食品免疫學免疫檢測技術(shù)與食品安全檢測

1、第八章 免疫學技術(shù) 第一節(jié) 抗原抗體的制備一、抗原的制備制備特異性的抗原是制的合格抗體的前提條件，而作為檢測診斷的抗原也必須是純化的抗原?？乖奈镔|(zhì)很多，很少是單一成分，必須從復雜的組分中提取分離。按抗原的物理狀態(tài)，可分為天然抗原、人工抗原和合成抗原三類。1、天然抗原的制備（1）顆粒性天然抗原常見的顆?？乖▌游?、植物、微生物的細胞，和有關(guān)的細胞組成結(jié)構(gòu)，如細胞的細胞壁、線粒體，細菌的鞭毛和菌毛等。一般步驟為：首先收集抗原細胞或（和）擴增培養(yǎng)，然后離心或過濾收集細胞或細胞組成結(jié)構(gòu)物，再進行病原微生物滅活。（2）可溶性抗原的分離純化蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶、補體、細菌毒素、免疫球蛋白片段、核

2、酸等皆為良好的可溶性抗原，免疫前常需純化。 細胞破碎方法有：凍融法；超聲破碎；高速組織搗碎機法；研磨法；溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶處理 可溶性蛋白抗原的分離方法：離心分離法：差速離心、密度梯度離心選擇沉淀法：鹽析沉淀法；有機溶劑沉淀法，常采用乙醇或丙酮核酸去除法，DNA酶、RNA酶處理；水溶性非離子型聚合物沉淀法：常用非離子型聚合物為分子量為20006000的聚乙二醇（PEG）凝膠過濾法 ：又稱分子篩層析。通過凝膠分子篩作用，可將大、中、小三類分子分開，選擇凝膠柱時應注意選用適于分離范圍內(nèi)的凝膠。 離子交換層析法：離子交換層析是利用一些帶電離子基團的凝膠或纖維素吸附帶有相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。親和

3、層析法：親和層析是利用生物分子間所具有的專一性親和力而設計的層析技術(shù)。如抗原和抗體、酶和酶抑制物、酶蛋白和輔酶、激素和受體、DNA和RNA等之間有特殊親和力，一定條件下，兩者可緊密結(jié)合成復合物，如將復合物的一方固定于固相載體上，則可從溶液中分離和提純另一方。 純化抗原的鑒定 主要對純化抗原的含量、理化性質(zhì)、純度及免疫活性進行鑒定，常用方法有酚試劑法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、免疫電泳法、免疫雙擴散法等。2、人工抗原的制備人工抗原指經(jīng)過人工修飾的半抗原，即將半抗原與載體連接后形成的完全抗原。小分子半抗原可以是多糖、多肽、核酸、類固醇激素、某些藥物及其它化學物品。在食品檢驗中常見的小分子半抗原有各種農(nóng)

4、藥、獸藥、添加劑與非法添加物（鹽酸克倫特羅）、真菌毒素等等。常用載體：蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大分子聚合物。蛋白質(zhì)：常用牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、卵清白蛋白（OVA）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白（RSA)。 多肽聚合物：常用多聚賴氨酸。 大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素(CMC)等皆可與半抗原結(jié)合，加入弗氏佐劑課產(chǎn)生良好的抗體。連接方法：物理法 是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過電荷和微孔來吸半抗原，吸附載體主要有PVP和CMC等；化學法 是利用某些功能基團把半抗原連接到蛋白質(zhì)類或多肽類聚合物載體上。不同的半抗原應選

5、用不同的方法進行連接。根據(jù)半抗原擁有的化學基團不同，連接方法主要有以下幾類：帶游離氨基或羧基以及二種基團皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合。帶有羥基、酮基、醛基的半抗原：不能直接與載體連接，需要用化學方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羥胺法等方法將之轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌锖蟛拍芘c載體連接。帶有酚基的半抗原：可用一氯醋酸鈉法或重氮化的對氨基苯甲酸法，生成帶有羧基的半抗原衍生物。3、免疫佐劑某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應答或改變免疫應答類型，此類物質(zhì)稱為佐劑(adjuvant) 。 應用

6、最多的佐劑為福氏佐劑福氏不完全：石蠟油+羊毛脂福氏完全：石蠟油+羊毛脂+卡介苗乳劑的制備：乳劑：抗原與佐劑的混合物抗原與佐劑的比例為1:1，注射前要充分乳化二、多克隆抗體的制備1、免疫動物的選擇選擇動物時應考慮以下因素：ü 抗原來源與動物種屬的關(guān)系?？乖膩碓磁c免疫動物種屬差異越遠，其免疫源性越強，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。ü 動物個體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動物（以雄性為佳）；ü 抗體的用途和量：抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動物。2、免疫方法選定動物后，在免疫過程

7、中應考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。痹。（1） 免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強弱、動物的個體狀態(tài)和免疫時間來確定。小鼠首次劑量50-400 ug/次。大鼠：100-1000 ug/次。兔子：200-1000 ug/次。加強免疫劑量為首次劑量的1/5-2/5。（2） 免疫途徑與免疫間隔時間免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結(jié)免疫法。 免疫間隔時間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時間尤為重要，一般以23周為佳，二次后間隔時間一般為1周，若間隔時間太長，則刺激減弱，抗體效價不

8、高。 3、動物采血采集免疫血清前，要預先測試抗體效價測定，若效價達到要求，應在末次免疫后一周及時采血，否則抗體效價會下降。 (1) 頸動脈采血法 (2) 心臟采血法 (3) 靜脈采血法4、免疫血清的鑒定（1） 效價的測定 效價，又叫滴度，是稀釋度的倒數(shù)，指通過血清學方法能顯示一定反應的抗體或抗血清的最高稀釋倍數(shù)，如終點稀釋度為1/100，效價 (每1ml的血清中抗體效價)為100抗體單位。顆粒性抗原可采用凝集試驗。 可溶性抗原常用雙向免疫擴散試驗、ELISA等方法。（2）特異性的鑒定 抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴散法、免疫電泳法。（3） 純度的鑒定 抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳

9、（SDS-PAGE）、雙向擴散試驗、免疫電泳等方法。（4） 親和力的鑒定 抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強度。 測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗等。5、免疫血清的保存 （1）4保存（6個月）（2）低溫保存（-70 -20 ，5年）（3）真空干燥保存（5 10年）注意點：保存前需經(jīng)除菌 保存液含防腐劑 避免反復凍融（分裝）三、單克隆抗體的制備單抗：由一個識別單一抗原決定簇（表位）的B細胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。單抗制備過程1、致敏淋巴細胞的準備2、骨髓瘤細胞的準備3、飼養(yǎng)層細胞的準備4、細胞融合5、選擇性培養(yǎng)6、特異性抗體的檢測7、雜交瘤細胞的克隆化8、雜交瘤

10、細胞的凍存與復蘇9、單克隆抗體的大量制取10、單克隆抗體的純化第二節(jié) 抗原抗體反應抗原-抗體反應（antigen-antibody reaction）是指抗原與相應抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合的反應。 血清學反應（serological reaction）指體外的抗原-抗體反應。一、抗原抗體反應的原理（1）抗原抗體親和力靜電引力（electrostatic forces）范德華引力:作用最?。╲an der Waals interactions）氫鍵:最具特異性（hydrogen bond ）疏水作用力:作用最大 （hydrophobic interactions） （2）抗原抗體親水膠體

11、轉(zhuǎn)化為疏水膠體抗體、大多數(shù)抗原亦為蛋白質(zhì)，在水中皆為膠體溶液，不會發(fā)生自然沉淀。抗原抗體結(jié)合使電荷減少或消失，蛋白質(zhì)由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。如再加入電解質(zhì)，則進一步使疏水膠體物相互靠攏，形成可見的抗原抗體復合物。二、抗原-抗體反應特點1、特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應的專一性分子基礎：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間化學結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型的互補。2、可逆性可逆性：抗原與相應抗體結(jié)合成復合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性 影響因素： 抗體對相應抗原的親和力親和力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離 環(huán)境因素對復合物的影響pH、離子強度 3、比例性比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應需遵循一定的量比

12、關(guān)系前帶(prezone)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等價帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適4、階段性 第一階段：特異性結(jié)合階段，反應快，不可見。 第二階段：反應可見階段，反應慢，出現(xiàn)凝集、 沉淀和細胞溶解等現(xiàn)象。 三、抗原-抗體反應類型 反應類型實驗技術(shù)非標記凝集反應直接凝集試驗、間接凝集試驗、間接抑制凝集試驗、協(xié)同凝集試驗沉淀反應液相內(nèi)凝集試驗、凝膠內(nèi)凝集試驗補體參與的反應補體溶血試驗、補體結(jié)合試驗中和反應病毒中和試驗、毒素中和試驗標記標記免疫反應熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)第三節(jié) 非標記免疫分析技術(shù) 一、凝集反應

13、（agglutination）細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結(jié)合后形成肉眼可見的凝集塊現(xiàn)象，稱為凝聚反應。用于凝集反應中的抗原稱凝集原(agglutinogen)。用于凝集反應中的抗體稱凝集素（agglutinin)。1. 直接凝集反應顆粒抗原與抗體直接結(jié)合玻片法：細菌及ABO血型鑒定試管法：2. 間接凝集反應 抗原（或抗體）吸附于載體+相應抗體（或抗原）凝集 常用載體：乳膠顆粒、羊紅細胞二、沉淀反應(precipitation) 沉淀反應指可溶性抗原與其相應的抗體在合適條件下反應并出現(xiàn)沉淀物的現(xiàn)象。 用于沉淀反應中的抗原稱沉淀原(precipitonogen)。 用于沉淀反應中的抗體稱沉

14、淀素（precipitin) 。 1. 液相內(nèi)沉淀環(huán)狀沉淀反應：小試管內(nèi)，下層沉淀素與上層沉淀原在界面應，形成白色沉淀環(huán)。絮狀沉淀反應：抗原抗體溶液混合，在電解質(zhì)存在下，兩者結(jié)合出現(xiàn)可見的絮狀沉淀。2. 凝膠內(nèi)沉淀（1）單向瓊脂擴散試驗 是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當位置打孔后將抗原加入孔中擴散?？乖跀U散過程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關(guān)。本法常用于測定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量（2）雙向免疫擴散 是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周圍擴散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應體系中含兩種

15、以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性 、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測。（3）對流免疫電泳是先將待側(cè)血清標本作瓊脂凝膠電泳，血清中各蛋白組分被分成不同的區(qū)帶，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應的抗血清，把分成區(qū)帶的蛋白抗原成分作雙向免疫擴散，在各區(qū)帶相應的位置形成沉淀弧。該法常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失。（4） 火箭電泳 將單向免疫擴散與電泳技術(shù)結(jié)合，可快速測定標本中可溶性抗原的含量。（5）免疫比濁法 該技術(shù)是利用抗原抗體復合物在液相中形成濁度來測量抗原含量的方法。方法：ü 透射光比濁法ü 散射光比濁法

16、52; 免疫乳膠比濁法ü 速率抑制免疫比濁法三、補體參加的反應此類反應是利用抗體與紅細胞表面相應抗原結(jié)合后，使反應體系中補體激活導致紅細胞破壞，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象建立的。是在補體參與下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統(tǒng)，來檢測未知的抗原或抗體的血清學試驗。四、中和試驗（病毒、毒素）原理：病毒、細菌、毒素與相應抗體特異結(jié)合后，喪失生物活性。用途：1. 用已知血清鑒定病毒、細菌、毒素、獸藥殘留等。2. 用已知病毒、細菌檢測血清抗體測定抗體免疫血清效價（中和價）。第四節(jié) 免疫標記分析技術(shù)用標記抗體或抗原進行抗原抗體反應l 抗原抗體反應與標記技術(shù)結(jié)合，定位、定量、定性測定。l 標記物：熒光素、酶、

17、放射性核素、化學發(fā)光物質(zhì)、膠體金等。l 類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、同位素標記技術(shù)等。一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 用酶標記的抗體或抗抗體來進行的抗原抗體反應常用的酶：辣根過氧化酶、堿性磷酸酶 常用底物：鄰苯二胺（OPD）ü 用酶標記Ab(或Ag)與標本中的Ag(或Ab)發(fā)生特異性結(jié)合。ü 加入酶的底物，在酶作用下產(chǎn)生有色物質(zhì),ü 根據(jù)顏色可作出判斷或測量光密度值。二、免疫熒光法(異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白) v 直接法 ：用已知熒光標記的抗體檢測未知抗原。v 間接法： 用熒光標記的抗抗

18、體，檢測未知的抗原/抗體。v 補體法：三、放射免疫法v 將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反應的特異性結(jié)合起來的技術(shù)，測定激素和藥物。v 常用I125和I131v 快速，敏感（pg)，但污染環(huán)境，有一定的危害性。四、免疫膠體金技術(shù)v Immunological colloidal gold signaturev 是用膠體金顆粒標記抗體或抗原，用以檢測未知抗原或抗體的技術(shù)，可用于多種液相免疫測定和固相免疫分析。v 免疫層析法：immunochromatography五、化學發(fā)光免疫分析v Chemiluminescence immunoassayv 標記物：魯米諾等。v 是將化學發(fā)光分析和免疫反應相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。六、免疫印跡法（Western blotting)v 先將抗原經(jīng)SDS-PAGE電泳分開，再將分開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜上，然后放入含有抗體的溶液中，洗去未結(jié)合抗體，再加標記的二抗，通過顯色或發(fā)光顯示結(jié)果。第五節(jié) 免疫細胞及其功能檢測檢測各群體淋巴細胞的數(shù)量與功能是觀察機體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測標本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細胞。實驗動物還可取胸腺、脾、淋巴結(jié)等作為標本