流式細(xì)胞儀檢測凋亡和細(xì)胞周期等應(yīng)用課件

1、第一頁，共五十九頁。什么(shn me)是流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀實(shí)物(shw)BD FACSVantageBD-Calibur 第二頁，共五十九頁。第三頁，共五十九頁。第四頁，共五十九頁。4. 應(yīng)用應(yīng)用(yngyng)范圍范圍第五頁，共五十九頁。二、流式細(xì)胞儀的工作二、流式細(xì)胞儀的工作(gngzu)原理和基本結(jié)原理和基本結(jié)構(gòu)構(gòu)液柱與激光束相交液柱與激光束相交(xingjio)，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號變成電信號輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析。熒光信號變成電信號輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析。第六頁，共五十九頁。第七頁，共五十九頁?；净?jbn)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)第八頁

2、，共五十九頁。三、 流式細(xì)胞儀可檢測(jin c)到的細(xì)胞參數(shù)顆粒顆粒(kl)度度細(xì)胞大小細(xì)胞大小=前向角散射光（前向角散射光（FSCFSC）細(xì)胞相對大小及其表面積細(xì)胞相對大小及其表面積 =側(cè)向角散射光（側(cè)向角散射光（SSCSSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性復(fù)雜性第九頁，共五十九頁。血液血液(xuy)涂涂片片第十頁，共五十九頁。外周全外周全(zhuqun)(zhuqun)血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖圖第十一頁，共五十九頁。第十二頁，共五十九頁。 熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。 定量染色定量染色 熒光信號大小熒光

3、信號大小 被標(biāo)記組分含量被標(biāo)記組分含量(hnling)(hnling)的定量的定量 多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測量多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測量第十三頁，共五十九頁。二色鏡 1 2 3帶通濾波片光電倍增管激光束細(xì)胞收集透鏡前向散射光側(cè)向散射光，熒光光信號分離，導(dǎo)向光信號分離，導(dǎo)向各探測各探測(tnc)(tnc)通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號。通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號。光信號光信號(xnho)收集收集第十四頁，共五十九頁。三三 數(shù)據(jù)處理及數(shù)據(jù)處理及流式報(bào)告(bogo)FSC SSC FL1 FL2 FL3對數(shù)對數(shù)(du sh) 線性線性 線性線性 線性線性 對數(shù)對數(shù)脈沖(michng)處理

4、，模數(shù)轉(zhuǎn)換光信號電信號記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果（面積，峰高，寬度）第十五頁，共五十九頁。第十六頁，共五十九頁。 散點(diǎn)圖 密度(md)圖二維等高圖直方圖圖 報(bào)告中常見(chn jin)的幾種流式細(xì)胞圖第十七頁，共五十九頁。圖 Annexin V/PI雙標(biāo)記(bioj)分析細(xì)胞凋亡和壞死第十八頁，共五十九頁。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析第十九頁，共五十九頁。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析第二十頁，共五十九頁。圖中100101（M1）為陰性細(xì)胞(xbo)，101以上的（M2）為陽性細(xì)胞 第二十一頁，共五十九頁。 五、 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用(yngyng)第二十二頁，共五十九頁。（Propidiu

5、m iodide碘化丙啶），碘化丙啶）， 第二十三頁，共五十九頁。第二十四頁，共五十九頁。圖中2N代表G0/G1期細(xì)胞(xbo)，4N代表G2/M期細(xì)胞(xbo)，兩者中間代表S期細(xì)胞(xbo)。這是以2倍體和4倍體細(xì)胞(xbo)為主的流式DNA圖 第二十五頁，共五十九頁。DNA細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析(fnx)細(xì)胞周期細(xì)胞周期 200 400 600 8001000DNA含量含量(hnling)細(xì)細(xì)胞胞數(shù)數(shù)量量第二十六頁，共五十九頁。第二十七頁，共五十九頁。2倍體倍體異倍體異倍體4倍體倍體腫瘤腫瘤(zhngli)組織中的各種組織中的各種DNA倍體倍體第二十八頁，共五十九頁。含量含量(hnli

6、ng)與凋亡關(guān)系與凋亡關(guān)系第二十九頁，共五十九頁。第三十頁，共五十九頁。第三十一頁，共五十九頁。第三十二頁，共五十九頁。1. 腫瘤腫瘤(zhngli)診斷診斷第三十三頁，共五十九頁。2倍體倍體異倍體異倍體4倍體倍體腫瘤腫瘤(zhngli)組織中的各種組織中的各種DNA倍倍體體第三十四頁，共五十九頁。第三十五頁，共五十九頁。2. 凋亡凋亡(dio wn)研究研究第三十六頁，共五十九頁。第三十七頁，共五十九頁。Annexin V Assay第三十八頁，共五十九頁。圖 Annexin V/PI雙標(biāo)記(bioj)分析細(xì)胞凋亡和壞死第三十九頁，共五十九頁。Date acquired: 14-Jan-03

7、File: 7Gy 4hr.001Source: dongboDIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 圖圖 FCM測試細(xì)胞測試細(xì)胞(xbo)周周 期分布和凋亡期分布和凋亡第四十頁，共五十九頁。根據(jù)凋亡細(xì)胞根據(jù)凋亡細(xì)胞(xbo)的特點(diǎn)來檢測的特點(diǎn)來檢測第四十一頁，共五十九頁。 三）三）第四十二頁，共五十九頁。第四十三頁，共五十九頁。第四十四頁，共五十九頁

8、。流式細(xì)胞術(shù)檢測(jin c)細(xì)胞表型 第四十五頁，共五十九頁。 四）四）白血病的免疫白血病的免疫(miny)分型分型 第四十六頁，共五十九頁。 五）五） 細(xì)胞內(nèi)蛋白細(xì)胞內(nèi)蛋白(dnbi)的分析：的分析：第四十七頁，共五十九頁。熒光熒光(ynggung)(ynggung)信信號號第四十八頁，共五十九頁。熒光樣本熒光樣本(yngbn)(yngbn)制備制備雙色直接雙色直接(zhji)染色染色第四十九頁，共五十九頁。 端粒（熒光端粒（熒光(ynggung)蛋白）蛋白）第五十頁，共五十九頁。第五十一頁，共五十九頁。FCM檢測(jin c)胞內(nèi)鈣離子、膜電位和線粒體功能第五十二頁，共五十九頁。M1陰性

9、界限劃分(hu fn)完全是根據(jù)陰性對照！如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎(chǔ)表達(dá)量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎(chǔ)水平、未受刺激時(shí)等。藍(lán)色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。第五十三頁，共五十九頁。 六六. 分選：分選：第五十四頁，共五十九頁。488 nm laser+-Fluorescence Activated Cell SortingCharged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector第五十五頁，共五十九頁。流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀顯

10、微鏡顯微鏡流動(dòng)的細(xì)胞流動(dòng)的細(xì)胞靜止的細(xì)胞樣本靜止的細(xì)胞樣本數(shù)量大數(shù)量大數(shù)量少數(shù)量少高速分選高速分選樣本難以再利用樣本難以再利用細(xì)胞群體特征量分布細(xì)胞群體特征量分布揭示細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息揭示細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息第五十六頁，共五十九頁。流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀蛋白電泳蛋白電泳多參數(shù)多參數(shù)單參數(shù)單參數(shù)量化的分布量化的分布平均值平均值容易檢測各個(gè)參數(shù)間的容易檢測各個(gè)參數(shù)間的相關(guān)性相關(guān)性不容易不容易第五十七頁，共五十九頁。第五十八頁，共五十九頁。流式細(xì)胞儀檢測凋亡和細(xì)胞周期等應(yīng)用內(nèi)容(nirng)總結(jié)流式細(xì)胞術(shù)。在分析的同時(shí)可把具有指定特征的細(xì)胞分離出來，即分選技術(shù)。液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。側(cè)向角散射光（