第四章固相析出分離法2013

1、n通過(guò)改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式通過(guò)改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出的操作技術(shù)。從溶液中分出的操作技術(shù)。n鹽析法鹽析法n有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法n等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法n結(jié)晶法結(jié)晶法2salt precipitation定義：定義：是利用各種生物分子是利用各種生物分子在在濃鹽溶液中溶解度的差異濃鹽溶液中溶解度的差異，通過(guò)向溶液中引入一定數(shù)量通過(guò)向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使的中性鹽，使目的物目的物或或雜蛋雜蛋白白以沉淀以沉淀析出析出，達(dá)到純化目，達(dá)到純化目的的方法。的的方法。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、較少變性簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、較少變性缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：分辨率不高，要除鹽分辨率不高，要除

2、鹽3兩種現(xiàn)象：兩種現(xiàn)象：鹽溶：鹽溶：低鹽情況，鹽離子強(qiáng)低鹽情況，鹽離子強(qiáng)度的增高，蛋白質(zhì)溶解度度的增高，蛋白質(zhì)溶解度增大。增大。鹽析：鹽析：高鹽，鹽離子強(qiáng)度增高鹽，鹽離子強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)加，蛋白質(zhì)溶解度減小。溶解度減小。42.52.01.51.00.50-0.5-1.0-1.51 2 3 4 5 6logSS0溶解度溶解度鹽濃度鹽濃度Salting-outSalting-in6n形成形成離子對(duì)離子對(duì)，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，排斥，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來(lái)。作用減弱而能相互靠攏，聚集起來(lái)。n中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白質(zhì)脫去了中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白

3、質(zhì)脫去了水化膜水化膜，使其沉淀。，使其沉淀。7loglogS S= = - -K Ks s S S蛋白質(zhì)溶解度蛋白質(zhì)溶解度，g/Lg/L； 鹽離子強(qiáng)度鹽離子強(qiáng)度, , C Ci ii i離子濃度，離子濃度，mol/Lmol/L；Z Zi ii i離子化合價(jià)；離子化合價(jià)； 常數(shù)常數(shù), ,為縱坐標(biāo)上的截距為縱坐標(biāo)上的截距; ;K Ks s鹽析常數(shù)鹽析常數(shù)。82.52.01.51.00.50-0.5-1.0-1.51 2 3 4 5 6logSS0 、 K KS Sn 是外推截距是外推截距nK KS S是鹽析常數(shù)是鹽析常數(shù)KsKs鹽析法鹽析法鹽析法鹽析法9方法方法: : （一）鹽的性質(zhì)（一）鹽的性質(zhì)

4、 鹽析能力：鹽析能力：半徑小的高價(jià)離子在鹽析時(shí)的作用半徑小的高價(jià)離子在鹽析時(shí)的作用較強(qiáng)，陰離子的鹽析效果比陽(yáng)離子好，尤其以較強(qiáng)，陰離子的鹽析效果比陽(yáng)離子好，尤其以高價(jià)陰離子高價(jià)陰離子更為明顯。更為明顯。 PO4 3-SO42CH3COOClNO3I NH4+K+Na+Li+ 鹽析用鹽要考慮幾個(gè)因素：常用硫酸銨鹽析用鹽要考慮幾個(gè)因素：常用硫酸銨11幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）毫升水）n鹽種類鹽種類 0 20 80 100 （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1

5、.6 7.8 93.8 10113-d dSP10987654321040 50 60 70 80P30g/L 3g/Ln溫度的變化會(huì)影響溫度的變化會(huì)影響 值。值。n在無(wú)鹽或稀鹽溶液中，在無(wú)鹽或稀鹽溶液中，大多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度是大多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度是隨溫度升高而增大的，隨溫度升高而增大的，但在但在高鹽溶液中常相反高鹽溶液中常相反14210log S2 3 4 250pH6.615卵清蛋白碳氧血紅蛋白765432103 4 5 6 7 8pH161718192021向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。2223一、基本原理2425 常用的溶劑有乙醇、丙酮

6、、甲醇等。常用的溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等。 許多蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近時(shí)溶解度最低，許多蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近時(shí)溶解度最低，溶液溶液pHpH應(yīng)在應(yīng)在等電點(diǎn)附近等電點(diǎn)附近，還須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)，還須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。定性。26 有機(jī)溶劑存在下，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度有機(jī)溶劑存在下，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低而顯著地減小。隨溫度降低而顯著地減小。 低鹽：低鹽：有利于沉淀，還有保護(hù)蛋白質(zhì)，防止變有利于沉淀，還有保護(hù)蛋白質(zhì)，防止變性。性。 高鹽：高鹽：增大蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑增大蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑水溶液中的溶水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夾帶鹽。解度，沉淀物中可能夾帶鹽。272829303132二、成鹽沉淀法二、

7、成鹽沉淀法333435吸附人造沸石鹽析45%飽和硫酸銨沉淀TCA透析363738酸性多糖3940n溶液中的溶質(zhì)在一定條件下，因分子有規(guī)則的排溶液中的溶質(zhì)在一定條件下，因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體，晶體的化學(xué)成分均一，具有各列而結(jié)合成晶體，晶體的化學(xué)成分均一，具有各種對(duì)稱的晶體，其特征為離子和分子在空間晶格種對(duì)稱的晶體，其特征為離子和分子在空間晶格的結(jié)點(diǎn)上呈規(guī)則的排列。的結(jié)點(diǎn)上呈規(guī)則的排列。n固體有結(jié)晶和無(wú)定形兩種狀態(tài)。固體有結(jié)晶和無(wú)定形兩種狀態(tài)。n結(jié)晶：結(jié)晶：析出速度慢，溶質(zhì)分子有足夠時(shí)間進(jìn)行排析出速度慢，溶質(zhì)分子有足夠時(shí)間進(jìn)行排列，粒子排列有規(guī)則列，粒子排列有規(guī)則n無(wú)定形固體：無(wú)定形固體：

8、析出速度快，粒子排列無(wú)規(guī)則析出速度快，粒子排列無(wú)規(guī)則- -沉淀。沉淀。41n只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過(guò)程有良好的選擇性。過(guò)程有良好的選擇性。n通過(guò)結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會(huì)留在母液中，通過(guò)結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會(huì)留在母液中，再通過(guò)過(guò)濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。再通過(guò)過(guò)濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。n結(jié)晶過(guò)程具有成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，廣結(jié)晶過(guò)程具有成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，廣泛應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、維生素、核泛應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。酸等產(chǎn)品的精制。 AFMAFM（原子力顯微鏡

9、）下的抗生素晶體（原子力顯微鏡）下的抗生素晶體 AFMAFM下的抗生素晶體層下的抗生素晶體層一、結(jié)晶過(guò)程一、結(jié)晶過(guò)程n飽和溶液：飽和溶液：當(dāng)溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等當(dāng)溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度時(shí)，該溶液稱為飽和溶液。條件下的飽和溶解度時(shí)，該溶液稱為飽和溶液。n過(guò)飽和溶液：過(guò)飽和溶液：溶質(zhì)濃度超過(guò)飽和溶解度時(shí)，該溶溶質(zhì)濃度超過(guò)飽和溶解度時(shí)，該溶液稱之為過(guò)飽和溶液。液稱之為過(guò)飽和溶液。n溶質(zhì)只有在過(guò)飽和溶液中才能析出。溶質(zhì)只有在過(guò)飽和溶液中才能析出。n溶質(zhì)溶解度與溫度、溶質(zhì)分散度（晶體大?。┯腥苜|(zhì)溶解度與溫度、溶質(zhì)分散度（晶體大?。┯嘘P(guān)。關(guān)。凱爾文（Kelvin）公式：

10、指溶質(zhì)自動(dòng)從指溶質(zhì)自動(dòng)從過(guò)飽和溶液過(guò)飽和溶液中析出形成新相的過(guò)程中析出形成新相的過(guò)程。 C C2 2 小晶體的溶解度小晶體的溶解度；C C1 1 普通晶體的溶解度；普通晶體的溶解度； 晶體密度；晶體密度；M M 晶體質(zhì)量；晶體質(zhì)量； 晶體與溶液間的界面張力；晶體與溶液間的界面張力； 2 2 小晶體的半徑小晶體的半徑； 1 1 普通晶體的半徑；普通晶體的半徑；46)11(2ln1212rrRTMCC結(jié)晶過(guò)程的實(shí)質(zhì)結(jié)晶過(guò)程的實(shí)質(zhì)n結(jié)晶是指溶質(zhì)自動(dòng)從過(guò)飽和溶液中析出，形成新結(jié)晶是指溶質(zhì)自動(dòng)從過(guò)飽和溶液中析出，形成新相的過(guò)程。相的過(guò)程。n這一過(guò)程不僅包括溶質(zhì)分子凝聚成固體，還包括這一過(guò)程不僅包括溶質(zhì)分

11、子凝聚成固體，還包括這些分子有規(guī)律地排列在一定晶格中，這一過(guò)程這些分子有規(guī)律地排列在一定晶格中，這一過(guò)程與表面分子化學(xué)鍵力變化有關(guān)。與表面分子化學(xué)鍵力變化有關(guān)。n因此，結(jié)晶過(guò)程是一個(gè)因此，結(jié)晶過(guò)程是一個(gè)表面化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。表面化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。晶體的形成晶體的形成n形成新相（固體）需要一定的表面自由能。因此，形成新相（固體）需要一定的表面自由能。因此，溶液濃度達(dá)到飽和溶解度時(shí)，晶體尚不能析出，溶液濃度達(dá)到飽和溶解度時(shí)，晶體尚不能析出，只有當(dāng)溶質(zhì)濃度超過(guò)飽和溶解度后，才可能有晶只有當(dāng)溶質(zhì)濃度超過(guò)飽和溶解度后，才可能有晶體析出。體析出。n首先形成晶核，由首先形成晶核，由KelvinKelvin公式，微小

12、的晶核具有公式，微小的晶核具有較大的溶解度。實(shí)質(zhì)上，在飽和溶液中，晶核是較大的溶解度。實(shí)質(zhì)上，在飽和溶液中，晶核是處于一種處于一種形成形成溶解溶解再形成再形成的動(dòng)態(tài)平衡之中，的動(dòng)態(tài)平衡之中，只有達(dá)到一定的過(guò)飽和度以后，晶核才能夠穩(wěn)定只有達(dá)到一定的過(guò)飽和度以后，晶核才能夠穩(wěn)定存在存在。n過(guò)飽和度過(guò)飽和度S：*ccS 最先析出的微小顆粒是以后晶體的中心，稱為晶核。最先析出的微小顆粒是以后晶體的中心，稱為晶核。晶體的形成過(guò)程：晶體的形成過(guò)程： 過(guò)飽和溶液的形成過(guò)飽和溶液的形成 晶核的形成晶核的形成 晶體生長(zhǎng)晶體生長(zhǎng)其中，其中，溶液達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)是結(jié)晶的前提；過(guò)溶液達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)是結(jié)晶的前提；過(guò)飽和度

13、是結(jié)晶的推動(dòng)力。飽和度是結(jié)晶的推動(dòng)力。溫度與溶解度的關(guān)系溫度與溶解度的關(guān)系n由于物質(zhì)在溶解時(shí)要吸收熱量、結(jié)晶時(shí)要由于物質(zhì)在溶解時(shí)要吸收熱量、結(jié)晶時(shí)要放出結(jié)晶熱。因此，結(jié)晶也是一個(gè)質(zhì)量與放出結(jié)晶熱。因此，結(jié)晶也是一個(gè)質(zhì)量與能量的傳遞過(guò)程，它與體系溫度的關(guān)系十能量的傳遞過(guò)程，它與體系溫度的關(guān)系十分密切。分密切。n溶解度與溫度的關(guān)系可以用飽和曲線和過(guò)溶解度與溫度的關(guān)系可以用飽和曲線和過(guò)飽和曲線表示。飽和曲線表示。（飽和區(qū)）53 飽和曲線和過(guò)飽和曲線飽和曲線和過(guò)飽和曲線穩(wěn)定區(qū)介穩(wěn)區(qū)不穩(wěn)定區(qū)區(qū)域名稱不飽和區(qū)（溶解區(qū)）亞穩(wěn)區(qū) 過(guò)飽和區(qū)區(qū)域范圍曲線0下方曲線0和2之間曲線2上方溶液特點(diǎn)不飽和溶液 略過(guò)飽和溶

14、液過(guò)飽和溶液液相與溶質(zhì)晶體關(guān)系無(wú)晶體析出現(xiàn)象，外加晶體溶解晶核不會(huì)自動(dòng)形成，但誘導(dǎo)可以產(chǎn)生，若有晶體存在可以長(zhǎng)大可以自然產(chǎn)生大量晶核，晶體也可長(zhǎng)大表表 各區(qū)域內(nèi)溶液特性及其與溶質(zhì)晶體關(guān)系各區(qū)域內(nèi)溶液特性及其與溶質(zhì)晶體關(guān)系55l蒸發(fā)法蒸發(fā)法58 60三、晶核的形成三、晶核的形成(1) (1) 初級(jí)成核初級(jí)成核: :過(guò)飽和溶液中的自發(fā)成核現(xiàn)象。過(guò)飽和溶液中的自發(fā)成核現(xiàn)象。a a 均相成核：沒有外來(lái)表面的均相溶液中。均相成核：沒有外來(lái)表面的均相溶液中。b b 非均相成核：外來(lái)表面的溶液中。非均相成核：外來(lái)表面的溶液中。(2) (2) 二次成核：向介穩(wěn)態(tài)過(guò)飽和溶液中加入晶種，二次成核：向介穩(wěn)態(tài)過(guò)飽和溶

15、液中加入晶種，會(huì)有新晶核產(chǎn)生。會(huì)有新晶核產(chǎn)生。機(jī)理機(jī)理: : 附著在晶體表面的微小晶體受到剪切作用，附著在晶體表面的微小晶體受到剪切作用，或碰撞而脫離晶體，形成新的晶核?；蚺鲎捕撾x晶體，形成新的晶核。四、晶體的生長(zhǎng)四、晶體的生長(zhǎng)n在過(guò)飽和溶液中已有晶核形成或加入晶種后，在過(guò)飽和溶液中已有晶核形成或加入晶種后，以過(guò)飽和度為推動(dòng)力，晶核或晶種將長(zhǎng)大，以過(guò)飽和度為推動(dòng)力，晶核或晶種將長(zhǎng)大，稱為晶體的生長(zhǎng)。稱為晶體的生長(zhǎng)。n是以濃度差推動(dòng)力的擴(kuò)散傳質(zhì)和晶體表面反是以濃度差推動(dòng)力的擴(kuò)散傳質(zhì)和晶體表面反應(yīng)（晶格排列）的兩步串連過(guò)程。應(yīng)（晶格排列）的兩步串連過(guò)程。63（二）晶體形狀（二）晶體形狀 改變晶體外形，可用改變晶體外形，可用: :選擇不同的溶劑、選擇不同的溶劑、控制控制過(guò)飽和度、過(guò)飽和度、結(jié)晶溫度結(jié)晶溫度、調(diào)節(jié)溶液的、調(diào)節(jié)溶液的pHpH和有目的地和有目的地加入某種能改變晶形的雜質(zhì)等。加入某種