細胞生物學 第3章 細胞生物學研究方法

1、w顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據(jù)顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學顯微鏡和電子顯光源不同，可分為光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。微鏡兩大類。光學顯微鏡以可見光（紫外線顯微鏡以光學顯微鏡以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源。紫外光）為光源。電子顯微鏡以電子束為光源。電子顯微鏡以電子束為光源。u普通光學顯微鏡普通光學顯微鏡u熒光顯微鏡熒光顯微鏡 u激光共聚焦掃描顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡u相差顯微鏡相差顯微鏡 u微分干涉差顯微鏡微分干涉差顯微鏡u倒置顯微鏡倒置顯微鏡 v普通生物顯微鏡由普通生物顯微鏡由三三部分部分構成：構成：照明系統(tǒng)照明系統(tǒng)光學放大系統(tǒng)光學放大系統(tǒng)機械裝置機械裝

2、置v原理：經(jīng)物鏡形成倒立實原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。（一）普通復式光學顯微鏡（一）普通復式光學顯微鏡指顯微鏡能分辨物體最小間隔的能力。指顯微鏡能分辨物體最小間隔的能力。0.61 分辨率分辨率 DN . sin （ / 2）=w制片：固定（甲酫）、包埋（石蠟）切成制片：固定（甲酫）、包埋（石蠟）切成厚約厚約5 m的薄片以便觀察。的薄片以便觀察。w染色：伊紅和美藍特異地與不同蛋白質結染色：伊紅和美藍特異地與不同蛋白質結合，品紅特異地顯示合，品紅特異地顯示DNA的所在部位。的所在部位。相差顯微鏡（相差顯微鏡（phasecontrast microsco

3、pe）由）由PZernike于于1932年發(fā)年發(fā)明，并因此獲明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎。這種年諾貝爾物理獎。這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經(jīng)染色的顯微鏡最大的特點是可以觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞。標本和活細胞。組成和普通顯微鏡一組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之下，后者在載物臺之上，載物臺之上，用于觀用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。有相差物鏡。(八八)、當代顯微鏡的發(fā)展趨勢、當代顯微鏡的發(fā)展趨勢v進入進入20世紀世紀80年代以來，年代以來，光學顯微鏡的設計和制作又光學顯微鏡的設計和

4、制作又有了很大的發(fā)展，其發(fā)展趨有了很大的發(fā)展，其發(fā)展趨勢主要表現(xiàn)在，注重實用性勢主要表現(xiàn)在，注重實用性和多功能方面的改進。在裝和多功能方面的改進。在裝配設計上趨于采用組合方式，配設計上趨于采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、暗視野、DIC、攝影裝置于一、攝影裝置于一體，從而操作靈活，使用方體，從而操作靈活，使用方便。便。v自動化與電子化自動化與電子化透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡n用于電鏡的標本須制成厚度約用于電鏡的標本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。左右的超薄切片。2、制樣技術、制樣技術超薄切片超薄切片負染技術負染技術冰凍蝕刻冰

5、凍蝕刻v電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機的超薄切片，用超薄切片機ultramicrotome）制作。）制作。v通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。屬（鈾、鉛）鹽染色。Page59超薄切片超薄切片技術主要技術主要包括取材、包括取材、固定、包固定、包埋、切片、埋、切片、染色等步染色等步驟。驟。Electron micrograph of a

6、root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen. Negative Stained Archaebacteria Negative Stained Actin用次氯酸鈉用次氯酸鈉Page 61酵酵母母細細胞胞掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM

7、）于20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結構。工作原理工作原理v 用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關，也就是說與樣品的表面結構有關，次級電子關，也就是說與樣品的表面結構有關，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉變?yōu)楣庑盘?，由探測體收集，并在那里被閃爍器轉變?yōu)楣庑盘?，再?jīng)光電倍增管和放大器轉變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻稍俳?jīng)光電倍增管和放大器轉變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸龋@示出與電子束同步的掃光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。描圖像。v 圖

8、像為立體形象，反映了標本的表面結構。為了圖像為立體形象，反映了標本的表面結構。為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。的轟擊下發(fā)出次級電子信號。 三、掃描隧道顯微鏡三、掃描隧道顯微鏡 掃描隧道顯微鏡（掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope，STM） 由由Binnig等等1981年發(fā)明，年發(fā)明，根據(jù)量子力學原理中的隧道效應而設計。根據(jù)量子力學原理中的隧道效應而設計。 v原理：根據(jù)隧道效應而設計，當原子尺度

9、的針尖在原理：根據(jù)隧道效應而設計，當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（疊，外加一電壓（2mV2V），針尖與樣品之間形成），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關系，將掃描過程中電流的變化轉換為圖像，即可關系，將掃描過程中電流的變化轉換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。v分辨率：橫向為分辨率：橫向為0.10.2nm，縱向可達，縱向可達0.001nm。v用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質均可進行觀用途：三態(tài)（固態(tài)、

10、液態(tài)和氣態(tài)）物質均可進行觀察。察。STM image of a DNA moleculeLow speedHigh speedDifferential centrifugationVelocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation1. 1. 固定固定物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。化學固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛化學固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。多用甲醛丙酮緩沖液固定。 步驟：步驟

11、：2. 2. 顯示方法顯示方法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應產(chǎn)物最終金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應產(chǎn)物最終生成生成CuS或或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。有色沉淀，而顯示出酶活性。Schiff反應：細胞中的醛基可使反應：細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應）。反應）。聯(lián)苯胺反應：過氧化酶分解聯(lián)苯胺反應：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。

12、脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。茚三酮反應：顯示蛋白質。茚三酮反應：顯示蛋白質。金屬沉淀法金屬沉淀法Schiff反應反應聯(lián)苯胺反應聯(lián)苯胺反應脂溶染色法脂溶染色法F. 米倫（米倫（Millon）染色：顯示蛋白質（紅色）染色：顯示蛋白質（紅色）酪氨酸殘基與氮汞試劑反應酪氨酸殘基與氮汞試劑反應 1. 免疫熒光技術免疫熒光技術Immunofluorescence technique ：抗原抗原-抗體特異結合與熒光標記技術相結合用于研究特異蛋白抗原抗體特異結合與熒光標記技術相結合用于研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法。在細胞內分布的方法。用Alex

13、a488標記的抗人-tubulin抗體染色顯示微管(綠色); 細胞核: 紅色, DAPI染色(常規(guī)熒光顯微鏡照片，Shi Qinghua等)用抗用抗-tubulin抗體染色顯示微管抗體染色顯示微管(綠色綠色); 細胞核細胞核: 紅色紅色, DAPI染色染色(激光共聚焦顯微鏡照片激光共聚焦顯微鏡照片) 2. 免疫電鏡技術免疫電鏡技術 Immune electron microscopy：通過通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內酶的研究；膜蛋白的定對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等位與骨架蛋白的定位等 用免疫電鏡方用免疫電鏡

14、方法法,觀察到寇氏隱甲觀察到寇氏隱甲藻的多條凝集染色藻的多條凝集染色體和細胞中的金顆體和細胞中的金顆粒粒,并且細胞核內、并且細胞核內、核膜上的金顆粒簇核膜上的金顆粒簇集相對于胞質中相集相對于胞質中相對集中對集中,指示了指示了ACA抗抗CJFD2003通常用通常用*原位雜交原位雜交： 指用標記的核酸探針通過分子雜交確定指用標記的核酸探針通過分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體上或者在細胞中的位置的方法。特異核苷酸序列在染色體上或者在細胞中的位置的方法。五、放射自顯影術五、放射自顯影術v用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更

15、新、作用機理、作用部位等定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。等。v原理：將放射性同位素標記的化合物導入生物體內，原理：將放射性同位素標記的化合物導入生物體內，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。射性曝光，使乳膠感光。v一般用一般用14C和和3H標記。常用標記。常用3H-TDR來顯示來顯示DNA，用，用3H-UDR顯示顯示RNA；用；用3H氨基酸研究蛋白質，用氨基酸研究蛋白質，用3H甘甘露糖、露糖、3H巖藻糖研究多糖。巖藻糖研究多糖。 14C半衰期為半衰期為5730年，年，3H為為12.5年。年。2. 2

16、. 顯微光譜分析技術顯微光譜分析技術v細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質、細胞色素、維生素等都有自己酸、蛋白質、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。特征性的吸收曲線。v可利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、可利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性和定量測定。定性和定量測定。(一一)、細胞培養(yǎng)的基本概念、細胞培養(yǎng)的基本概念(二二)、動物細胞培養(yǎng)、動物細胞培養(yǎng)(三三)、植物細胞培養(yǎng)、植物細胞培養(yǎng)(四四) 非細胞體系在細胞生物學研究的作用非細胞體系在細胞生物學研究的作用(一一)、細胞培養(yǎng)的基本概念、細胞培養(yǎng)的基本概念選用最佳生存條件對

17、活細胞進行培養(yǎng)和研究選用最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術。的技術。 動物細胞的生存環(huán)境與植物細胞差別很大，動物細胞的生存環(huán)境與植物細胞差別很大，因而二者的培養(yǎng)方法很不相同。因而二者的培養(yǎng)方法很不相同。(二二)、動物細胞培養(yǎng)、動物細胞培養(yǎng) 原代細胞原代細胞(primary culture cell) 從動物機體取出的進行培養(yǎng)的細胞群從動物機體取出的進行培養(yǎng)的細胞群 。有人也把。有人也把培養(yǎng)的第培養(yǎng)的第2代細胞與傳代細胞與傳10代以內的細胞統(tǒng)稱為原代代以內的細胞統(tǒng)稱為原代培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)細胞。 有限細胞系有限細胞系(finite cell line) 從原代細胞群中篩選出的仍保持原來染色體的

18、二從原代細胞群中篩選出的仍保持原來染色體的二倍體數(shù)量及接觸抑制性，能夠繁殖倍體數(shù)量及接觸抑制性，能夠繁殖40-50代左右的代左右的傳代細胞。傳代細胞。永生細胞系永生細胞系(infinite cell line) 細胞發(fā)生遺傳突變，并帶有癌細胞的特點，可能細胞發(fā)生遺傳突變，并帶有癌細胞的特點，可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細胞在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細胞稱為稱為永生細胞系永生細胞系。 如：如：HeLa細胞系、細胞系、BHK21細胞系、細胞系、Vero細胞系、細胞系、CHO細胞系細胞系細胞株：細胞株：具有特殊遺傳標記或性質的細胞群體。具有特殊遺傳標記或性質的細胞群體。2.

19、 體外培養(yǎng)細胞的類型：體外培養(yǎng)細胞的類型：v原代培養(yǎng)細胞原代培養(yǎng)細胞v傳代細胞：適應在體外持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞傳代細胞：適應在體外持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞3. 細胞培養(yǎng)的類型細胞培養(yǎng)的類型u單層細胞培養(yǎng)單層細胞培養(yǎng)u懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)4. 細胞的形態(tài)：成纖維樣細胞、上皮樣細胞細胞的形態(tài)：成纖維樣細胞、上皮樣細胞原原代代培培養(yǎng)養(yǎng)(四四) 非細胞體系在細胞生物學研究非細胞體系在細胞生物學研究的作用的作用1. 定義：通過培養(yǎng)和介導，兩個或多個細胞合并成定義：通過培養(yǎng)和介導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（cell fusion）或細胞雜交。）或細胞雜交。2. 同核體同核體：相同基因型的細胞融合而成。：相同基因型的細胞融合而成。3. 異核體：異核體：不同基因型的細胞融合而成。不同基因型的細胞融合而成。4.