生物制藥論文

1、1 引言還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，簡稱GSH）是一種具有重要生理功能的活性三肽，它由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成。谷胱甘肽在體內(nèi)以兩種形式存在，即還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，簡稱GSSH）。通常人們所指的谷胱甘肽是還原型谷胱甘肽。還原型谷胱甘肽很容易被氧化，兩分子谷胱甘肽的活潑巰基氧化脫氫后以二硫鍵相連得到的二聚體，即是氧化型谷胱甘肽。其中只有還原型谷胱甘肽才具有生理活性，而生物體內(nèi)的氧化型谷胱甘肽須經(jīng)還原后才能發(fā)揮生理功能。GSH在自然界中廣泛分布于動物、植物和微生物細(xì)胞內(nèi)，其中以酵母、小麥胚芽、玉米胚以及人和動物肝

2、臟、腎、紅細(xì)胞和眼睛晶狀體中含量較為豐富。自1888年，法國科學(xué)家Rey-pahlade首先在酵母抽提物中發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽以來，科學(xué)家一直在努力研究它在各種生物體內(nèi)的含量及其相應(yīng)的生理作用，并逐漸發(fā)現(xiàn)它在醫(yī)藥、食品、飼料及其他行業(yè)的重要用途。2 谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及分布2.1 谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)谷胱甘肽是一種由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的生物活性三肽物質(zhì)?；瘜W(xué)名為：N (N L GlutamylLcysteinyl) glycine，即N (N L 谷氨酰L半胱氨酰)甘氨酸。其中谷氨酸是以- 羧基與半胱氨酸形成的肽鍵，因為它含有游離的- SH 基，所以常用GSH 來表示，分子式為

3、C10H17N3O6S其分子式結(jié)構(gòu)如圖。圖2-1 谷胱甘肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)式2.2 谷胱甘肽的性質(zhì)谷胱甘肽(GSH)的相對分子量為30733，熔點為189193。晶體呈無色透明細(xì)長粒狀，等電點為5.93。它溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。谷胱甘肽固體較為穩(wěn)定，而水溶液在空氣中則易被氧化，兩分子還原型谷胱甘肽(GSH)的活潑巰基氧化縮合為二硫鍵，即得到氧化型谷胱甘肽(GSSG)。用離子式表示時，可以看成是失電子氧化(SH化合物為弱酸，H+由SH基來)。2RCH2一S一2e+2eRCH2一SSCH2一R此反應(yīng)可逆，所以谷胱甘肽具有氧化還原的作用。在氧化型谷胱甘肽(GSH)和還原型

4、谷胱甘肽(GSSH)中，只有還原型谷胱甘肽才具有生理活性，而生物體內(nèi)的氧化型谷胱甘肽需要還原后才能發(fā)揮其重要的生理功能。因此，我們在提取谷胱甘肽時，可以在溶液中加入具有強(qiáng)還原性的物質(zhì)如維生素C等，當(dāng)存在這些強(qiáng)還原性的物質(zhì)時可以保護(hù)谷胱甘肽不容易被氧化。2.3 谷胱甘肽的分布還原型谷胱甘肽廣泛存在于自然界中，動物肝臟、酵母和植物胚芽中都有豐富的GSH，其中玉米胚中還原型谷胱甘肽的含量約為l12126mg100g。人和動物的血液中也會有較多的GSH，細(xì)胞中的含量約為0.510mmolL，而植物組織的GSH含量則較低，許多植物如蔬菜、豆類、谷物、薯類、菇類等也含有一定量的GSH，在乳制品、谷物和熟食

5、品中含量較低，如表2-1所示還原型谷胱甘肽在一些動植物中的含量。表2-1 還原型谷胱甘肽的動、植物組織中的含量名 稱 含 量 玉米胚 112126 小麥胚 98107 番茄 2433 蘑菇 0.060.08 狗血 1422 鼠肝 801433 谷胱甘肽的應(yīng)用谷胱甘肽中半胱氨酸側(cè)鏈上的巰基是谷胱甘肽許多重要生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。谷胱甘肽廣泛分布與有機(jī)體中，是細(xì)胞內(nèi)非蛋白硫氫基團(tuán)的主要組成部分，在生物體內(nèi)具有多種重要的生理功能，所以在食品工業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。3.1 谷胱甘肽在食品工業(yè)中的應(yīng)用(1)面制品加工：把谷胱甘肽加入面制品中能起還原作用，并且還起到強(qiáng)化氨基酸的作用；(2)奶制品及嬰兒

6、食品加工：在奶制品如酸奶及兒童食品中加入谷胱甘肽起到抗氧化的作用，能增強(qiáng)嬰兒食品及奶制品營養(yǎng)價值；(3)魚類及罐頭加工：谷胱甘肽具有抗氧化作用，在魚類加工時加入它，可以抑制核酸的分解，強(qiáng)化食品的風(fēng)味，在水果罐頭加工過程中加入谷胱甘肽，可以防止水果褐變，保持食品的誘人的色澤而提高了產(chǎn)品的質(zhì)量；(4)肉制品及奶酪等食品加工：在此類食品的加工過程中也可以加入谷胱甘肽。起的作用是抗氧化劑，強(qiáng)化食品的風(fēng)味；(5)在保健性功能食品應(yīng)用上，有關(guān)專家認(rèn)為，功能性食品將是這方面的發(fā)展趨勢，而功能性食品的發(fā)展方向中，幫助人體排毒和泄毒的功能性食品將是發(fā)展主流，其原因是眾所周知的，而GSH則是為數(shù)不多的能符合此發(fā)展

7、潮流的重要功能因子之一。谷胱甘肽作為食品的添劑優(yōu)于其他防腐、抗氧化劑，對人體的健康有益。所以，隨著我國食品加工工業(yè)的不斷發(fā)展，谷胱甘肽必將在我國食品加工工業(yè)得到廣泛的應(yīng)用。3.2 谷胱甘肽在醫(yī)藥方面的應(yīng)用谷胱甘肽在醫(yī)藥方面的主要功能主要表現(xiàn)為：解毒，輻射病及輻射防護(hù)，保護(hù)肝臟，抗過敏，養(yǎng)顏、美容、護(hù)膚，增加視力及眼科疾病的治療，抗衰老作用。近年來大量臨床資料表明，谷胱甘肽具有廣泛的應(yīng)用前景，主要表現(xiàn)在：在肝損傷中的應(yīng)用，治療藥物性急性腎損害中的應(yīng)用，在治療帕金森病中的應(yīng)用，在急性缺血性腦血管疾病中的應(yīng)用，在治療急性乙醇中毒中的應(yīng)用，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，延長紅細(xì)胞壽命。4 玉米胚細(xì)胞的特點及獲得4.

8、1 玉米胚細(xì)胞的特點玉米胚粉的組成見表4-1，玉米濕法制取淀粉，得到的玉米胚粉除含有蛋白質(zhì)外，還含有脂肪、灰分、水分、淀粉和纖維。在玉米胚熱水浸提之前，如果不把脂肪、淀粉等雜質(zhì)除去，在浸提過程中易氧化，影響浸提效果，一些氨基酸和還原糖之間易發(fā)生美拉德反應(yīng)，給產(chǎn)品帶來一些如顏色過深等不良的影響，并給以后的分離純化工藝帶來一定的困難。另外，除去其中大部分的脂肪和淀粉，使得到的玉米胚中蛋白質(zhì)含量大增，更有利于浸提的進(jìn)行。表4-1 玉米胚粉的組成原料成分 水分 蛋白質(zhì) 脂肪 淀粉 纖維 谷胱甘肽 灰分含量（%） 3.8 19.87 58.54 4.15 3.54 0.091 9.754.2 細(xì)胞獲得的

9、方法和途徑玉米胚中的GST在其內(nèi)源代謝和對異源物質(zhì)的代謝中均有一定的作用。在白楊和玉米胚細(xì)胞中，-ECS（谷氨酰半胱氨酸合成酶）和-ECS同源物過表達(dá)均會大大增加植物細(xì)胞中谷胱甘肽生物合成及相互作用的過片中谷胱甘肽的含量，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米胚中過量表達(dá)GSH，可使植物具有高效生產(chǎn)谷胱甘肽的能力。5 玉米胚細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)5.1 初始愈傷組織誘導(dǎo)取轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米胚的外植體，切成5mm×5 mm的小塊，接種在加有激素的基本培養(yǎng)基上，即MS + 2, 4 - D 0.1 mg/L +NAA 1.5 mg/L+ 6 - BA 0.3 mg/L ，在28下暗培養(yǎng)，13d后得到初始愈傷組織。5

10、.2 愈傷組織的繼代選取長勢較好的愈傷組織繼代培養(yǎng)，在MS +2, 4 - D 0.1 mg/L +NAA 1.5 mg/L + 6 - BA 0.3mg/L培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。5.3 脆散性愈傷組織的獲得按已確定的生長培養(yǎng)基配方配制固體生長培養(yǎng)基MS + 2, 4-D 0.1 mg/L +NAA 1.5 mg/L+ 6 - BA 0.3 mg/L，選擇長勢較好、黃白色的愈傷組織進(jìn)行繼代，8下暗培養(yǎng)。第4代后獲得脆散性愈傷組織。5.4 懸浮培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)產(chǎn)生的疏松愈傷組織先轉(zhuǎn)到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d , 作為懸浮培養(yǎng)的“種子”細(xì)胞, 再轉(zhuǎn)入懸浮培養(yǎng)基: Ls + NAA (1 mg/ L) + 2

11、 , 42D (1mg/L) + 62BA (0.105 mg/ L) + 酵母膏15 %。采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，在110rpm轉(zhuǎn)速,25±1 條件下暗中培養(yǎng)。6 影響玉米胚細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的因素6.1 不同轉(zhuǎn)速對玉米胚細(xì)胞生長及谷胱甘肽合成的影響在一定范同內(nèi)，隨著轉(zhuǎn)速的逐漸增高可促進(jìn)玉米胚細(xì)胞生長和谷胱甘肽合成，當(dāng)轉(zhuǎn)速為110 r·min-1時，細(xì)胞干重和谷胱甘肽含量達(dá)最高；但當(dāng)轉(zhuǎn)速超過130 r·min-1。時，細(xì)胞生長和胞內(nèi)谷胱甘肽含量隨著轉(zhuǎn)速的增加而降低。因此，過低或過高的轉(zhuǎn)速對玉米胚細(xì)胞生長和谷胱甘肽合成不利。6.2 不同pH值對玉米胚細(xì)胞生長及谷胱甘肽

12、合成的影響培養(yǎng)基初始pH值對玉米胚細(xì)胞的生長和谷胱甘肽的合成影響較復(fù)雜。玉米胚細(xì)胞在pH值為5.4時生長最快，細(xì)胞干重為7.92g·L-1；pH值GSH次之，細(xì)胞干重為7.515g·L-1；pH值為5.9時最適合玉米胚細(xì)胞的谷胱甘肽合成?？梢?，pH值為5.9更有利于獲得較高的谷胱甘肽產(chǎn)量。6.3 不同接種量對玉米胚細(xì)胞生長及谷胱甘肽合成的影響在一定范圍內(nèi)，隨著接種量的逐漸增加，細(xì)胞干重和谷胱甘肽含量逐漸增加，當(dāng)接種量為75g·L-1時，細(xì)胞干重和谷胱甘肽含量均最高；當(dāng)接種量增加到100 g·L-1時，細(xì)胞的生長和胞內(nèi)谷胱甘肽含量明顯降低。當(dāng)接種量低于50

13、 g·L-1時，細(xì)胞遲滯期長且生長緩慢，細(xì)胞培養(yǎng)物表層顏色暗淡；當(dāng)接種量為75 g·L-1時，細(xì)胞生長遲滯期相對較短，指數(shù)生長期細(xì)胞培養(yǎng)物為黃綠色且表層明亮；而接種量繼續(xù)增加為100 g·L-1時，培養(yǎng)液渾濁，而且有掛壁現(xiàn)象。6.4 不同溫度對玉米胚細(xì)胞生長及谷胱甘肽合成的影響溫度作為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的重要因素，對細(xì)胞分裂和生長及谷胱甘肽合成起著重要作用,生產(chǎn)實踐表明，在16 32范圍內(nèi)細(xì)胞均能生長并形成谷胱甘肽。在16 28范圍內(nèi)，細(xì)胞干重有隨培養(yǎng)溫度的升高而增加的傾向；在24 32范圍內(nèi)，谷胱甘肽含量則有隨溫度升高而下降的趨勢。經(jīng)測定，求得細(xì)胞干重在24時比28僅

14、降低1.794 g·L-1，但在24 時谷胱甘肽總量最高。因此，24左右是玉米胚細(xì)胞生長和谷胱甘肽形成和積累的最適溫度。7 谷胱甘肽的提取和檢驗方法7.1 提取還原型谷胱甘肽的工藝流程玉米胚精選及破碎細(xì)胞破壁浸提離心分離超濾柱層析離子交換分離提純等電點沉淀真空濃縮真空干燥成品。7.1.1 原料預(yù)處理由于玉米胚中混雜有碎粉、皮屑、胚根鞘等，需要用往復(fù)式雙層振動篩進(jìn)行篩理，將上述雜質(zhì)全部去除，接著用淺盤或流槽以清水連續(xù)漂洗幾次分離出胚芽，隨即灑干或烘干至水分含量10以下。在提取脂肪前，必須將玉米胚進(jìn)行破碎，破壞細(xì)胞組織，使脂肪游離。破碎作業(yè)的好壞對脫脂影響很大，破碎太粗，脂肪不能全部游離

15、出來，磨的太細(xì)可能會致使谷胱甘肽變性。為了有效的進(jìn)行玉米胚的磨碎，通常采用植物粉碎機(jī)使其粒度達(dá)到60目以上。7.1.2 玉米胚細(xì)胞的破壁在提取谷胱甘肽前，必須將玉米胚細(xì)胞進(jìn)行破碎，由于還原型谷胱甘肽存在于細(xì)胞內(nèi)，所以要得到谷胱甘肽，首先必須采用一定的破壁手段，使其充分溶。生產(chǎn)上一般使用超聲波破碎技術(shù)對玉米胚細(xì)胞進(jìn)行破壁處理。每次稱取50g玉米胚細(xì)胞，以1：10g/mL的固液比于常溫下溶解，用2mol/L的HCL溶液調(diào)pH到23，然后進(jìn)行超聲波破碎，主要工藝條件為:工作時間5s、間隔5s、超聲次數(shù)30次，溫度為室溫，輸出功率為400W。7.1.3 還原型谷胱甘肽熱水浸提取破壁后的玉米胚細(xì)胞，與蒸

16、餾水充分混合后倒入沸騰的水中，使混合液保持在90100，浸提15min后置冰水中速冷，在10000rpm速度下離心，取上清液。7.1.4 超濾過濾分離純化谷胱甘肽超濾是膜分離的一種，由于超濾膜的表面具有無數(shù)微孔，這些實際存在的不同孔徑的孔眼像篩子一樣，對溶液中的物質(zhì)起篩分作用。在推動力的作用下，小于孔徑的小分子溶質(zhì)和溶劑能透過膜上的微孔被濾出;而大于孔徑的大粒度溶質(zhì)和顆粒則被截留住，從而實現(xiàn)溶液中不同粒度分子的分離或提純。由于熱水抽提液的成分較復(fù)雜，含有一部分大分子蛋白質(zhì)和小分子肽，為得到純度較高的GSH，就要初步將大分子物質(zhì)除去。因此，生產(chǎn)上采用0.1µm的膜，0.2MPa的壓力下

17、，對熱水浸提后的溶液進(jìn)行超濾。經(jīng)過0.1µm的PES膜后，蛋白質(zhì)含量下降了66.32%，而GSH的回收率為86.28%。7.1.5 離子交換法分離純化谷胱甘肽離子交換樹脂是一種帶有活性基團(tuán)的不溶性高分子化合物，由兩部分組成，交換劑本體和活性基團(tuán)?；钚曰鶊F(tuán)是聯(lián)結(jié)在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)骨架上的官能團(tuán)。732型陽離子交換樹脂的原理是載體苯乙烯一乙二烯苯共聚樹脂具有苯環(huán)和吲哚環(huán)等集團(tuán)，對于氨基酸和肽有很強(qiáng)的親和性，隨著氨基酸和肽中碳原子數(shù)的增加，隨著蛋白質(zhì)等高分子的疏水性強(qiáng)，吸附性也就越強(qiáng)，保持在樹脂上的力便強(qiáng)，因此不易洗脫，而親水性強(qiáng)的小肽谷胱甘肽，親和性相對較弱，但在酸性條件下，GSH與該樹脂又表現(xiàn)

18、了充分的親和性，這樣提取物通過強(qiáng)酸性離子交換樹脂時，GSH與不純物一起被吸附，當(dāng)用一定濃度的氫氧化鈉溶液洗脫時，GSH與含有氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等不純物被洗脫出的先后順序不一樣，根據(jù)這一差別，就能除去GSH提取物中的一部分不純物，從而達(dá)到純化的效果。7.1.6 還原型谷胱甘肽等電點沉淀本論文根據(jù)還原型谷胱甘肽的等電點為5.93，當(dāng)其溶液的pH調(diào)整到5.93時，可使還原型谷胱甘肽沉淀出來，將上述含有GSH和NaOH的洗脫液用 1mol/L鹽酸調(diào)pH為5.93，使GSH達(dá)到等電點沉淀后離心，然后用去離子水溶解所得沉淀。7.1.7 還原型谷胱甘肽的濃縮干燥在工業(yè)化生產(chǎn)中，可以采用噴霧干燥。干燥至成品含

19、水量降到3.5%。得到淡黃色粉末物質(zhì)，提取所得的還原型谷胱甘肽固體純度一般可以達(dá)到95%以上。7.1.8 檢測將離子交換純化后的樣液收集后在紫外分光光度計下檢測，由于是用的NaOH作為洗脫液，因此溶液本身呈堿性，直接在OD230nm處有最大吸收峰。打印譜圖與標(biāo)品圖譜進(jìn)行比較，如圖7-1所示，通過離子交換可以達(dá)到較好的純化分離效果。但是圖譜右側(cè)稍向外散，沒有收回來，說明溶液中還存在極少量的與GSH分子量接近的小肽，但是樣品與標(biāo)品的出峰位置及峰形基本一致；由于不同堿濃度可以使GSH在紫外上的圖譜發(fā)生偏移，范圍在229-232nm之間，而本試驗所得到的GSH溶液的出峰位置均在229-232nm之間，因此可以確定本試驗所提物質(zhì)為還原型谷胱甘肽。圖7-1 GSH標(biāo)品與樣品的紫外圖譜比較7.2 成品包裝8 結(jié)束語GSH是一種重要的藥物，在臨床上的用途極廣，的抗氧化性能又使得它作為食品添加劑在食品加工業(yè)中倍受青睞。日本現(xiàn)已成為GSH的主要生產(chǎn)和供應(yīng)商，由于產(chǎn)量有限加之GSH的應(yīng)用范圍及用量越來越大，GSH的市場價格一