真菌毒素的檢驗

1、第八章 真菌毒素的檢驗 主要內(nèi)容主要內(nèi)容 1.概述概述 2.真菌毒素分類真菌毒素分類 3.真菌毒素檢測基本步驟真菌毒素檢測基本步驟1.概述 真菌毒素-由真菌生產(chǎn)的有毒代謝產(chǎn)物。具有毒性、致癌性、致突變型和致畸性等?！岸灸⒐?、迷神麥、醉谷病” 真菌毒素的危害： （1）引起糧食作物的病害和產(chǎn)品腐敗變質(zhì)； （2）對人類和動物健康產(chǎn)生威脅。2.真菌毒素分類 按產(chǎn)生菌可分為：曲霉毒素類、青霉毒素類、鐮刀菌毒素類等。水活度（Aw對真菌生長和產(chǎn)毒影響較大。 真菌毒素毒性： （1）致DNA損傷，有的致癌； （2）細(xì)胞毒性，有的破壞質(zhì)膜和細(xì)胞酶的作用 常見的真菌性食物中毒：黃曲霉毒素中毒、黃變米或灰變米中毒，赤

2、霉沼渣粉中毒等。3.真菌毒素檢測基本步驟 1.采樣和樣品的準(zhǔn)備 （1）采樣的地點 根據(jù)分析目的的不同確定采樣地點，如：農(nóng)田、倉庫、加工廠、運(yùn)輸工具、零售商和醫(yī)院等。 （2）采樣方法 1）靜態(tài)樣品的采集 靜態(tài)樣品：麻袋、箱柜和車廂等容器存放分樣品均屬靜態(tài)樣品。 采樣工具：頂端尖銳的長柄采樣釬子。 采樣數(shù)量：小批量時采1/4；大批量時為整批麻袋數(shù) 2）動態(tài)樣品的采集 用商品化的十字交叉切分自動采樣器 （3）采樣量 采大樣，按四分法對角連續(xù)多次分樣縮減至12kg，最后取代表樣全部粉碎。 美國農(nóng)業(yè)部USDA的方法：成批樣每批取3份大樣，每份22kg。 實驗室分析用的樣品為15kg。 2.提取 1.提取

3、溶劑 溶劑的選擇取決于待測毒素的種類、毒素性質(zhì)、毒素在提取溶劑中的溶解度、提取溶劑的毒性價格、非測定成分在提取溶劑中的分配系數(shù)等。 選用：毒性小、極性大、價格低廉的溶劑系統(tǒng) 常用溶劑：甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙睛和水中一種或多種不同配比的混合物。 2.提取溫度 溫度影響毒素的回收率，適當(dāng)升高溫度可以增加毒素的回收率。 3.食品基質(zhì) 固體食品：選用浸劑、洗脫、索氏回流等方法。 液體食品：液液分配方法。 提取酸性真菌毒素時，通常需提高提取溶劑系統(tǒng)中水相的pH值，使其有效地將被提取物堿化或形成水溶性堿混合物后，再進(jìn)行提取。 3. 純化 純化：在確保不損失待測毒素的前提下除去干擾雜質(zhì)的過程稱

4、為純化。 常用凈化方法： 液固萃取、液液分配、化學(xué)吸附、色譜法、透析法以及SFE法等。 使用最廣泛的是色譜法。 色譜法：薄層色譜法（柱色譜法最常用） 吸附色譜柱常用的吸附劑： 硅膠、礬土、氧化鋁、活性炭、弗羅里硅土 分配色譜柱常用的填充劑：硅藻土、纖維素。 固相提取（廣泛采用） 免疫親和柱IAC（應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的新技術(shù)） 4.檢測 （1）薄層色譜法 （2）高效液相色譜法 （3）氣相色譜法 （4）酶聯(lián)免疫吸附試驗第二節(jié) 主要真菌毒素及其檢驗 1.黃曲霉毒素 （1）特性 （2）食品中來源 （3）毒性與危害 （4）檢測方法 霉菌 霉菌均由分枝或不分枝的菌絲構(gòu)成，許多菌絲交織在一起形成菌絲體，菌絲在光學(xué)

5、顯微鏡下呈管狀，210 um 比一般細(xì)菌放線菌細(xì)胞大幾倍至幾十倍，與酵母菌相似，而其菌絲又分為有隔菌絲和無隔菌絲，再就是根據(jù)其功能不同又分為營養(yǎng)菌絲，氣生菌絲。 無隔菌絲：菌絲為長管狀，單細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含多個核，其生長過程只表現(xiàn)為菌絲的延長和細(xì)胞核的裂殖增多，以及細(xì)胞質(zhì)的增加，如毛霉，根霉，犁頭霉。 有隔菌絲：為大多數(shù)的。菌絲由橫隔膜分隔成成串的多細(xì)胞，每個細(xì)胞內(nèi)含有一個或多個細(xì)胞核，有些菌絲外觀看起來像多細(xì)胞，但橫隔膜上有小孔，使細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，可自由流通，每個細(xì)胞功能也相同，如青、曲、白地霉。 營養(yǎng)菌絲（基質(zhì)菌絲）就是在生長過程中，伸入到培養(yǎng)的基質(zhì)中，為真菌提供營養(yǎng)的菌絲。 氣生菌絲圖（繁

6、殖菌絲）它主要是伸入到菌周的空氣環(huán)境中，它主要作用是產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生孢子時的氣生菌絲稱繁殖菌絲。 霉菌的繁殖 主要是由繁殖器官產(chǎn)生孢子，繁殖器管是由繁殖菌絲產(chǎn)生的可以是單細(xì)胞，也可是多細(xì)胞，有時產(chǎn)生無性孢子，有時產(chǎn)生有性孢子，如青霉，曲霉，在生長過程中，由于生長條件的改變，有時產(chǎn)生有性孢子，有時產(chǎn)生無性孢子，但主要還是以無性孢子為主。 有性孢子：子囊孢子，結(jié)合孢子，卵孢子，擔(dān)孢子。 無性孢子：分生孢子，關(guān)節(jié)孢子，芽生孢子，孢子襄孢子，厚膜孢子。 霉菌培養(yǎng)特性的鑒定 青、曲-察氏培養(yǎng)基，鐮刀菌、芽枝霉-馬鈴薯葡萄糖瓊脂進(jìn)行劃線或點種于瓊脂上，2528，定期觀察。 生長速度：培養(yǎng)一定天數(shù)（5、10、

7、15天）測大小，描述常以極慢、慢、中等、快、說明。 菌的顏色：包括子實體，氣生菌絲、菌核，埋伏菌絲及其顏色。 菌落表面構(gòu)造：蔬松，緊密、扁平、隆起，凹陷，或皺褶，有無同心環(huán)，放射溝，并觀察菌全部，中心部，中間部分及邊緣部分。 菌落質(zhì)地：外觀似氈狀、絨毛狀、棉絮狀、羊毛狀、襄狀、粉粒狀、明膠狀或皮革狀。 1.黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT)的特性 AFT目前已分離鑒定出20余種異構(gòu)體，其中最常見的包括B1、B2、G1、G2、M1、M2 。 特性： 紫外線下發(fā)不同顏色的熒光，藍(lán)色熒光（Blue fluorescence）為B族，黃綠色熒光（yellow-Green fluorescence

8、）為G族；M1和M2為B1、B2的羥化衍生物，主要存在于奶（milk）及奶制品、肉類（meat）中，故名M族。 呋喃環(huán)有雙鍵者毒性強(qiáng)，具有致癌性； 溶于油、氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑，不溶于水、乙醚、石油醚； 耐熱，加熱到280才裂解破壞； 在中性和酸性溶液中穩(wěn)定，在pH值9-10的強(qiáng)堿性溶液中迅速分解。 2.黃曲霉毒素的毒性 急性毒性：劇毒物，毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。 慢性毒性：動物生長遲緩，肝臟出現(xiàn)亞急性或慢性損傷。 三致作用：致癌、致畸、致突變 。 3.黃曲霉毒素產(chǎn)生的影響因素 培養(yǎng)基：花生、玉米等是黃曲霉的天然培養(yǎng)基。 溫度和濕度：最適生長溫度在37左右，產(chǎn)毒溫度略低于最適生長溫

9、度，黃曲霉毒素產(chǎn)毒溫度28-32，相對濕度85以上。 水分：產(chǎn)毒的適宜水分活度為0.8-0.9。 pH值：最適pH值為3 。 4.衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 1995年，世界衛(wèi)生組織制定的食品黃曲霉毒素最高允許濃度為15g/kg。 美國規(guī)定人類消費(fèi)食品和奶牛飼料中的黃曲霉毒含量(指B1+B2+G1+G2的總量)不能超過15 g/kg 。 我國的標(biāo)準(zhǔn) 玉米、花生、花生油、堅果和干果(核桃、杏仁) 20 g/kg。 大米、其他食用油(香油、菜籽油、大豆油、葵花油、胡麻油、茶油、麻油、玉米胚芽油、米糠油、棉籽油) 10 g/kg。 其他糧食(麥類、面粉、薯干)、發(fā)酵食品(醬油、食用醋、豆豉、腐乳制品)、淀粉類制品(糕

10、點、餅干、面包、裱花蛋糕) 5 g/kg。 牛乳及其制品(消毒牛奶、新鮮生牛乳、全脂牛奶粉、淡煉乳、甜煉乳、奶油)、黃油、新鮮豬組織(肝、腎、血、瘦肉) 0.5 g/kg。 5.黃曲霉毒素的檢測方法- 薄層層析法 原理：將樣品經(jīng)過提取、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色（B1/B2）或黃綠色熒光（G1/G2) 提取 檢測 薄層板的制備 點樣 展開與觀察 定量試驗 高效液相色譜法 提取凈化衍生測定 酶聯(lián)免疫吸附法競爭抑制法見教材P179 酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA（enzyme linked immunosorbent assay） 是一類常用的免疫酶技術(shù)。是將已知的抗原或抗體

11、吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。常用的酶：辣根過氧化物酶(HRP) 堿性磷酸酶（AP）。ELISA方法的基本原理（1）使抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面，并保持其免疫活性。（2）使抗原或抗體與酶結(jié)合成酶標(biāo)抗原或抗體，并保持抗原或抗體的免疫活性和酶的活性。（3）酶標(biāo)的抗原或抗體與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶催化底物形成水解、氧化或還原反應(yīng)，形成有色物質(zhì)，其顏色的深淺與標(biāo)本中的抗原或抗體 的量直接相關(guān)。ELISA方法的基本類型 （一） 雙抗體夾心法 （二） 間接法 （三） 競爭法（一）雙抗體夾心法 洗洗滌滌洗洗滌滌洗洗滌滌待測抗原待測抗原特異性抗體吸特異性抗體吸附于

12、固相載體附于固相載體酶標(biāo)抗體和底物酶標(biāo)抗體和底物（二）間接法洗滌洗滌洗滌洗滌洗滌洗滌待測抗體待測抗體酶標(biāo)抗抗體酶標(biāo)抗抗體（三）競爭法洗滌洗滌洗滌洗滌待測抗原待測抗原酶標(biāo)抗原酶標(biāo)抗原酶聯(lián)免疫競爭法工作原理（1）酶聯(lián)免疫吸附法-競爭抑制法測AFB1 試劑：TMB，30%H2O2，牛血清白蛋白，吐溫-20 抗體：抗AFB1的特異性單克隆抗體 包被抗原：AFB1與載體蛋白的結(jié)合物 酶標(biāo)二抗： 緩沖液：磷酸鹽緩沖液、終止液1mol/L的硫酸 AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液： 步驟： 1.提?。?0g樣品+50ml乙腈-水 濾紙過濾 BSA洗液稀釋 2.測定：包被抗原包被酶標(biāo)微孔板 洗液洗去多余抗原 加AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液

13、 加稀釋抗體（37度1.5h) 洗液洗3次后，加酶標(biāo)二抗（ 37度培養(yǎng)2h） 反復(fù)洗后加底物溶液 加終止液 （包被加樣-加酶標(biāo)抗原和待測抗原-加底物顯色終止反應(yīng) （顯色原理對照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。固定固定OD值值微孔板微微 孔孔 表表 面面 情情 況況AFB1包被包被抗體抗體. （2）赭曲霉毒素 毒性：主要對腎產(chǎn)生危害，造成腎腫大，當(dāng)濃度超過5mg/kg時，對肝臟組織和腸道產(chǎn)生破壞，引起腸炎等。 特性：無色結(jié)

14、晶化合物，易溶于極性溶劑和稀的碳酸氫鈉水溶液腫，微溶于水，在紫外光照射下，呈綠色熒光，該化合物穩(wěn)定，在乙醇中置冰箱避光保存一年以上而不破壞，但在谷物中隨時間延長而降解。 存在于：糧谷物、大豆、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧克力、中草藥、調(diào)味料、啤酒等。 檢測方法：液相色譜法、薄層層析法 （3）雜色曲酶毒素 毒性：引起腫瘤 污染：小麥、大麥、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等。 易溶于氯仿、苯、吡啶、乙睛和二甲基亞砜，微溶于甲醇、乙醇，不溶于水和堿性溶液。在紫外線照射下，具有磚紅色熒光。 檢測方法：薄層法，紫外分光光度計測定 （4）伏馬菌素 自然界中最為普遍，毒性強(qiáng)，損傷肝腎功能。 白色粉末，易溶于水、甲醇、乙睛等溶劑中，在甲醇溶液中不穩(wěn)定，在乙睛水溶液中非常穩(wěn)定。 檢測方法：高效液相色譜法. （5）單端孢霉烯族化合物 頭孢菌、鐮孢菌、木霉菌等。 侵害玉米、小麥、大米、燕麥、大麥等。 無色結(jié)晶、在常溫下非常穩(wěn)定，難溶于水，溶于極性溶劑，在烹調(diào)等加熱過程中不會被破壞，在紫外光下不顯熒光。但T-2毒素在紫外光下產(chǎn)生一種具有藍(lán)色熒光物質(zhì) 檢測方法：薄層法 （6）玉米赤霉烯酮 禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌、木賊鐮刀菌 具有類似雌激素的作用，可與雌激素受體結(jié)合而影響細(xì)胞核的雌激素轉(zhuǎn)錄，刺激含雌激素受體的乳腺癌細(xì)胞的增長。 特性：是一