核酸檢測培訓(xùn)

1、 核 酸 檢 測主要內(nèi)容 為什么要做核酸檢測？ 核酸是什么？ 怎樣進(jìn)行核酸檢測？ 市場狀況為什么要做核酸檢測？ 核酸檢測（基因檢測） 現(xiàn)知人類的疾病都與基因有直接或間接的關(guān)系。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室所要檢測和分析的核酸既包括人體本身的基因(DNA ) 以及反映基因轉(zhuǎn)錄水平的mRNA , 也包括侵入人體的致病微生物等所攜帶的外源性基因(DNA/RNA )。 傳統(tǒng)檢測試劑（酶免傳統(tǒng)檢測試劑（酶免ELISAELISA）技術(shù)特點(diǎn)技術(shù)特點(diǎn)： 檢測目標(biāo)為蛋白檢測目標(biāo)為蛋白, , 所檢測的主要是疾病所所檢測的主要是疾病所引發(fā)的人體抗體而不是病原體本身引發(fā)的人體抗體而不是病原體本身, ,是一種間是一種間接、滯后的檢測方式

2、。易操作，成本低。接、滯后的檢測方式。易操作，成本低。 固有不足固有不足：不能夠消除對不能夠消除對“窗口期窗口期”標(biāo)本標(biāo)本( (抗體陰性抗體陰性, ,核酸陽性核酸陽性) )的漏檢的漏檢難于檢測病原體的不同亞型及突變型難于檢測病原體的不同亞型及突變型不典型血清陽轉(zhuǎn)不典型血清陽轉(zhuǎn)對免疫逃避或免疫沉寂的標(biāo)本產(chǎn)生漏檢對免疫逃避或免疫沉寂的標(biāo)本產(chǎn)生漏檢核酸檢測核酸檢測 顯著縮短窗口期:HIV窗口期縮短45%，HCV縮 短89%，HBV縮短50%。 提 高 靈 敏 度:理論上擴(kuò)增體系中單拷貝的模板 也能被檢測出。 特 異 性 好:使用熒光探針技術(shù)的PCR檢測， 幾乎沒有方法學(xué)的假陽性。 直接揭示病原體的存

3、在 對操作者及檢測環(huán)境的要求較高 檢測成本相對較高輸血中可傳染病原體的輸血中可傳染病原體的“窗口期窗口期”病毒種類病毒種類ELISAELISA檢測項(xiàng)目檢測項(xiàng)目窗口期窗口期窗口期檢測率窗口期檢測率國家或地區(qū)國家或地區(qū)HBVHCVHIV核酸檢測在臨床診斷中的應(yīng)用 定性診斷 血液篩查 病原體篩查診斷 SNP和耐藥突變診斷 基因型分型 遺傳病診斷 個體用藥診斷 基因鑒定和配型 定量檢測核 酸 是 什 么？ 核酸（Nucleic Acid）是一種主要位于細(xì)胞核內(nèi)的生物大分子，其充當(dāng)著生物體遺傳信息的攜帶和傳遞。核酸廣泛存在于所有動物、植物細(xì)胞、微生物內(nèi)。 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近2000種遺傳性疾病都和DNA結(jié)構(gòu)有關(guān)

4、。腫瘤的發(fā)生、病毒的感染、射線對機(jī)體的作用等都與核酸有關(guān)。 核酸分類：DNA、RNA； DNA：dATP（A）、dTTP（T）、 dCTP（C）、dGTP（G）； RNA：ATP、UTP、CTP、GTP； 35磷酸鍵DNA結(jié)構(gòu) 單鏈DNA形成雙鏈的原則 堿基互補(bǔ)配對： G-C T-A核酸在體內(nèi)的復(fù)制DNADNA的熱變性DNA受熱，會解開雙鏈互補(bǔ)狀態(tài)，形成單鏈；降溫會恢復(fù)雙鏈狀態(tài)怎樣進(jìn)行核酸檢測？核酸檢測的一般流程 核酸樣品的制備： 從血液、體液、組織中提取或PCR擴(kuò)增 樣品的檢測： 核酸雜交、PCR、熒光定量PCR、PCR-ELISA等 結(jié)果判讀： 電泳、膜、熒光定量PCR儀等核 酸 雜 交

5、核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對規(guī)律形成雙邊結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測樣品的不同又被分為DNA印跡交（Southern blot hybridization ）和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization）。核酸提取核酸提取PCR擴(kuò)增擴(kuò)增探針點(diǎn)膜探針點(diǎn)膜交聯(lián)交聯(lián)雜交雜交顯色顯色結(jié)果判讀結(jié)果判讀PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學(xué)技

6、術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。 DNA的復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。 PCR的產(chǎn)生實(shí)時熒光PCR 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行分析的方法,可以進(jìn)行定量和定性檢測。 熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定

7、的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。 每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。 熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料SYBR Green I序列特異性探針Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特異性探針 Amplifluor (Intergen)SYBRGREEN 雙探針雜交分子信標(biāo) Taqman 引物特異探針 性質(zhì) 可逆熒光 積累熒光 熔點(diǎn)分析 能不能特異性 引物（非特異性擴(kuò)增或引物二聚體有影響）

8、 引物2探針 引物探針 引物探針 引物（非特異性擴(kuò)增或引物二聚體有影響） 探針無有有有無通用性通用專用專用專用專用探針特點(diǎn)SYBR Green 融解曲線分析SYBR Green法優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn): 對DNA模板沒有選擇性 適用于任何DNA 使用方便-不必設(shè)計復(fù)雜探針 非常靈敏 便宜TaqMan探針法TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)市 場 狀 況使用技術(shù)使用儀器HBV、HIV、HCV、HPV 、TB、HCMV、淋球菌、解脲脲原體、肺炎支原體、沙眼衣原體、單純皰疹病毒型、地中海貧血、缺失型-地中海貧血、淋球菌、血篩試劑PCR熒光探針法PCR-反向點(diǎn)雜交法熒光定量PCR儀PCR儀HBV、HCV、新型冠狀病毒、血篩試

9、劑PCR熒光探針法PCR-酶免熒光定量PCR儀酶免相關(guān)儀器HBV、HIV、HPV、TB、HCV、沙眼衣原體、新型冠狀病毒PCR熒光探針法熒光定量PCR儀HBV、HCV、TB、沙眼衣原體、新型冠狀病毒PCR熒光探針法熒光定量PCR儀HBV、TB、HPVPCR熒光探針法熒光定量PCR儀凱普、港龍以HPV檢測為主。浩源血篩試劑已進(jìn)入審批階段。羅氏、生物梅里埃公司有HIV檢測試劑盒，均以各自公司的專利技術(shù)為主研發(fā)?，F(xiàn)狀和趨勢1、現(xiàn)狀：公司多、競爭激烈、同質(zhì)化；手工操作為主；缺乏規(guī)范；核心技術(shù)少；2、趨勢：管理部門逐漸加強(qiáng)管理，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制訂中；進(jìn)口試劑以全自動診斷平臺為主在國內(nèi)推廣，國內(nèi)廠家漸進(jìn)推出自動

10、化核酸提取儀器進(jìn)入市場；實(shí)時熒光PCR檢測的難點(diǎn)1、大規(guī)模適合自動化核酸提取的樣品制備技術(shù)2、適合篩查應(yīng)用的多重PCR技術(shù)3、高通量全自動的核酸提取設(shè)備和耗材4、高通量檢測設(shè)備和配套耗材的成本控制5、質(zhì)量控制和質(zhì)量管理方法6、核心原料的成本控制試劑質(zhì)量控制方法1、實(shí)驗(yàn)室分類和功能化2、人員培訓(xùn)和自我約束3、建立切實(shí)可行的質(zhì)量控制方法 和管理體系核酸檢測在臨床診斷中的應(yīng)用 定性診斷 血液篩查 病原體篩查診斷 SNP和耐藥突變診斷 基因型分型 遺傳病診斷 個體用藥診斷 基因鑒定和配型 定量檢測核酸檢測的一般流程 核酸樣品的制備： 從血液、體液、組織中提取或PCR擴(kuò)增 樣品的檢測： 核酸雜交、PCR

11、、熒光定量PCR、PCR-ELISA等 結(jié)果判讀： 電泳、膜、熒光定量PCR儀等 熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。 每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。 SYBRGREEN 雙探針雜交分子信標(biāo) Taqman 引物特異探針 性質(zhì) 可逆熒光 積累熒光 熔點(diǎn)分析 能不能特異性 引物（非特異性擴(kuò)增或引物二聚體有影響） 引物2探針 引物探針 引物探針 引物（非特異性擴(kuò)增或引物二聚體有影響） 探針無有有有無通用性通用專用專用專用專用探針特點(diǎn)SYBR Green 融解曲線分析使用技術(shù)使用儀器HBV、HIV、HCV、HPV 、TB、HCMV、淋球菌、解脲脲原體、肺炎支原體、沙眼衣原體、單純皰疹病毒型、地中海貧血、缺失型-地中海貧血、淋球菌、血篩試劑PCR熒光探針法PCR-反向點(diǎn)雜交法熒光定量PCR儀PCR儀HBV、HCV、新型冠狀病毒、血篩試劑PCR熒光探針法PCR-酶免熒光定量PCR