項(xiàng)目葡萄糖酸鈣口服液的微生物限度檢查ppt

1、重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥物分析教研室 項(xiàng)目項(xiàng)目10 10 葡萄糖酸鈣口服液的微生物限度檢查葡萄糖酸鈣口服液的微生物限度檢查主要內(nèi)容主要內(nèi)容 概概 述述 一一 菌種及培養(yǎng)基菌種及培養(yǎng)基 方法的驗(yàn)證試驗(yàn)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)藥品的微生物限度檢查藥品的微生物限度檢查三三 四五 供試液的制備供試液的制備二二 Page Page 3 3一、一、 概概 述述一、概述一、概述（一）定義（一）定義系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。（二）藥物制劑的微生物檢查的意義（二）藥物制劑的微生物檢查的意義1確定藥物是確定藥物是否污染或其否污染或其污染程度，污染程

2、度，控制藥品的控制藥品的質(zhì)量；質(zhì)量；2保證用藥的保證用藥的有效性和安有效性和安全性；全性；3可作為衡量可作為衡量藥品生產(chǎn)全藥品生產(chǎn)全過(guò)程衛(wèi)生質(zhì)過(guò)程衛(wèi)生質(zhì)量的指標(biāo)之量的指標(biāo)之一。一。1微生物總數(shù)檢查 包括細(xì)菌數(shù)、真菌數(shù)及酵母菌數(shù)檢查。2控制菌檢查 包括大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及梭菌的檢查。3螨類檢查 螨類不屬于微生物，但從微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定“霉變、長(zhǎng)螨者以不合格論”來(lái)講，習(xí)慣將螨類歸在微生物限度檢查范圍內(nèi)。（三）微生物限度檢查的內(nèi)容（三）微生物限度檢查的內(nèi)容（四）微生物限度檢查的基本原則（四）微生物限度檢查的基本原則1.1.檢查應(yīng)在檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度環(huán)境潔凈

3、度1000010000級(jí)下的局部潔凈度級(jí)下的局部潔凈度100100級(jí)的單級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守進(jìn)行。檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作無(wú)菌操作，防止再污染。，防止再污染。2.2.單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法的的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。3.3.供試品檢查時(shí)，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活供試品檢查時(shí)，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。劑

4、，應(yīng)證明其有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。4.4.細(xì)菌、控制菌細(xì)菌、控制菌培養(yǎng)溫度為培養(yǎng)溫度為30303535；霉菌、酵母菌霉菌、酵母菌培養(yǎng)培養(yǎng)溫度為溫度為23232828。5.5.檢驗(yàn)結(jié)果以檢驗(yàn)結(jié)果以1g1g、1ml1ml、10g10g、10ml10ml或或10cm10cm2 2為單位報(bào)告，特為單位報(bào)告，特殊品種可以最小包裝單位報(bào)告。殊品種可以最小包裝單位報(bào)告。 （五）微生物限度檢查的技術(shù)要求（五）微生物限度檢查的技術(shù)要求一次試驗(yàn)所用的供試品量一次試驗(yàn)所用的供試品量(g(g、mlml或或cmcm2 2) )。除另有規(guī)定外，除另有規(guī)定外，一般供試品一般供試品的檢驗(yàn)量為的檢驗(yàn)量為10g10g或或10ml

5、10ml；膜劑膜劑為為100cm100cm2 2；貴重藥品、；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查查沙門菌沙門菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加 20g20g或或20ml20ml（其中（其中10g10g或或10ml10ml用于陽(yáng)性對(duì)照試用于陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)）驗(yàn)） 。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2 2個(gè)以上個(gè)以上最小包裝單位中抽最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還取供試品，膜劑還不得少于不得少于4 4片片。一般應(yīng)。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的包裝單位）的3 3倍量供試品倍量供試品。（

6、六）抽樣量和檢驗(yàn)量（六）抽樣量和檢驗(yàn)量 非無(wú)菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑和對(duì)患者健康潛在的危害以及中藥的特殊性而制訂的。藥品的生產(chǎn)、貯存、銷售過(guò)程中的檢驗(yàn)，中藥提取物及輔料的檢驗(yàn)，新藥標(biāo)準(zhǔn)制訂，進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核，考察藥品質(zhì)量及仲裁等，除另有規(guī)定外，其微生物限度均以本標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)、制劑通則、品種項(xiàng)下要求無(wú)菌的制劑及標(biāo)示無(wú)菌的制劑無(wú)菌的制劑及標(biāo)示無(wú)菌的制劑 應(yīng)符合無(wú)菌檢查法規(guī)定。、口服給藥制劑、口服給藥制劑1不含藥材原粉的制劑（1）細(xì)菌數(shù)：每1g不得過(guò)1000cfu（菌落形成單位）；每1ml不得過(guò)100cfu。（2）真菌和酵母菌數(shù)：每1g或1m

7、l不得過(guò)100cfu。（3）大腸埃希菌：每1g或1ml不得檢出。2含藥材原粉的制劑（1）細(xì)菌數(shù)：每1g不得過(guò)10 000cfu（丸劑每1g不得過(guò)30 000cfu）；每1ml不得過(guò)500cfu。（2）真菌和酵母菌數(shù)：每1g或1ml不得過(guò)100cfu。（3）大腸埃希菌：每1g或1ml不得檢出。（4）大腸菌群：每1g應(yīng)小于100個(gè)；每1ml應(yīng)小于10個(gè)。（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)3含豆豉、神曲等發(fā)酵原粉的制劑（1）細(xì)菌數(shù)：每1g不得過(guò)100 000cfu；每1ml不得過(guò)1000cfu。（2）真菌和酵母菌數(shù)：每1g不得過(guò)500cfu；每1ml不得過(guò)100cfu。（3）大腸埃希菌：每1g

8、或1ml不得檢出。（4）大腸菌群：每1g應(yīng)小于100個(gè)；每1ml應(yīng)小于10個(gè)。（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)2用于表皮或黏膜不完整的含藥材原粉的局部給藥制劑（1）細(xì)菌數(shù)：每1g或10cm2不得過(guò)1000cfu；每1ml不得過(guò)100cfu。（2）真菌和酵母菌數(shù)：每1g、1ml或10cm2不得過(guò)100cfu。（3）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌：每1g、1ml或10cm2不得檢出。3用于表皮或黏膜完整的含藥材原粉的局部給藥制劑（1）細(xì)菌數(shù)：每1g或10cm2不得過(guò)10 000cfu；每1ml不得過(guò)100cfu。（2）真菌和酵母菌數(shù)：每1g、1ml或10cm2不得過(guò)100cfu。（3）金黃色

9、葡萄球菌、銅綠假單胞菌：每1g、1ml或10cm2不得檢出。4耳、鼻及呼吸道吸入給藥制劑（1）細(xì)菌數(shù)：每1g、1ml或10cm2不得過(guò)100cfu。（2）真菌和酵母菌數(shù)：每1g、1ml或10cm2不得過(guò)10cfu。（3）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌：每1g、1ml或10cm2不得檢出。（4）大腸埃希菌：鼻及呼吸道給藥的制劑每1g、1ml或10cm2不得檢出 （七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)5陰道、尿道給藥制劑（1）細(xì)菌數(shù)：每1g、1ml或10cm2不得過(guò)100cfu。（2）真菌和酵母菌數(shù)：每1g、1ml或10cm2應(yīng)小于10cfu。（3）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、梭菌、白色念珠菌：

10、每1g、1ml或10cm2不得檢出。6直腸給藥制劑（1）細(xì)菌數(shù)：每1g不得過(guò)1000cfu；每1ml不得過(guò)100cfu。（2）真菌和酵母菌數(shù)：每1g或1ml不得過(guò)100cfu。（3）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌：每1g或1ml不得檢出。7其他局部給藥制劑（1）細(xì)菌數(shù)：每1g、1ml或10cm2不得過(guò)100cfu。（2）真菌和酵母菌數(shù)：每1g、1ml或10cm2不得過(guò)100cfu。（3）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌：每1g、1ml或10cm2不得檢出。（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)、含動(dòng)物組織（包括臟器提取物）及動(dòng)物類原藥材、含動(dòng)物組織（包括臟器提取物）及動(dòng)物類原藥材粉（蜂蜜、王漿、動(dòng)

11、物角、阿膠除外）的口服給藥制粉（蜂蜜、王漿、動(dòng)物角、阿膠除外）的口服給藥制劑劑每10g或10ml還不得檢出沙門菌。、有兼用途徑的制劑、有兼用途徑的制劑應(yīng)符合各給藥途徑的標(biāo)準(zhǔn)。、霉變、長(zhǎng)螨者、霉變、長(zhǎng)螨者以不合格論。、中藥提取物及輔料、中藥提取物及輔料參照相應(yīng)制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（七）微生物限度標(biāo)準(zhǔn)Page Page 1717二、二、 藥品供試液的制備藥品供試液的制備二、樣品供試液的制備二、樣品供試液的制備 根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需

12、加溫時(shí)，應(yīng)備供試液。供試液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱均勻加熱，且溫度不應(yīng)，且溫度不應(yīng)超過(guò)超過(guò)45。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過(guò)超過(guò)1小小時(shí)時(shí) 。 中國(guó)藥典中國(guó)藥典現(xiàn)行版附錄中提供了現(xiàn)行版附錄中提供了液體供試品、固體、半液體供試品、固體、半固體或黏稠性供試品固體或黏稠性供試品以及以及需用特殊方法制備供試液的供試品需用特殊方法制備供試液的供試品的的供試液制備方法。供試液制備方法。 需用特殊方法制備供試液的供試品有：需用特殊方法制備供試液的供試品有：非水溶性供試品、非水溶性供試品、膜劑供試品、腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品、氣霧劑、噴霧劑供試膜劑供試品、腸溶

13、及結(jié)腸溶制劑供試品、氣霧劑、噴霧劑供試品、貼劑供試品及具抑菌活性的供試品。品、貼劑供試品及具抑菌活性的供試品。 Page Page 1919三、三、 菌種和培養(yǎng)基菌種和培養(yǎng)基（一）菌種（一）菌種 1 1、細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)檢查的對(duì)照試驗(yàn)菌種：、細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)檢查的對(duì)照試驗(yàn)菌種： 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、 白色念珠菌白色念珠菌、黑曲霉黑曲霉2 2、控制菌檢查的對(duì)照菌種、控制菌檢查的對(duì)照菌種 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌門菌、銅綠假單胞菌

14、、生孢梭菌、白色念珠菌 三、菌種和培養(yǎng)基三、菌種和培養(yǎng)基三、菌種及培養(yǎng)基三、菌種及培養(yǎng)基（二）培養(yǎng)基（二）培養(yǎng)基1.細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查常用的培養(yǎng)基：檢查常用的培養(yǎng)基： 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。2.控制菌檢查控制菌檢查常用的培養(yǎng)基：常用的培養(yǎng)基：用于菌液制備的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等常規(guī)培養(yǎng)基用于菌液制備的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等常規(guī)培養(yǎng)基膽鹽乳糖培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂

15、培養(yǎng)基等膽鹽乳糖培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基等20余種用于培養(yǎng)余種用于培養(yǎng)基適用性檢查、方法驗(yàn)證試驗(yàn)及供試品檢查的培養(yǎng)基?；m用性檢查、方法驗(yàn)證試驗(yàn)及供試品檢查的培養(yǎng)基。 一般，一般，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用用于于細(xì)菌計(jì)數(shù)細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基用于用于真菌及酵母菌計(jì)真菌及酵母菌計(jì)數(shù)數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù)用于酵母菌計(jì)數(shù)。 三、菌種及培養(yǎng)基三、菌種及培養(yǎng)基白色念珠菌白色念珠菌玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基大腸埃希菌大腸埃希菌曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基Page Page 2323四、四、 方法的驗(yàn)證

16、試驗(yàn)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)四、方法的驗(yàn)證試驗(yàn)四、方法的驗(yàn)證試驗(yàn) 建立微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)建立微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)先先進(jìn)行方法驗(yàn)證進(jìn)行方法驗(yàn)證，確認(rèn)所采用的方法適，確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌、酵母菌的合于該藥品的細(xì)菌、霉菌、酵母菌的菌落計(jì)數(shù)測(cè)定或控制菌的檢查。菌落計(jì)數(shù)測(cè)定或控制菌的檢查。 方法驗(yàn)證時(shí)應(yīng)選擇方法驗(yàn)證時(shí)應(yīng)選擇法定試驗(yàn)菌法定試驗(yàn)菌按按照規(guī)定的方法及要求進(jìn)行。照規(guī)定的方法及要求進(jìn)行。 Page Page 2525五、五、 藥品的微生物限度藥品的微生物限度檢查檢查五、藥品的微生物限度檢查五、藥品的微生物限度檢查微生物限度檢查主要檢查項(xiàng)目有：微生物限度檢查主要檢查項(xiàng)目有：（一）細(xì)菌

17、數(shù)、真菌數(shù)及酵母菌計(jì)數(shù)檢查。（一）細(xì)菌數(shù)、真菌數(shù)及酵母菌計(jì)數(shù)檢查。（二）控制菌檢查（二）控制菌檢查 （三）螨類檢查（三）螨類檢查Page Page 2727（一）細(xì)菌數(shù)、真菌數(shù)及酵母菌計(jì)（一）細(xì)菌數(shù)、真菌數(shù)及酵母菌計(jì)數(shù)檢查數(shù)檢查（一）細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)（一）細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù) 檢測(cè)的是藥物在檢測(cè)的是藥物在單位質(zhì)量或體積內(nèi)單位質(zhì)量或體積內(nèi)所存在的所存在的活菌數(shù)量活菌數(shù)量?？稍u(píng)價(jià)生產(chǎn)過(guò)。可評(píng)價(jià)生產(chǎn)過(guò)程中原輔料、設(shè)備、器具、工藝、程中原輔料、設(shè)備、器具、工藝、環(huán)境及操作者的衛(wèi)生狀況。環(huán)境及操作者的衛(wèi)生狀況。（一）細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)（一）細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)1 1計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查計(jì)

18、數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查 細(xì)菌、真菌及酵母菌細(xì)菌、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)均應(yīng)檢查檢查。（1 1）菌種：試驗(yàn)用菌株的）菌種：試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)傳代次數(shù)不得超過(guò)不得超過(guò)5 5代代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0 0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。（2）菌液制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢

19、桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448小時(shí)。上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物到改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)57天，加入35ml 含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50100cfu的孢子懸液。 菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢

20、子懸液可保存在28，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。 （3）適用性檢查：取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50100cfu，分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50100cfu，分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置2328培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌各50100cfu，分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置2328培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)；同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。 （4）

21、結(jié)果判定：被檢培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)比值大于70%，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致，判定該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。驗(yàn)證試驗(yàn)包括驗(yàn)證試驗(yàn)包括試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組及稀釋劑對(duì)照組試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組及稀釋劑對(duì)照組，各需，各需至少進(jìn)行至少進(jìn)行3 3次獨(dú)立次獨(dú)立的平行試驗(yàn)的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率每次試驗(yàn)的回收率。 3 3次試驗(yàn)中，當(dāng)稀釋劑對(duì)照組的菌數(shù)回收率、試驗(yàn)組的菌數(shù)次試驗(yàn)中，當(dāng)稀釋劑對(duì)照組的菌數(shù)回收率、試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率回收率均不低于均不低于70%70%時(shí)，該供試液制備方法及計(jì)數(shù)法適合于測(cè)定其細(xì)菌時(shí)，該供試液

22、制備方法及計(jì)數(shù)法適合于測(cè)定其細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。、霉菌及酵母菌數(shù)。2 2、計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證、計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證 %100%菌液組的平均菌落數(shù)落數(shù)供試品對(duì)照組的平均菌試驗(yàn)組平均菌落數(shù)試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率%100%菌液組的平均菌落數(shù)落數(shù)稀釋劑對(duì)照組的平均菌率稀釋劑對(duì)照組菌數(shù)回收計(jì)數(shù)方法包括計(jì)數(shù)方法包括平皿法平皿法和和薄膜過(guò)濾法。薄膜過(guò)濾法。3 3供試品檢查供試品檢查（1 1）平皿法：）平皿法：本法采用的是本法采用的是傾注平皿計(jì)數(shù)法傾注平皿計(jì)數(shù)法1）稀釋（10倍遞增稀釋法）：取23支滅菌試管，分別加入9ml 稀釋液，并取1支1ml滅菌吸管吸取1:10均勻供試液1ml，加入已裝有9ml滅菌稀釋劑的試管中，混

23、勻即成1:100的供試液。以此類推，稀釋至1:1000或1:10 000。2）注平板、倒培養(yǎng)基：用滅菌移液管（每一稀釋度用1支）分別吸取不同稀釋度的稀釋液1ml，置于每一無(wú)菌平皿中（每一稀釋度做23個(gè)平皿），再于每一平皿中傾注1520ml的溫度不超過(guò)45的細(xì)菌、真菌或酵母菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基（細(xì)菌計(jì)數(shù)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；真菌及酵母菌計(jì)數(shù)用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；酵母菌計(jì)數(shù)用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基），快速轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使稀釋液與培養(yǎng)基均勻混合，放置，待凝。3）陰性對(duì)照試驗(yàn)：取試驗(yàn)用的稀釋液1ml，置無(wú)菌平皿中，注入培養(yǎng)基，均勻混合，凝固。每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板，均不得有菌生長(zhǎng)。4）培養(yǎng)：將已經(jīng)凝固

24、的平板倒置，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基放入3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基和酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基放入2328培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。（2 2）薄膜過(guò)濾法）薄膜過(guò)濾法： 所用濾膜孔徑不大于0.45m，直徑一般為50mm。取相當(dāng)于每張濾膜含1g 、1ml或10 cm2供試品的供試液（或適宜稀釋級(jí)的供試液1ml），加至適量的稀釋劑中，混勻，過(guò)濾。用pH 7.0無(wú)菌沖洗液沖洗濾膜后，取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。根據(jù)菌數(shù)報(bào)告規(guī)定計(jì)數(shù)，如超過(guò)規(guī)定限量即可認(rèn)定不合格。 同時(shí)取試驗(yàn)用

25、的稀釋液1ml同法操作，作為陰性對(duì)照，陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。（1 1）計(jì)數(shù)）計(jì)數(shù) 除另有規(guī)定外，除另有規(guī)定外，細(xì)菌細(xì)菌培養(yǎng)培養(yǎng)3 3天天，真菌、酵母真菌、酵母菌菌培養(yǎng)培養(yǎng)5 5天天，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，必要時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，必要時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至培養(yǎng)時(shí)間至7 7天天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小不小于于151

26、5，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差相差1 1倍或以上倍或以上。4 4、結(jié)果判斷、結(jié)果判斷 一般營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于真菌及酵母菌計(jì)數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù)。在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有真菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)真菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的真菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的真菌和酵母菌數(shù)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。含蜂蜜、王漿的液體制劑用攻瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定真菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊

27、脂培養(yǎng)基測(cè)定酵母菌數(shù)，合并計(jì)數(shù)。（2 2）菌數(shù)報(bào)告規(guī)則）菌數(shù)報(bào)告規(guī)則細(xì)菌、酵母菌選取平均菌落數(shù)小于300cfu，真菌宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級(jí)作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、1ml或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。如各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基取相應(yīng)稀釋級(jí)的供試液取相應(yīng)稀釋級(jí)的供試液1ml置無(wú)菌平皿中置無(wú)菌平皿中玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基陰性對(duì)照試驗(yàn)陰性對(duì)照試驗(yàn)細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)用的稀釋液試驗(yàn)用

28、的稀釋液1ml 細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)圖片截取自原中國(guó)藥品生物制品檢定所圖片截取自原中國(guó)藥品生物制品檢定所無(wú)菌無(wú)菌檢查和微生物檢查操作規(guī)范檢查和微生物檢查操作規(guī)范視頻視頻Page Page 4444（二）（二） 控制菌的檢查控制菌的檢查（二）控制菌的檢查（二）控制菌的檢查 檢查檢查非規(guī)定滅菌制劑非規(guī)定滅菌制劑中是否存在有中是否存在有可疑的致病菌?？梢傻闹虏【?。 控制菌檢查包括控制菌檢查包括大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、梭菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌梭菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的檢查。的檢查。 1、控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查控制菌檢查用培養(yǎng)基

29、的適用性檢查 適用性檢查項(xiàng)目包括培養(yǎng)基的適用性檢查項(xiàng)目包括培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示能力示能力的檢查的檢查 （1 1）促生長(zhǎng)能力檢查）促生長(zhǎng)能力檢查用以保證在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培用以保證在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，試驗(yàn)菌生長(zhǎng)良好（液體培養(yǎng)基）、養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，試驗(yàn)菌生長(zhǎng)良好（液體培養(yǎng)基）、菌落大小、形態(tài)特征與對(duì)照菌一致（固體培養(yǎng)基）菌落大小、形態(tài)特征與對(duì)照菌一致（固體培養(yǎng)基） （2 2）抑制能力檢查）抑制能力檢查用以保證其他試驗(yàn)菌無(wú)法生長(zhǎng)用以保證其他試驗(yàn)菌無(wú)法生長(zhǎng) （3 3）指示能力檢查）指示能力檢查用以保證培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)情況

30、（用以保證培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)情況（液體培養(yǎng)基）、菌落大小、形態(tài)特征（固體培養(yǎng)基）、指示劑液體培養(yǎng)基）、菌落大小、形態(tài)特征（固體培養(yǎng)基）、指示劑反應(yīng)情況等與對(duì)照培養(yǎng)基一致反應(yīng)情況等與對(duì)照培養(yǎng)基一致2、方法驗(yàn)證試驗(yàn)、方法驗(yàn)證試驗(yàn) 控制菌檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)，用以保證控制菌檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)，用以保證方法中供試液沒(méi)有方法中供試液沒(méi)有抗菌活性抗菌活性、所采用方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查所采用方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查。驗(yàn)證方法。驗(yàn)證方法系取規(guī)定量供試液及系取規(guī)定量供試液及10100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)液中。（試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)液中。（薄膜過(guò)濾法試驗(yàn)菌加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入增菌薄膜過(guò)濾

31、法試驗(yàn)菌加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。）依相應(yīng)控制菌檢查法培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。）依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。進(jìn)行檢查。要求要求試驗(yàn)組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌試驗(yàn)組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌。若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采。若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法、中合法等方法消用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法、中合法等方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。3、陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)和陰性對(duì)照試驗(yàn)、陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)和陰性對(duì)照試驗(yàn) 方法驗(yàn)證后，進(jìn)行供試品控制菌檢查時(shí)，還需進(jìn)方法驗(yàn)證后，進(jìn)行供試品控制菌檢查時(shí)，還需進(jìn)行試驗(yàn)

32、菌的陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)和稀釋液的陰性對(duì)照試驗(yàn)。行試驗(yàn)菌的陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)和稀釋液的陰性對(duì)照試驗(yàn)。試驗(yàn)菌的陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)：試驗(yàn)菌的陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)：應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌稀釋液的陰性對(duì)照試驗(yàn)：稀釋液的陰性對(duì)照試驗(yàn)：應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng) 4、控制菌檢查法、控制菌檢查法（1 1）大腸埃希菌）大腸埃希菌 大腸埃希菌即大腸埃希菌即大腸桿菌大腸桿菌，屬腸桿菌科埃希菌屬，是人和溫血，屬腸桿菌科埃希菌屬，是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的棲居菌，可隨糞便排出體外，是糞便污染指示菌動(dòng)物腸道內(nèi)的棲居菌，可隨糞便排出體外，是糞便污染指示菌。致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人暴發(fā)性腹瀉、化膿。致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人

33、暴發(fā)性腹瀉、化膿或敗血癥，或敗血癥，口服藥品口服藥品必須檢查大腸埃希菌。必須檢查大腸埃希菌。 （1 1）大腸埃希菌）大腸埃希菌 試驗(yàn)前準(zhǔn)備試驗(yàn)前準(zhǔn)備 器材、設(shè)備器材、設(shè)備 A、設(shè)備：無(wú)菌室、凈化工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌器、顯微鏡（1500）、恒溫水?。?51）、冰箱、365nm紫外燈。 B、器材：無(wú)菌衣、褲、帽、口罩（也可用一次性物品替代）；大、小橡皮乳頭、稱量紙及不銹鋼藥匙、酒精燈、乙醇棉球、乳膠手套、試管架、火柴、記號(hào)筆；錐形瓶、研缽（直徑1012cm）、量筒、試管及塞子、刻度吸管（1、10ml）、培養(yǎng)皿、載玻片、玻璃或搪瓷消毒缸（帶蓋）。 玻璃器皿均于160干熱滅菌2小時(shí)或高壓蒸汽滅

34、菌121 20分鐘，烘干備用。、需配制的試劑及培養(yǎng)基、需配制的試劑及培養(yǎng)基A、需配制的試劑：0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液、無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）、無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH7.0）；靛基質(zhì)試液、甲基紅指示液、伏-普試液、革蘭染色液。B、需配制的培養(yǎng)基：乳糖膽鹽培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（4-methylumbelliferyl-D-glucuronide，MUG）培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基。、對(duì)照用菌液對(duì)照用菌液 每1ml含50100cfu的大腸埃希菌的菌懸液。 操作過(guò)程操作過(guò)程檢驗(yàn)

35、程序檢驗(yàn)程序 進(jìn)行大腸埃希菌檢驗(yàn)時(shí)，供試液先經(jīng)增菌培養(yǎng)，然后利用MUG-indole法對(duì)增菌培養(yǎng)物進(jìn)行快速檢查，a.如果這兩項(xiàng)檢查都為陽(yáng)性結(jié)果或都為陰性結(jié)果，可以直接報(bào)告結(jié)果。b.如果出現(xiàn)一陰一陽(yáng)的結(jié)果，還需進(jìn)行分離培養(yǎng)，無(wú)菌落生長(zhǎng)，可以直接報(bào)告結(jié)果；出現(xiàn)疑似菌落生長(zhǎng)時(shí)，進(jìn)行純培養(yǎng)、生化鑒定試驗(yàn) 。增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng) 供試品在檢驗(yàn)時(shí)，首先需先進(jìn)行增菌培養(yǎng)。增菌培養(yǎng)可選用乳糖膽鹽（BL）培養(yǎng)基，其中的膽鹽（或去氧膽酸鈉）具有抑制革蘭陽(yáng)性細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。 取乳糖膽鹽培養(yǎng)基3瓶，每瓶100ml，2瓶分別加入規(guī)定量的供試液（1:10的待檢供試液10ml），其中1瓶加入50100個(gè)對(duì)照菌作陽(yáng)性對(duì)照，第3瓶

36、加入10ml稀釋劑作陰性對(duì)照，3035培養(yǎng)1824小時(shí)（必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)）。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。 當(dāng)陰性對(duì)照呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照正常生長(zhǎng)，供試液乳糖膽鹽增菌液澄明，并證明無(wú)菌生長(zhǎng)，判定為未檢出大腸埃希菌。若供試液增菌液渾濁，并證明有菌生長(zhǎng)，做如下檢查。MUG-indole快速檢查快速檢查 取增菌培養(yǎng)后的3瓶培養(yǎng)物各0.2ml，分別接種至含5ml MUG的培養(yǎng)基試管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5、24小時(shí)在365nm紫外線下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)白色熒光，為MUG陽(yáng)性。供試液的MUG管呈現(xiàn)熒光，為MUG陽(yáng)性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基

37、質(zhì)試液，觀察液面顏色，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。 如供試液MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，判定供試品檢出大腸埃希菌；如供試液MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判定供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，則均應(yīng)取乳糖膽鹽培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（eosin methylene blue agar，簡(jiǎn)稱EMB）或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，作進(jìn)一步的檢查。分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 取供試液增菌液在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板上進(jìn)行劃線分離，3035培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察菌落特征，如上述平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，或生

38、長(zhǎng)的菌落與表4-2所列菌落特征不符，判定為供試品未檢出大腸埃希菌。如平板上生長(zhǎng)的菌落與表4-2所列菌落特征相符或疑似，應(yīng)對(duì)可疑菌落進(jìn)行生化反應(yīng)試驗(yàn)。 純培養(yǎng)純培養(yǎng) 從平板上選擇與典型菌落特征相符或疑似的23個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時(shí)，然后取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物做如下試驗(yàn)。生化試驗(yàn)確認(rèn)生化試驗(yàn)確認(rèn)a. 靛基質(zhì)試驗(yàn)（靛基質(zhì)試驗(yàn)（indole test，I）：）：將斜面培養(yǎng)物接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)2448小時(shí)，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，液面呈玫瑰紅色，呈試劑本色為陰性。大腸埃希菌應(yīng)有陽(yáng)性反應(yīng)。b. 甲基紅試驗(yàn)（甲基紅試驗(yàn)（methyl red test，M）

39、：）：將斜面培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)2448小時(shí)，于管內(nèi)加入甲基紅指示劑數(shù)滴，觀察結(jié)果，呈鮮紅色或橘紅色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性。大腸埃希菌應(yīng)是陽(yáng)性。c. 伏伏-普試驗(yàn)（普試驗(yàn)（Voges-Prokauer test，V-P）：）：將斜面培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)2448小時(shí)，加入V-P試劑甲液1ml，混勻，再加入V-P試劑乙液0.4ml，充分振搖，觀察結(jié)果，4小時(shí)出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，無(wú)色反應(yīng)為陰性。大腸埃希菌應(yīng)是陰性。d. 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（citrate test，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱C）：）：將斜面培養(yǎng)物接種于枸櫞酸鹽瓊脂培養(yǎng)基中，303

40、5培養(yǎng)2448小時(shí)，觀察結(jié)果，培養(yǎng)基由綠色變成藍(lán)色時(shí)為陽(yáng)性，培養(yǎng)基顏色無(wú)改變?yōu)殛幮?。大腸埃希菌應(yīng)是陰性。結(jié)果判斷結(jié)果判斷 進(jìn)行MUG-indole試驗(yàn)時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照增菌培養(yǎng)物應(yīng)該呈陽(yáng)性結(jié)果，陰性對(duì)照增菌培養(yǎng)物應(yīng)該呈陰性結(jié)果，供試品增菌培養(yǎng)物結(jié)果如表所示。當(dāng)供試品增菌液MUG-indole試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)一陰一陽(yáng)時(shí)，應(yīng)采用曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板進(jìn)行劃線培養(yǎng)；當(dāng)平板上出現(xiàn)典型菌落或疑似菌落時(shí)，還需進(jìn)行IMVC生化試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn) 。（2 2）沙門菌）沙門菌 沙門菌屬腸桿菌科沙門菌屬，是人畜共患的腸道病原菌，可引起傷寒、腸炎、腸熱病和食物中毒。中國(guó)藥典現(xiàn)行版規(guī)定：含動(dòng)物組織（包括提取物）的口服給藥

41、制劑，每10g或10ml不得檢出沙門菌。 （2 2）沙門菌）沙門菌檢查法：取供試液在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)后，劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基平板上，根據(jù)培養(yǎng)后平板上有無(wú)菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落形態(tài)特征，判斷是否檢出沙門菌。如菌落形態(tài)特征相符或疑似，還應(yīng)通過(guò)用三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面進(jìn)行斜面和高層穿刺接種試驗(yàn)做進(jìn)一步判斷。（3 3）銅綠假單胞菌）銅綠假單胞菌 銅綠假單胞菌是常見(jiàn)的化膿性感染菌，在燒傷、燙傷、眼科及其他外科疾患中常引起繼發(fā)感染，且對(duì)許多抗菌藥物具有天然的耐藥性。

42、中國(guó)藥典現(xiàn)行版規(guī)定：耳、鼻及呼吸道吸入給藥制劑，陰道、尿道給藥制劑，直腸給藥制劑及其他局部給藥制劑，均不得檢出銅綠假單胞菌。 五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法（3 3）銅綠假單胞菌）銅綠假單胞菌 檢查法：取供試液在膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)液，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，根據(jù)培養(yǎng)后平板上有無(wú)菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落形態(tài)特征，判斷是否檢出銅綠假單胞菌。如菌落形態(tài)特征相符或疑似，還應(yīng)通過(guò)氧化酶試驗(yàn)及綠膿菌素試驗(yàn)做進(jìn)一步判斷。五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法（4 4）金黃色葡萄球菌）金黃色葡萄球菌 金黃色葡萄球菌是化膿性感染重要的病原菌，分布

43、廣泛，可產(chǎn)生多種毒素及酶，引起局部及全身化膿性炎癥，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致敗血癥和膿毒血癥。中國(guó)藥典現(xiàn)行版規(guī)定：耳、鼻及呼吸道吸入給藥制劑，陰道、尿道給藥制劑，直腸給藥制劑及其他局部給藥制劑，均不得檢出金黃色葡萄球菌。五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法（4 4）金黃色葡萄球菌：）金黃色葡萄球菌： 檢查法：取供試液在亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營(yíng)養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基的培養(yǎng)液，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上。根據(jù)培養(yǎng)后平板上有無(wú)菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落形態(tài)特征，判斷是否檢出金黃色葡萄球菌。如菌落形態(tài)特征相符或疑似，還應(yīng)通過(guò)血漿凝固酶試驗(yàn)做進(jìn)一步判斷 。五、藥品的微生物限

44、度檢驗(yàn)方法五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法（5 5）梭菌）梭菌 梭菌的主要病原菌有產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌、艱難梭菌和氣性壞疽病原菌群，可產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素和侵襲性酶類使人和動(dòng)物致病。對(duì)某些用于陰道、創(chuàng)傷、潰瘍的藥品，必須控制梭菌。五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法（5）梭菌）梭菌 檢查法：取供試液在梭菌增菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)液0.2ml，分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，以平板培養(yǎng)后無(wú)菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出梭菌；如有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)挑選23個(gè)菌落，分別進(jìn)行格蘭染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)做進(jìn)一步判斷。五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法（6 6

45、）白色念珠菌）白色念珠菌 白色念珠菌是單細(xì)胞真菌，通常存在于正常人的口腔、上呼吸道、腸道及陰道，一般在正常機(jī)體中數(shù)量少，不引起疾病。當(dāng)機(jī)體免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制約作用失調(diào)時(shí)，則本菌大量繁殖并改變生長(zhǎng)形式（芽生菌絲相），侵入細(xì)胞引起疾病。五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法五、藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法（6）白色念珠菌）白色念珠菌檢查法：取供試液在檢查法：取供試液在沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物，劃線接種的培養(yǎng)物，劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，以平板培養(yǎng)后無(wú)菌落生長(zhǎng)或生于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，以平板培養(yǎng)后無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與規(guī)定的形態(tài)特征不符，判供試品

46、未檢出白色念珠菌；長(zhǎng)的菌落與規(guī)定的形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌；如生長(zhǎng)的菌落與規(guī)定的形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選如生長(zhǎng)的菌落與規(guī)定的形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個(gè)菌落個(gè)菌落，分別接種至，分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基念珠菌顯色培養(yǎng)基平板，以平板培養(yǎng)后平板，以平板培養(yǎng)后無(wú)綠色或翠無(wú)綠色或翠綠色綠色的菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出白色念珠菌。若生長(zhǎng)的菌落為的菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出白色念珠菌。若生長(zhǎng)的菌落為綠色或翠綠色，挑選相符或疑似的菌落接種于綠色或翠綠色，挑選相符或疑似的菌落接種于1%聚山梨酯聚山梨酯80-玉米玉米瓊脂培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，取培養(yǎng)物進(jìn)行染色、鏡檢及芽管試驗(yàn)，做進(jìn)上培養(yǎng)，取培養(yǎng)

47、物進(jìn)行染色、鏡檢及芽管試驗(yàn)，做進(jìn)一步判斷一步判斷 。Page Page 7272（三）（三） 螨類的檢查螨類的檢查（三）螨類的檢查（三）螨類的檢查 螨是一類小動(dòng)物，屬于節(jié)肢動(dòng)物門蛛形綱蜱螨目，種類多，分布廣。根據(jù)其生活習(xí)性，分為自由生活和寄生生活兩種類型。在土壤、池沼、江河和湖海里，動(dòng)、植物體上，以及貯藏食品和藥品中都可能存在。藥品可因其原料、生產(chǎn)過(guò)程或包裝、運(yùn)輸、貯存、銷售等條件不良，受到螨的污染。螨可蛀蝕損壞藥品，使藥品變質(zhì)失效。螨可引起皮炎及消化、泌尿、呼吸系統(tǒng)的疾病，直接危害人體健康或傳播疾病。因此，藥品特別是中成藥，必須進(jìn)行活螨檢查。（三）螨類的檢查（三）螨類的檢查 檢查方法五、藥品

48、的微生物限度檢查五、藥品的微生物限度檢查學(xué)習(xí)小結(jié)學(xué)習(xí)小結(jié)1234微生物限度微生物限度檢查的定義、檢查的定義、意義、內(nèi)容、意義、內(nèi)容、檢查的基本檢查的基本原則、技術(shù)原則、技術(shù)要求、抽樣要求、抽樣量和檢驗(yàn)量量和檢驗(yàn)量以及微生物以及微生物限度標(biāo)準(zhǔn)限度標(biāo)準(zhǔn)樣品供樣品供試液溶試液溶液的制液的制備備。 微生物微生物限度限限度限度檢查度檢查用菌種用菌種及培養(yǎng)及培養(yǎng)基基微生物微生物限度檢限度檢查的方查的方法驗(yàn)證法驗(yàn)證試驗(yàn)。試驗(yàn)。4。5檢查方法：檢查方法：細(xì)菌、真菌細(xì)菌、真菌及酵母菌的及酵母菌的計(jì)數(shù)，控制計(jì)數(shù)，控制菌、螨類的菌、螨類的檢查檢查實(shí)訓(xùn) 葡萄糖酸鈣口服液微生物葡萄糖酸鈣口服液微生物限度檢查限度檢查（一

49、）實(shí)訓(xùn)目的（一）實(shí)訓(xùn)目的1、掌握葡萄糖酸鈣口服液中細(xì)菌、真菌及酵母、掌握葡萄糖酸鈣口服液中細(xì)菌、真菌及酵母菌總數(shù)的檢查方法與操作。菌總數(shù)的檢查方法與操作。 2、學(xué)會(huì)供試品的處理方法及學(xué)會(huì)菌落計(jì)數(shù)方、學(xué)會(huì)供試品的處理方法及學(xué)會(huì)菌落計(jì)數(shù)方法法 。（二）實(shí)訓(xùn)原理（二）實(shí)訓(xùn)原理 非規(guī)定滅菌藥劑一般不要求絕對(duì)無(wú)菌，但必須控制非規(guī)定滅菌藥劑一般不要求絕對(duì)無(wú)菌，但必須控制微生物的數(shù)量在一定的范圍內(nèi)，并保證不含有特定微生物的數(shù)量在一定的范圍內(nèi)，并保證不含有特定的控制（致?。┚?。的控制（致?。┚?。20102010年版年版中國(guó)藥典中國(guó)藥典規(guī)定采用規(guī)定采用平皿法平皿法和和薄膜過(guò)濾薄膜過(guò)濾法法進(jìn)行藥品的細(xì)菌、真菌及酵

50、母菌計(jì)數(shù)檢查。本實(shí)進(jìn)行藥品的細(xì)菌、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查。本實(shí)驗(yàn)以葡萄糖酸鈣口服液為材料進(jìn)行平皿法計(jì)數(shù)。驗(yàn)以葡萄糖酸鈣口服液為材料進(jìn)行平皿法計(jì)數(shù)。（三）材料和用具（三）材料和用具 1 1器材、設(shè)備器材、設(shè)備 （1）設(shè)備：無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、電熱干燥箱、高壓蒸汽滅菌器、菌落計(jì)數(shù)器、天平（感量0.1g）。 （2）器材：橡皮乳頭、酒精燈、乙醇棉球、乳膠手套、試管架、火柴、記號(hào)筆；無(wú)菌衣、褲、帽、口罩（也可用一次性物品替代）；研缽或勻漿儀、量筒、稱量紙及不銹鋼藥匙；試管及塞子、刻度吸管（1、10ml）、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃或搪瓷消毒缸（帶蓋）。 玻璃器皿均于160干熱滅菌2小時(shí)或高壓蒸汽滅菌121 20分鐘，烘干備用。（三）材料和用具（三）材料和用具 2 2試劑及培養(yǎng)基試劑及培養(yǎng)基（1）葡萄糖酸鈣口服液為供試品。（2）消毒劑：0.2%苯扎溴銨溶液、75%乙醇溶液（制乙醇棉球用）、3%5%甲酚溶液、5%甲醛、高錳酸鉀等。（3）稀釋劑：pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或pH6.8磷酸鹽緩沖