青霉素的生產(chǎn)工藝

1、青霉素生產(chǎn)工藝 摘要：青霉素是一種重要的抗生素，在目前的制藥工業(yè)中占有舉足輕重的地位，生產(chǎn)規(guī)模非常大。通過數(shù)十年的完善，青霉素針劑和口服青霉素已能分別治療肺炎、肺結(jié)核、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、白喉、炭疽等病，增強(qiáng)了人類治療傳染性疾病的能力。研究和優(yōu)化其生產(chǎn)工藝對(duì)人類健康有重要意義。關(guān)鍵詞;青霉素；生產(chǎn)工藝抗生素在目前的制藥工業(yè)中仍占有舉足輕重的地位，尤其是下游半合成抗生素的發(fā)展，進(jìn)一步刺激了上游的工業(yè)發(fā)酵。一些抗生素的工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模非常大，如-內(nèi)酰胺類的青霉素、頭孢菌素C，大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素、利福霉素，氨基環(huán)醇類的鏈霉素、慶大霉素。其它的一些抗生素，如林可霉素、四環(huán)素、金霉素、萬古霉素等，單個(gè)發(fā)酵罐容

2、積越來越大，100 m3的發(fā)酵罐被普遍采用，200 m3甚至更大容積的發(fā)酵罐經(jīng)?？梢妶?bào)道。抗生素的工業(yè)生產(chǎn)包括發(fā)酵和提取兩部分。工藝流程大致如下：菌種的保藏、孢子制備、種子制備、發(fā)酵、提取和精制。種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的常用碳源有：葡萄糖、淀粉、蔗糖、油脂、有機(jī)酸等，主要為菌體生長(zhǎng)代謝提供能源，為合成菌體細(xì)胞和目的產(chǎn)物提供碳元素。有機(jī)氮源多用玉米漿、黃豆餅粉、麩質(zhì)粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉等，硫酸銨、尿素、氨水、硝酸鈉、硝酸銨則是常用的無機(jī)氮源。另外，培養(yǎng)基中還得添加無機(jī)鹽、微量元素以及消沫劑，部分抗生素還得加入特殊前體，如青霉素的前體是苯乙酸，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的前體是丙酸鹽。發(fā)酵過程普遍補(bǔ)加一種碳源

3、、氮源物質(zhì)，如葡萄糖和硫酸銨。pH值通過流加氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)，很多抗生素在發(fā)酵中后期流加前體，對(duì)提高產(chǎn)量非常有益。抗生素發(fā)酵絕大多數(shù)為好氧培養(yǎng)，必須連續(xù)通入大量無菌空氣，全過程大功率攪拌。發(fā)酵液的預(yù)處理，一般加絮凝劑沉淀蛋白，過濾去除菌絲體，發(fā)酵濾液的提取常用溶媒萃取法、離子交換樹脂法、沉淀法、吸附法等提純濃縮，然后結(jié)晶干燥得純品?，F(xiàn)在來介紹一下青霉素的生產(chǎn)工藝。一、 青霉素概述青霉素是抗菌素的一種，是指從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素。青霉素類抗生素是-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱。但它不能耐受

4、耐藥菌株(如耐藥金葡)所產(chǎn)生的酶，易被其破壞，且其抗菌譜較窄，主要對(duì)革蘭氏陽性菌有效。最初青霉素的生產(chǎn)菌是音符型青霉菌，生產(chǎn)能力只有幾十個(gè)單位，不能滿足工業(yè)需要。隨后找到了適合于深層培養(yǎng)的橄欖型青霉菌，即產(chǎn)黃青霉（P. chrosogenum），生產(chǎn)能力為100U/ml。經(jīng)過X、紫外線誘變，生產(chǎn)能力達(dá)到10001500U/ml。隨后經(jīng)過誘變，得到不產(chǎn)生色素的變種，目前生產(chǎn)能力可達(dá)6600070000U/ml。青霉素是抗生素工業(yè)的首要產(chǎn)品。中國(guó)為青霉素（penicillin）生產(chǎn)大國(guó)，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的青霉素，已占世界產(chǎn)量的近70%，國(guó)內(nèi)較大規(guī)模的生產(chǎn)企業(yè)有華藥、哈醫(yī)藥、石藥、魯抗，單個(gè)發(fā)酵罐規(guī)模均在1

5、00 m3以上，發(fā)酵單位在70000 U/ml左右，而世界青霉素工業(yè)發(fā)酵水平達(dá)100000 U/ml以上。青霉素應(yīng)用臨床應(yīng)用：40多年，主要控制敏感金黃色葡糖球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌、螺旋體等引起感染，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌）和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體有抗菌作用。二、發(fā)酵條件下的生長(zhǎng)過程第1期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡。第2期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜堿性，類脂肪小顆粒。第3期：形成脂肪包涵體，機(jī)理貯藏物，沒有空泡，嗜堿性很強(qiáng)。第4期：脂肪包涵體形成小滴并減少，中小空泡，原生質(zhì)體嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性

6、染色大顆粒，菌絲呈桶狀，脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高。第6期：出現(xiàn)個(gè)別自溶細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)無顆粒，仍然桶狀。釋放游離氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁。鏡檢：規(guī)定時(shí)間取樣，顯微鏡觀察7個(gè)時(shí)期的形態(tài)變化，控制發(fā)酵。14期為菌絲生長(zhǎng)期，3期的菌體適宜為種子。45期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過工程措施，延長(zhǎng)此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前結(jié)束發(fā)酵。三、 青霉素的發(fā)酵工藝過程青霉素生產(chǎn)流程：     發(fā)酵工藝過程（1）生產(chǎn)孢子的制備將砂土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng)，經(jīng)傳代活化。最適生長(zhǎng)溫度在2526 ，培養(yǎng)68天，得單菌

7、落，再傳斜面，培養(yǎng)7天，得斜面孢子。移植到優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)7天，25，制得小米孢子。每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定效價(jià)及雜菌情況。（2）種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝種子培養(yǎng)要求產(chǎn)生大量健壯的菌絲體，因此，培養(yǎng)基應(yīng)加入比較豐富的易利用的碳源和有機(jī)氮源。青霉素采用三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子發(fā)酵：發(fā)芽罐.小罐，接入小米孢子后，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基成分：葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等。通無菌空氣，空氣流量1：3（體積比）；充分?jǐn)嚢?00350r/min；4050小時(shí)；pH自然，溫度27±1。二級(jí)發(fā)酵罐：繁殖罐.大量繁殖。玉米漿、葡萄糖等。1：11.5；2502

8、80r/min；pH自然，25±1；014h。三級(jí)發(fā)酵罐：生產(chǎn)罐?；ㄉ灧郏ǜ邷兀熧|(zhì)粉、玉米漿、葡萄糖，尿素，硫酸銨，硫酸鈉、硫代硫酸鈉，磷酸二氫鈉，苯乙酰胺及消泡劑，CaCO3等。接種量為1215%。青霉素的發(fā)酵對(duì)溶氧要求極高，通氣量偏大，通氣比控制0.71.8；150200r/min；要求高功率攪拌，100 m3的發(fā)酵罐攪拌功率在200300 Kw，罐壓控制0.040.05 MPa，于2526 下培養(yǎng)，發(fā)酵周期在200h左右。前60h，pH5.76.3，后6.36.6；前60h為26，以后24。四、發(fā)酵過程控制反復(fù)分批式發(fā)酵，100m3發(fā)酵罐，裝料80m3，帶放610次，間隔

9、24h。帶放量10，發(fā)酵時(shí)間204h。發(fā)酵過程需連續(xù)流加補(bǔ)入葡萄糖、硫酸銨以及前體物質(zhì)苯乙酸鹽，補(bǔ)糖率是最關(guān)鍵的控制指標(biāo)，不同時(shí)期分段控制。在青霉素的生產(chǎn)中，讓培養(yǎng)基中的主要營(yíng)養(yǎng)物只夠維持青霉菌在前40h生長(zhǎng)，而在40h后，靠低速連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖和氮源等，使菌半饑餓，延長(zhǎng)青霉素的合成期，大大提高了產(chǎn)量。所需營(yíng)養(yǎng)物限量的補(bǔ)加常用來控制營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌種，使代謝產(chǎn)物積累到最大。（1） 培養(yǎng)基青霉素發(fā)酵中采用補(bǔ)料分批操作法，對(duì)葡萄糖、銨、苯乙酸進(jìn)行緩慢流加，維持一定的最適濃度。葡萄糖的流加，波動(dòng)范圍較窄，濃度過低使抗生素合成速度減慢或停止，過高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至引起自溶，葡萄糖濃度調(diào)節(jié)是根據(jù)pH

10、，溶氧或CO2釋放率予以調(diào)節(jié)。碳源的選擇：生產(chǎn)菌能利用多種碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。經(jīng)濟(jì)核算問題，生產(chǎn)成本中碳源占12以上，對(duì)工藝影響很大；糖與6-APA結(jié)合形成糖基-6-APA，影響青霉素的產(chǎn)量。葡萄糖、乳糖結(jié)合能力強(qiáng)，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。通常采用葡萄糖和乳糖。發(fā)酵初期，利用快效的葡萄糖進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)。當(dāng)葡萄糖耗竭后，利用緩效的乳糖，使pH穩(wěn)定，分泌青霉素?？筛鶕?jù)形態(tài)變化，滴加葡萄糖，取代乳糖。目前普遍采用淀粉的酶水解產(chǎn)物，葡萄糖化液流加。降低成本。氮源：玉米漿是最好的，是玉米淀粉生產(chǎn)時(shí)的副產(chǎn)品，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。玉米漿質(zhì)量不穩(wěn)定，可用花

11、生餅粉或棉籽餅粉取代。補(bǔ)加無機(jī)氮源。無機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵有毒，控制在30µg/ml以下。流加控制：補(bǔ)糖，根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。殘?zhí)窃?.6左右，pH開始升高時(shí)加糖。補(bǔ)氮：流加酸酸銨、氨水、尿素，控制氨基氮0.05%。添加前體：合成階段，苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可為青霉素側(cè)鏈的前體，直接摻入青霉素分子中。也具有刺激青霉素合成作用。但濃度大于0.19時(shí)對(duì)細(xì)胞和合成有毒性。還能被細(xì)胞氧化。策略是流加低濃度前體，一次加入量低于0.1%，保持供應(yīng)速率略大于生物合成的需要。（2）溫度一生長(zhǎng)適宜溫度30，分泌青霉素溫度20。但20青霉素破壞少，

12、周期很長(zhǎng)。生產(chǎn)中采用變溫控制，不同階段不同溫度。前期控制2526左右，后期降溫控制23。過高則會(huì)降低發(fā)酵產(chǎn)率，增加葡萄糖的維持消耗，降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化得率。有的發(fā)酵過程在菌絲生長(zhǎng)階段采用較高的溫度，以縮短生長(zhǎng)時(shí)間，生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。（3）pH合成的適宜pH6.46.6左右，避免超過7.0，青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定，易水解。緩沖能力弱的培養(yǎng)基，pH降低，意味著加糖率過高造成酸性中間產(chǎn)物積累。pH上升，加糖率過低不足以中和蛋白產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)。前期pH控制在5.76.3，中后期pH控制6.36.6，通過補(bǔ)加氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH較低時(shí)，加入CaCO3、通氨調(diào)節(jié)或提

13、高通氣量。pH上升時(shí)，加糖或天然油脂。一般直接加酸或堿自動(dòng)控制，流加葡萄糖控制。（4）溶氧溶氧30飽和度，產(chǎn)率急劇下降，低于10，則造成不可逆的損害。所以不能低于30飽和溶氧濃度。通氣比一般為1：0.8VVM。溶氧過高，菌絲生長(zhǎng)不良或加糖率過低，呼吸強(qiáng)度下降，影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。適宜的攪拌速度，保證氣液混合，提高溶氧，根據(jù)各階段的生長(zhǎng)和耗氧量不同，對(duì)攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整。（5）菌絲生長(zhǎng)速度與形態(tài)、濃度對(duì)于每個(gè)有固定通氣和攪拌條件的發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行的特定好氧過程，都有一個(gè)使氧傳遞速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上達(dá)到平衡的臨界菌絲濃，超過此濃度，OUROTR，溶氧水平下降，發(fā)酵產(chǎn)率下降。在發(fā)

14、酵穩(wěn)定期，濕菌濃可達(dá)1520%，絲狀菌干重約3%，球狀菌干重在5%左右。另外，因補(bǔ)入物料較多，在發(fā)酵中后期一般每天帶放一次，每次放掉總發(fā)酵液的10%左右。有絲狀生長(zhǎng)和球狀生長(zhǎng)兩種。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質(zhì)及氧接觸，比生產(chǎn)率高，發(fā)酵粘度低，氣/液兩相中氧的傳遞率提高，允許更多菌絲生長(zhǎng)。球狀菌絲形態(tài)的控制，與碳、氮源的流加狀況，攪拌的剪切強(qiáng)度及稀釋度相關(guān)。（6）消沫發(fā)酵過程泡沫較多，需補(bǔ)入消沫劑。天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵。少量多次。不適在前期多加入，影響呼吸代謝。青霉素的發(fā)酵過程控制十分精細(xì)，一般2 h取樣一次，測(cè)定發(fā)酵液的pH、菌濃、殘?zhí)?、殘氮、苯乙酸濃度、青霉素效價(jià)

15、等指標(biāo)，同時(shí)取樣做無菌檢查，發(fā)現(xiàn)染菌立即結(jié)束發(fā)酵，視情況放過濾提取，因?yàn)槿揪髉H值波動(dòng)大，青霉素在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就會(huì)被全部破壞。五、青霉素的提煉工藝過程青霉素提純工藝流程簡(jiǎn)圖： 青霉素不穩(wěn)定，發(fā)酵液預(yù)處理、提取和精制過程要條件溫和、快速，防止降解。1.預(yù)處理發(fā)酵液結(jié)束后，目標(biāo)產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，而且濃度較低，如抗生素只有1030Kg/m3，含有大量雜質(zhì)，它們影響后續(xù)工藝的有效提取，因此必須對(duì)其進(jìn)行的預(yù)處理，目的在于濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過程。是進(jìn)行分離純化的一個(gè)工序。2.過濾發(fā)酵液在萃取之前需預(yù)處理，發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白，然后經(jīng)真

16、空轉(zhuǎn)鼓過濾或板框過濾，除掉菌絲體及部分蛋白。青霉素易降解，發(fā)酵液及濾液應(yīng)冷至10 以下，過濾收率一般90%左右。（1）菌絲體粗長(zhǎng)10µm，采用鼓式真空過濾機(jī)過濾，濾渣形成緊密餅狀，容易從濾布上刮下。濾液pH6.27-7.2，蛋白質(zhì)含量0.05-0.2%。需要進(jìn)一步除去蛋白質(zhì)。（2）改善過濾和除去蛋白質(zhì)的措施：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土為助濾劑。再通過板框式過濾機(jī)。濾液澄清透明，進(jìn)行萃取。3.萃取青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機(jī)溶媒中，調(diào)節(jié)pH，再轉(zhuǎn)入

17、中性水相，反復(fù)幾次萃取，即可提純濃縮。選擇對(duì)青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取23次。從發(fā)酵液萃取到乙酸丁酯時(shí)，pH選擇1.8-2.0，從乙酸丁酯反萃到水相時(shí)，pH選擇6.8-7.4。發(fā)酵濾液與乙酸丁酯的體積比為1.5-2.1，即一次濃縮倍數(shù)為1.5-2.1。為了避免pH波動(dòng)，采用硫酸鹽、碳酸鹽緩沖液進(jìn)行反萃。發(fā)酵液與溶劑比例為34。幾次萃取后，濃縮10倍，濃度幾乎達(dá)到結(jié)晶要求。萃取總收率在85左右。所得濾液多采用二次萃取，用10%硫酸調(diào)pH2.03.0，加入醋酸丁酯，用量為濾液體積的三分之一，反萃取時(shí)常用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH7.08.0。在一次丁酯萃取時(shí)，由于濾液含有

18、大量蛋白，通常加入破乳劑防止乳化。第一次萃取，存在蛋白質(zhì)，加0.05-0.1%乳化劑PPB。萃取條件：為減少青霉素降解，整個(gè)萃取過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行（10 以下）。萃取罐冷凍鹽水冷卻。4.脫色萃取液中添加活性炭，除去色素、熱源，過濾，除去活性炭。5.結(jié)晶萃取液一般通過結(jié)晶提純。青霉素鉀鹽在醋酸丁酯中溶解度很小，在二次丁酯萃取液中加入醋酸鉀-乙醇溶液，青霉素鉀鹽就結(jié)晶析出。然后采用重結(jié)晶方法，進(jìn)一步提高純度，將鉀鹽溶于KOH溶液，調(diào)pH至中性，加無水丁醇，在真空條件下，共沸蒸餾結(jié)晶得純品。直接結(jié)晶：在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸鈉乙醇溶液反應(yīng)，得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀乙醇溶液，得到青霉素鉀鹽。共沸蒸餾結(jié)晶：萃取液，再用0.5 M NaOH萃取，pH6.4-4.8下得到鈉鹽水