時(shí)制訂嚴(yán)格要求 1.2 培養(yǎng)過(guò)程 無(wú)論是發(fā)酵還是細(xì)胞生產(chǎn)，關(guān)鍵是保證基因的穩(wěn)定性、一致性和不被污染。主要控制的有生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)、有限代次的生產(chǎn)、連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程。 1.3 純化工藝過(guò)程 要求能保證去除微量DNA、糖類、殘余宿主蛋白質(zhì)、純化過(guò)程帶入的有害化學(xué)物質(zhì)、致熱原，或者將這類雜質(zhì)減少至允許量。1.4 最終產(chǎn)品 主要表現(xiàn)在生物學(xué)效價(jià)測(cè)定、蛋白質(zhì)純度檢查、蛋白質(zhì)的比活性、蛋白質(zhì)的性質(zhì)鑒定幾個(gè)方面。1.5

9、 雜質(zhì)檢測(cè) 蛋白類，由于降解、聚合或者錯(cuò)誤折疊而造成的目的蛋白變構(gòu)體在體內(nèi)往往會(huì)導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生；非蛋白類，主要有細(xì)菌、病毒、熱原質(zhì)和DNA幾種類型，往往在極低的水平就可以產(chǎn)生嚴(yán)重的危害作用。1.6 安全性試驗(yàn) 其中的無(wú)菌試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、安全性和毒性試驗(yàn)按我國(guó)新頒布的中國(guó)生物制品規(guī)程進(jìn)行。 2.1 蛋白質(zhì)含量 常用的方法有光吸收法、雙縮脲法、福林-酚法等。 2.2 蛋白質(zhì)純度 是一個(gè)重要的指標(biāo)。常用的方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、等電聚焦（IEF）、毛細(xì)管電泳（HPCE）、高效液相色譜（HPLC）等。 2.3 蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定 常用的方法有SDS-PAGE、HPCE、質(zhì)譜法等。2.4

10、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定 理論上，一種蛋白質(zhì)只有一個(gè)等電點(diǎn)。常用的方法有等電聚焦法等。2.5 氨基酸組成分析 常用的方法有水解蛋白質(zhì)或多肽、氨基酸衍生方法（茚三酮法、熒光胺法）等2.6 部分氨基酸序列分析 首先將氨基酸一個(gè)一個(gè)依次從蛋白質(zhì)或者多肽的末端（N端或C端）切割下來(lái)，有化學(xué)法和酶法（化學(xué)法用得較多）；然后在氨基酸殘基上衍生一個(gè)生色基團(tuán)，通過(guò)HPLC法進(jìn)行分離測(cè)定。包括N端氨基酸分析和C端氨基酸分析。2.7 肽圖分析 根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小以及氨基酸組成特點(diǎn)，使用專一性較強(qiáng)的蛋白水解酶作用于特殊的肽鏈位點(diǎn)，將蛋白質(zhì)裂解成較小的片斷，通過(guò)一定的分離檢測(cè)手段形成特征性的指紋圖譜來(lái)進(jìn)行分析。 例：在同一根色譜柱上測(cè)出：正庚烷，正辛烷和未知物的調(diào)整保留時(shí)間分別為14.08s，25.11s和16.32s，試計(jì)算它們的保留指數(shù)I。解：由定義可知： I庚=100×7=700 I辛=100×8=800由求出保留指數(shù)與文獻(xiàn)保留指數(shù)對(duì)照可知未知物為甲苯。雜志限量計(jì)算題雜質(zhì)限量%=雜志最大允許量/供試品量*100%=標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積*標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度/供試品量*100%即L=V*c/S*100%例1：檢查某藥物中的砷鹽，取標(biāo)準(zhǔn) 砷溶液2mL（每1mL相當(dāng)于1mg的As）制備 標(biāo)準(zhǔn)砷斑