質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)測定方法的建立

1、1藥品研究及生產(chǎn)過程中有關(guān)物藥品研究及生產(chǎn)過程中有關(guān)物質(zhì)的控制方法和要求質(zhì)的控制方法和要求化學(xué)二室化學(xué)二室 謝沐風(fēng)謝沐風(fēng)20052005年年4 4月月2 有關(guān)物質(zhì)的來源有關(guān)物質(zhì)的來源 原料藥合成過程中帶入原料藥合成過程中帶入; 制劑過程中產(chǎn)生制劑過程中產(chǎn)生; 或是在貯藏、運輸、使用過程中產(chǎn)生?；蚴窃谫A藏、運輸、使用過程中產(chǎn)生。 控制的必要性控制的必要性3* 有關(guān)物質(zhì)的測定方法有關(guān)物質(zhì)的測定方法 儀器角度：儀器角度： 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC法）、法）、 薄層色譜法（薄層色譜法（TLC法）、法）、 紫外分光光度法（紫外分光光度法（UV法）、法）、 氣相色譜法（氣相色譜法（GC法）

2、、法）、 毛細(xì)管電泳色譜法（毛細(xì)管電泳色譜法（CE）等）等 試驗角度：試驗角度： 對照品法對照品法 自身（稀釋）對照法自身（稀釋）對照法 歸一化法歸一化法4* 有關(guān)物質(zhì)的計算方法有關(guān)物質(zhì)的計算方法 雜質(zhì)對照品法雜質(zhì)對照品法 加響應(yīng)因子（即重量校正因子）計算加響應(yīng)因子（即重量校正因子）計算 的自身對照法、的自身對照法、 不加響應(yīng)因子計算的自身對照法不加響應(yīng)因子計算的自身對照法 根據(jù)不同雜質(zhì)采用不同方法等。根據(jù)不同雜質(zhì)采用不同方法等。* 有關(guān)物質(zhì)的計算方法有關(guān)物質(zhì)的計算方法定量檢測和限度檢測定量檢測和限度檢測5高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC法）法）1 .色譜條件的確定（即專屬性試驗）色譜

3、條件的確定（即專屬性試驗） 專屬性是提供被分析物在雜質(zhì)和輔料存在專屬性是提供被分析物在雜質(zhì)和輔料存在時能被區(qū)分的證明，通常采用在純物質(zhì)（原料時能被區(qū)分的證明，通常采用在純物質(zhì)（原料或制劑）中加入或制劑）中加入一定量的一定量的雜質(zhì)或輔料，證明各雜質(zhì)或輔料，證明各雜質(zhì)均可與被分析物分離。雜質(zhì)均可與被分析物分離。 配制含有配制含有1%(w/w)濃度各中間體（即各雜濃度各中間體（即各雜質(zhì)）的主成分對照品溶液作為系統(tǒng)適用性試驗質(zhì)）的主成分對照品溶液作為系統(tǒng)適用性試驗用溶液，來確證色譜條件的適用性。用溶液，來確證色譜條件的適用性。 6專屬性試驗驗證圖譜專屬性試驗驗證圖譜72 . 檢測波長的確定檢測波長的確

4、定 涉及到各被檢測物質(zhì)在該波長下的響應(yīng)因子是否相同，涉及到各被檢測物質(zhì)在該波長下的響應(yīng)因子是否相同，即所謂重量校正因子的問題。（即所謂重量校正因子的問題。（f=A雜質(zhì)雜質(zhì)/A被測成分被測成分） 選取主成分與各雜質(zhì)具有相同紫外吸收的波長（選取主成分與各雜質(zhì)具有相同紫外吸收的波長（f=1.0）。）。 選取各雜質(zhì)紫外吸收大于主成分紫外吸收的波長選取各雜質(zhì)紫外吸收大于主成分紫外吸收的波長（f1.0），這樣可更加嚴(yán)格控制雜質(zhì)的限度。），這樣可更加嚴(yán)格控制雜質(zhì)的限度。 如選取各雜質(zhì)紫外吸收小于主成分紫外吸收的波長，應(yīng)如選取各雜質(zhì)紫外吸收小于主成分紫外吸收的波長，應(yīng)必須加入重量校正因子（必須加入重量校正因子

5、（f1.0），否則將得到錯誤的判斷。），否則將得到錯誤的判斷。 目前國外有關(guān)該項研究的進展目前國外有關(guān)該項研究的進展83. 供試品溶液濃度的確定供試品溶液濃度的確定 （靈敏度試驗（靈敏度試驗最低檢出量的測定）最低檢出量的測定） 供試品溶液濃度的設(shè)定至關(guān)重要。通常其設(shè)定供試品溶液濃度的設(shè)定至關(guān)重要。通常其設(shè)定是依據(jù)最低檢出量和最大進樣量來進行的。是依據(jù)最低檢出量和最大進樣量來進行的。 最低檢出量雖然是個絕對值，但其真正的意義最低檢出量雖然是個絕對值，但其真正的意義確是其相對值，即相對于供試品溶液中樣品濃確是其相對值，即相對于供試品溶液中樣品濃度的多少而言。度的多少而言。 其測定方法分為直觀評價法

6、和依據(jù)信躁比兩種方法其測定方法分為直觀評價法和依據(jù)信躁比兩種方法。 最大進樣量以不斷增加樣品溶液濃度，直至被最大進樣量以不斷增加樣品溶液濃度，直至被分析物不拖尾的濃度為準(zhǔn)。分析物不拖尾的濃度為準(zhǔn)。93. 供試品溶液濃度的確定供試品溶液濃度的確定 設(shè)定雜質(zhì)總量不得過設(shè)定雜質(zhì)總量不得過1.0%，最低檢出量通常需達，最低檢出量通常需達到對照溶液濃度的到對照溶液濃度的1/101/50（即相當(dāng)于供試品溶（即相當(dāng)于供試品溶液濃度的液濃度的0.1%0.02%）。也就是說供試品溶液）。也就是說供試品溶液的濃度至少是最低檢出量的的濃度至少是最低檢出量的1000倍倍 20000 倍，倍，又由于最低檢出量受各因素的

7、不同而改變（即耐又由于最低檢出量受各因素的不同而改變（即耐受性因數(shù)），故供試品溶液的濃度在保證不拖尾受性因數(shù)），故供試品溶液的濃度在保證不拖尾的情況下（即小于最大進樣量），可在此基礎(chǔ)上的情況下（即小于最大進樣量），可在此基礎(chǔ)上再設(shè)定的高一些，以保證該濃度可適用各種條件。再設(shè)定的高一些，以保證該濃度可適用各種條件。103. 供試品溶液濃度的確定供試品溶液濃度的確定 舉例說明：進樣量為舉例說明：進樣量為20l，主成分的最低檢出量，主成分的最低檢出量為為1g/ml（以濃度表示），規(guī)定雜質(zhì)限度為（以濃度表示），規(guī)定雜質(zhì)限度為1%，此時供試品溶液的濃度可設(shè)定為此時供試品溶液的濃度可設(shè)定為 1mg/ml

8、20mg/ml，或者再高一些，但始終需保持主成，或者再高一些，但始終需保持主成分峰不拖尾為準(zhǔn)，即不超過最大進樣量。分峰不拖尾為準(zhǔn)，即不超過最大進樣量。 拖尾情況也可通過流速進行適當(dāng)調(diào)節(jié)拖尾情況也可通過流速進行適當(dāng)調(diào)節(jié)113. 供試品溶液濃度的確定供試品溶液濃度的確定濃濃 度度進樣量進樣量絕對值絕對值相對于樣品測定濃度的相對于樣品測定濃度的最大進樣量最大進樣量50mg/ml 以上以上20l供試品溶液供試品溶液5mg/ml20l100g100%（5000 倍）倍）對照溶液對照溶液50g/ml20l1g1%最低檢出量最低檢出量1g/ml20l20ng0.02%124. 加樣回收試驗（即準(zhǔn)確性試驗）加

9、樣回收試驗（即準(zhǔn)確性試驗） 準(zhǔn)確性試驗可采用樣品中加入已知量雜質(zhì)的準(zhǔn)確性試驗可采用樣品中加入已知量雜質(zhì)的方式來評價。準(zhǔn)確稱量各雜質(zhì)，將含有方式來評價。準(zhǔn)確稱量各雜質(zhì)，將含有1% (w/w)濃度的各雜質(zhì)加入到樣品溶液中，以驗證所采用濃度的各雜質(zhì)加入到樣品溶液中，以驗證所采用的色譜條件是否可分離檢出出相應(yīng)的各雜質(zhì)。該的色譜條件是否可分離檢出出相應(yīng)的各雜質(zhì)。該原理同前面所述的專屬性研究是一致的。原理同前面所述的專屬性研究是一致的。135. 流速、柱溫與溶劑的選擇流速、柱溫與溶劑的選擇 在測定時通常調(diào)節(jié)流速使主成分保留時間稍長些，在測定時通常調(diào)節(jié)流速使主成分保留時間稍長些，且使主成分峰不拖尾即可。且使

10、主成分峰不拖尾即可。 柱溫對分離效果的影響雖有一定的影響，但不甚柱溫對分離效果的影響雖有一定的影響，但不甚顯著，如有柱溫箱，通常設(shè)定不超過顯著，如有柱溫箱，通常設(shè)定不超過35。 溶劑的選擇應(yīng)測定樣品溶液在該溶劑中的穩(wěn)定性溶劑的選擇應(yīng)測定樣品溶液在該溶劑中的穩(wěn)定性來衡量，盡量勿選擇揮發(fā)性強的溶劑；同時應(yīng)保來衡量，盡量勿選擇揮發(fā)性強的溶劑；同時應(yīng)保證對照溶液的主成分峰面積精密度良好。證對照溶液的主成分峰面積精密度良好。146. 積分參數(shù)的設(shè)定積分參數(shù)的設(shè)定 積分參數(shù)的設(shè)定是非常重要的。它主要由斜率積分參數(shù)的設(shè)定是非常重要的。它主要由斜率(Slope)、峰寬峰寬(Width)、最小峰面積、最小峰面積

11、(Min Area)組成。組成。 采用自身對照法時，對照溶液與供試品溶液必須在同采用自身對照法時，對照溶液與供試品溶液必須在同一斜率、峰寬下進行積分計算。一斜率、峰寬下進行積分計算。 這里主要是供試品溶液的最小峰面積設(shè)定，它將直接這里主要是供試品溶液的最小峰面積設(shè)定，它將直接導(dǎo)致測定結(jié)果。設(shè)定的太小，會導(dǎo)致很多小峰甚至是導(dǎo)致測定結(jié)果。設(shè)定的太小，會導(dǎo)致很多小峰甚至是基線漂移的小峰均被積分出作為雜質(zhì)峰，從而導(dǎo)致雜基線漂移的小峰均被積分出作為雜質(zhì)峰，從而導(dǎo)致雜質(zhì)峰面積增加，易判斷為不合格；如設(shè)定的太大，又質(zhì)峰面積增加，易判斷為不合格；如設(shè)定的太大，又將反應(yīng)不出雜質(zhì)的存在情況。將反應(yīng)不出雜質(zhì)的存在情

12、況。156. 最小峰面積最小峰面積的設(shè)定的設(shè)定 其設(shè)定，不是絕對值，而是相對值。其設(shè)定，不是絕對值，而是相對值。 英國藥典中有明確的說明：凡有關(guān)物質(zhì)的檢測采用英國藥典中有明確的說明：凡有關(guān)物質(zhì)的檢測采用HPLC法測定時，均規(guī)定舍棄對照溶液主峰面積幾分之幾的峰法測定時，均規(guī)定舍棄對照溶液主峰面積幾分之幾的峰面積。普通樣品測定時，通常為面積。普通樣品測定時，通常為1/10 1/20（即相當(dāng)于樣（即相當(dāng)于樣品測定濃度的品測定濃度的0.1%0.05%）。如規(guī)定雜質(zhì)限度為）。如規(guī)定雜質(zhì)限度為1.0%，對照溶液峰面積為對照溶液峰面積為10000，那么，最小峰面積可考慮設(shè)定，那么，最小峰面積可考慮設(shè)定為為1

13、000500左右。新藥穩(wěn)定性考核時，可設(shè)定到左右。新藥穩(wěn)定性考核時，可設(shè)定到0.01%的的最小峰面積。最小峰面積。 同時請大家注意，在進行原料藥銷售與購買的合同中，同時請大家注意，在進行原料藥銷售與購買的合同中，為確保雙方達成一致意見，此點應(yīng)予以重視。為確保雙方達成一致意見，此點應(yīng)予以重視。167. 保留時間的設(shè)定保留時間的設(shè)定 經(jīng)過上述方法學(xué)認(rèn)證后，確定供試品溶液的經(jīng)過上述方法學(xué)認(rèn)證后，確定供試品溶液的保留時間，通常以洗脫出全部雜質(zhì)和經(jīng)強力破壞保留時間，通常以洗脫出全部雜質(zhì)和經(jīng)強力破壞試驗出的雜質(zhì)，規(guī)定至主成分保留時間的幾倍為試驗出的雜質(zhì)，規(guī)定至主成分保留時間的幾倍為止。止。178. 強力破

14、壞試驗強力破壞試驗l 水破壞水破壞 取原料適量，加水溶解后，在取原料適量，加水溶解后，在90放置放置24小時。小時。l 氧化破壞氧化破壞 取原料適量，用取原料適量，用5%過氧化氫溶液溶解后，在過氧化氫溶液溶解后，在90放置放置24小時。小時。l 強堿破壞強堿破壞 取原料適量，用取原料適量，用1mol/L氫氧化鈉溶液溶解后，氫氧化鈉溶液溶解后，在在90放置放置24小時。小時。l 強酸破壞強酸破壞 取原料適量，加取原料適量，加1mol/L鹽酸溶液溶解后，在鹽酸溶液溶解后，在90放置放置24小時。小時。l 高溫破壞高溫破壞 取原料適量，依據(jù)各自品種的熔點不同，在高取原料適量，依據(jù)各自品種的熔點不同，

15、在高溫下破壞至外觀性狀改變溫下破壞至外觀性狀改變l 強光破壞強光破壞 取原料適量，置紫外燈下照射取原料適量，置紫外燈下照射48小時。小時。189. 定量檢測定量檢測 如有關(guān)物質(zhì)的檢查為定量檢測，即為雜質(zhì)對如有關(guān)物質(zhì)的檢查為定量檢測，即為雜質(zhì)對照品法，在上述項目的各項研究后，需增加線性照品法，在上述項目的各項研究后，需增加線性試驗以及一些必要的方法論證項目。試驗以及一些必要的方法論證項目。1910. HPLC/UV二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器 采用二極管陣列檢測器進行論證，也是目采用二極管陣列檢測器進行論證，也是目前常采用的一個強有力的手段。它通過對一個色前常采用的一個強有力的手段。它通過對

16、一個色譜峰的幾點進行紫外掃描，然后比較所得到的掃譜峰的幾點進行紫外掃描，然后比較所得到的掃描圖譜的接近程度從而評價被檢測峰的純度。描圖譜的接近程度從而評價被檢測峰的純度。 我室有一臺該檢測器，曾多次做過該方面的我室有一臺該檢測器，曾多次做過該方面的工作。工作。20薄薄 層層 色色 譜譜 法法 薄層色譜法由于既可檢測具有紫外吸收的薄層色譜法由于既可檢測具有紫外吸收的物質(zhì)，又可檢測不具有紫外吸收，因此也被廣物質(zhì)，又可檢測不具有紫外吸收，因此也被廣泛地應(yīng)用。但由于其不具有準(zhǔn)確定量的性質(zhì)，泛地應(yīng)用。但由于其不具有準(zhǔn)確定量的性質(zhì)，故其應(yīng)用受到一定的限制。故其應(yīng)用受到一定的限制。 1. 展開劑的確定展開劑

17、的確定 與與HPLC法相同，配制含有法相同，配制含有1%濃度各中間濃度各中間體的主成分對照品溶液作為系統(tǒng)適用性試驗用體的主成分對照品溶液作為系統(tǒng)適用性試驗用溶液進行試驗，來確證展開劑的適用性。溶液進行試驗，來確證展開劑的適用性。212 . 檢測方法的確定檢測方法的確定 可采用紫外燈下檢測，由于通常只具有兩種可采用紫外燈下檢測，由于通常只具有兩種波長波長254mn和和360nm，故測定有其局限性。，故測定有其局限性。 采用顯色的方法進行時，通常噴以顯色劑后采用顯色的方法進行時，通常噴以顯色劑后需立即檢視。需立即檢視。223 . 供試品溶液與對照溶液濃度的確定供試品溶液與對照溶液濃度的確定 （靈敏

18、度試驗（靈敏度試驗最小檢出點樣量的測定）最小檢出點樣量的測定） 其原理與其原理與HPLC法相同。法相同。 最低檢出量可采用不斷稀釋樣品溶液濃度，點樣直最低檢出量可采用不斷稀釋樣品溶液濃度，點樣直至觀測不到為止。至觀測不到為止。 最大點樣量可采用不斷增加樣品溶液濃度，直至不最大點樣量可采用不斷增加樣品溶液濃度，直至不拖尾的濃度為準(zhǔn)。拖尾的濃度為準(zhǔn)。 通?？紤]到試驗?zāi)褪苄砸蛩氐挠绊?，將供試品溶液通?？紤]到試驗?zāi)褪苄砸蛩氐挠绊?，將供試品溶液濃度設(shè)定為比最大點樣量略小一些為好。濃度設(shè)定為比最大點樣量略小一些為好。 該項試驗要求必須附有試驗的點樣圖譜照片。該項試驗要求必須附有試驗的點樣圖譜照片。 目前目

19、前USP、BP、EP中的一些規(guī)定。中的一些規(guī)定。234 .定量的確定定量的確定 由于由于TLC法通常無法準(zhǔn)確定量，故可采用法通常無法準(zhǔn)確定量，故可采用配制一系列濃度的對照溶液來衡量雜質(zhì)介于何配制一系列濃度的對照溶液來衡量雜質(zhì)介于何種濃度之間的方法進行，但此法較為煩瑣。種濃度之間的方法進行，但此法較為煩瑣。24紫外分光光度法（UV法） 在一些溶液劑的雜質(zhì)檢測中，也常采用在在一些溶液劑的雜質(zhì)檢測中，也常采用在可見區(qū)某波長處測定樣品溶液的吸收度值，以可見區(qū)某波長處測定樣品溶液的吸收度值，以不超過某限度為準(zhǔn)的方法。不超過某限度為準(zhǔn)的方法。 這里需注意的是，同時需附有溶劑、輔料這里需注意的是，同時需附有

20、溶劑、輔料（制劑時）的紫外掃描圖譜，以驗證該法的專（制劑時）的紫外掃描圖譜，以驗證該法的專屬性。屬性。 25有關(guān)物質(zhì)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的制訂1. 通常在原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，需制訂有關(guān)物質(zhì)檢通常在原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，需制訂有關(guān)物質(zhì)檢查項。制劑時，如經(jīng)制劑工藝后，與原料藥比較查項。制劑時，如經(jīng)制劑工藝后，與原料藥比較有關(guān)物質(zhì)有所增加或經(jīng)穩(wěn)定性考核后，有關(guān)物質(zhì)有關(guān)物質(zhì)有所增加或經(jīng)穩(wěn)定性考核后，有關(guān)物質(zhì)量有所增加，均應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制訂有關(guān)物質(zhì)檢量有所增加，均應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制訂有關(guān)物質(zhì)檢查項，如未有明顯增加，可考慮不予以制訂。查項，如未有明顯增加，可考慮不予以制訂。26有關(guān)物質(zhì)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的制訂2. 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的系統(tǒng)適用性試驗，應(yīng)規(guī)定理論板數(shù)按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的系統(tǒng)適用性試驗，應(yīng)規(guī)定理論板數(shù)按主成分峰計應(yīng)不低于多少（通常為主成分峰計應(yīng)不低于多少（通常為2000） ，且最好，且最好能將相應(yīng)的雜質(zhì)（該雜質(zhì)為最難分離的）訂入，以能將相應(yīng)的