支氣管哮喘小鼠氣道反應(yīng)性無創(chuàng)檢測方法的建立

1、支氣管哮喘小鼠氣道反應(yīng)性無創(chuàng)檢測方法的建立李斌愷賴克方洪燕華王法霞陳如沖林少建鐘南山【摘要】目的目前國內(nèi)對支氣管哮喘(簡稱哮喘)小鼠的評價多數(shù)僅立足于氣道炎性指標，不能完全反映哮喘的病理生理特征。本所率先從國外引進了小動物無創(chuàng)檢測和有創(chuàng)檢測肺功能儀。無創(chuàng)法檢測時小鼠不必麻醉，而且每次可以同時測多只小鼠，具有較大的優(yōu)越性，但能否取代有創(chuàng)法尚需更多的數(shù)據(jù)。本研究旨在建立無創(chuàng)檢測小鼠氣道高反應(yīng)性的檢測方法，并與有創(chuàng)檢測方法進行比較。方法根據(jù)動物模型和氣道反應(yīng)性檢測方法不同，動物分為：無創(chuàng)哮喘組；無創(chuàng)對照組；有創(chuàng)哮喘組；有創(chuàng)對照組。采用卵白蛋白致敏和激發(fā)，建立BALB/c小鼠哮喘模型，生理鹽水作為對照

2、，分別用無創(chuàng)和有創(chuàng)的方法測定氣道反應(yīng)性。哮喘動物霧化吸入0.250g/L倍增濃度的乙酰甲膽堿(Mch)，測定相應(yīng)濃度下的增強呼氣間歇(Penh)值或氣道阻力(RL)值等指標。將小鼠吸入Mch后RL或Penh增加2倍的激發(fā)濃度以PC100來表示。所有動物都行支氣管肺泡灌洗，收集灌洗液，涂片染色后分類計數(shù)。結(jié)果無創(chuàng)哮喘組PC100均<6.25g/L,對照組PC100均>12.5g/L。其Log2(10PC100)值(5.36±0.84)顯著低于對照組(7.97±0.82)(P<0.01)。無創(chuàng)哮喘組從Mch濃度3.12g/L開始，其Penh值明顯高于對照組。有

3、創(chuàng)哮喘組RL值從Mch濃度0.39g/L開始就明顯高于相應(yīng)對照組(P<0.05)。無創(chuàng)組與有創(chuàng)組的氣道反應(yīng)性相關(guān)系數(shù)R=0.96(P<0.01)。無創(chuàng)哮喘組和有創(chuàng)哮喘組的嗜酸粒細胞分別為(54.00±5.96)%,(55.93士5.92)%，顯著高于各自對照組的(0.38±0.52)%,(0.63±0.74)%(P<0.01)。結(jié)論本研究表明以Penh為主要測定指標的無創(chuàng)方法，可以成功檢測哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性?！娟P(guān)鍵詞】小鼠；氣道反應(yīng)性；支氣管哮喘；增強呼氣間歇；無創(chuàng)檢測AbstractObjectiveMostoftheevaluationon

4、asthmaticmousemodelonlybasedontheairwayinflammation,notfullyreflectingitspathophysiology.Noninvasivemethodofmeasuringbronchialhyperresponsivenesscandetectseveralconsciousmiceinonetime,butwhetheritcanreplacetheinvasivetechniqueneedsmoredatatobeidentified.Thisstudyaimstoestablishanon-invasivedetection

5、ofmouseairwayhyperresponsiveness,comparingwiththeinvasivemethod.MethodsAccordingtodifferentwaysofdetection,miceweredividedintofourgroups:non-invasiveasthmagroup,non-invasivecontrolgroup,invasiveasthmagroupandinvasivecontrolgroup.Mousewassensitizedandchallengedwithovalbumin(OVA)forasthmaticmodel.Them

6、icewerechallengedwithincreasingconcentrationsofmethacholineaerosolfrom0.2250g/L,andtheairwayresistancewasmeasured.Enhancepause(Penh)orairwayresistance(RL)wastakenforeachgroup.Thedoseofmethacholinecausing100%increaseofrespiratoryresistancewasdefinedasPC100.ThePC100valueswereconvertedintoLog2(10PC100)

7、forstatisticalanalysis.Bronchoalveolarlavagecytologywasperformedtoevaluatetheairwayinflammation.ResultsThePC100ofnon-invasiveasthmagroupwas<6.25g/L,andthenon-invasivecontrolgroup's>12.5g/L.ItsLog2(10PC100)valuewassignificantlylessthanthatofcontrolgroup,(5.360.84)vs(7士970.82)豐P<0.01).The

8、Penhvalueofnon-invasiveasthmagroupbegansignificantlyincreasingwhentheconcentrationofMchwas3.12g/L.TheRLvalueofinvasiveasthmagroupwasincreasingatthebeginningof0.39g/L(P<0.05).Thecoefficientrateoftwogroupswas0.96(P<0.01).TheEOS(%)ofnon-invasiveasthmagrouporinvasiveasthmagroupwas54.005.96,55.935.

9、92respectively,significantlylargerthanthatofcontrolgroup(0.38±0.52,0.63±0.74,P<0.01).ConclusionsThisstudyshowsthatsingle-chamberedbarometricwhole-bodyplethysmographyasanon-invasivelungfunctiontestcansuccessfullydetectairwayresponsivenessinasthmaticmousemodel.KeywordsMice;Airwayhyperresp

10、onsiveness;Bronchialasthma;Enhancepause;Noninvasivemethod從最早的電刺激離體氣管平滑肌收縮能力測定，到現(xiàn)在的無創(chuàng)單腔整體體積描計，國外在對動物氣道反應(yīng)性的測定技術(shù)上經(jīng)過了漫長的發(fā)展歷程。而目前國內(nèi)在對支氣管哮喘（簡稱哮喘）小鼠的評價上多數(shù)僅僅立足于氣道炎性指標，在氣道反應(yīng)性的檢測方面近幾年才起步，而且是用有創(chuàng)的方法。我所率先從國外引進了動物無創(chuàng)檢測的肺功能儀。氣管插管后再測定動物氣道阻力的有創(chuàng)法是評價動物氣道反應(yīng)性的經(jīng)典方法。無創(chuàng)法則不需氣管插管等繁瑣的步驟，在動物處于自然狀態(tài)下就可以直接測定其氣道反應(yīng)性，而且每次可以同時檢測多只小鼠，具

11、有較大的優(yōu)越性，但能否取代有創(chuàng)法尚需更多的數(shù)據(jù)。因此，我們有必要探討其與有創(chuàng)法的相關(guān)性，判定其是否能夠有效檢測動物的氣道反應(yīng)性，以期建立哮喘小鼠氣道反應(yīng)性的無創(chuàng)檢測方法。材料與方法一、儀器與試劑儀器：本實驗采用美國Buxco公司小鼠無創(chuàng)肺功能儀和有創(chuàng)肺功能儀，是目前國際上通用的小鼠肺功能檢測儀器，主要包括體描箱，壓力傳感器（流量傳感器），信號放大器和霧化器等。其工作原理是，將乙酰甲膽堿（methacholine,Mch）或生理鹽水（NS）等通過霧化器霧化入體描箱內(nèi)，箱內(nèi)小鼠吸入霧化氣體后呼吸運動的改變引起箱內(nèi)壓力、流量產(chǎn)出相應(yīng)的變化，連接于體描箱的壓力傳感器（流量傳感器）將采集到的信號傳至信號

12、處理系統(tǒng)，并在信號放大器作用下轉(zhuǎn)化為呼吸動力學各指標值。兩套肺功能儀中，無創(chuàng)肺功能儀具有6個體描箱（也有配置更多的）,相應(yīng)的傳感器可以將各個箱內(nèi)壓力、流量的變化同步傳至信號處理系統(tǒng)處理，因此可以同步為多只小鼠進行肺功能檢測。主要試劑：雞卵白蛋白（OVA）（V級，美國Sigma公司），氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司），Mch（美國Sigma公司）。二、實驗動物及分組實驗動物：SPF級BALB/c雌鼠，56周齡，體質(zhì)量1820g，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，并在該中心飼養(yǎng)。飼料為去OVA（不含雞蛋）的特殊食物。飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF實驗動物級環(huán)境設(shè)施標準。分組：根據(jù)動物模型和氣道反應(yīng)性檢測方法不

13、同，分為：無創(chuàng)哮喘組；無創(chuàng)對照組；有創(chuàng)哮喘組；有創(chuàng)對照組。其中，無創(chuàng)哮喘組、有創(chuàng)哮喘組每組10只小鼠；無創(chuàng)對照組、有創(chuàng)對照組每組8只小鼠。三、哮喘模型的建立方法實驗第0天、第7天和第14天行腹腔注射致敏：模型組每次給予20dgOVA+150dlAl（OH）3+50科lNS（100mg/L）混懸液；對照組給予200科lNS。實驗第28天、第29天和第30天行滴鼻激發(fā)；模型組每次給予50科lOVA2NS（2g/L）滴鼻，對照組給予50科lNS。四、檢測的指標及原理無創(chuàng)組用體積描記法測定增強呼氣間歇（enhancedpause,Penh）如圖11所示：曲線反映的是體描箱內(nèi)小鼠呼吸時的壓力變化；曲線上

14、部分為呼氣相，下部分為吸氣相；氣流受限時曲線的呼氣相部分明顯延長，呈現(xiàn)阻塞性通氣功能障礙時特有的呼氣末凹陷，呼氣相延長的程度反映了氣流受限的程度，定義為呼氣間歇（Pause），用吸氣峰流速（peakinspirationpressure,PIP）及呼氣峰流速（peakexpirationpressure,PEP）比將其標準化即得Penh,此參數(shù)即可反映氣道反應(yīng)性。計算公式如圖所示：其中Te代表呼氣相時間，Ti代表吸氣相時間，Tr代表呼氣相“松弛時間”即呼氣相描記箱內(nèi)壓力衰減為PEP的36%所用時間。Penh=PEP/PIPXPause。有創(chuàng)組測定的是氣道阻力（RL）值。+指3箱內(nèi)壓力-匕“5年

15、氣間覽卜T覃“ITPPPPznhf堆總呼氣間激卜=P«*圖1增強呼氣間歇五、氣道反應(yīng)性的檢測實驗第32天,首先,連接好Buxco無創(chuàng)肺功能儀并定標。將自然狀態(tài)下的BALB/c小鼠置入體描箱中，先測定基礎(chǔ)Penh值；隨后用Mch激發(fā),濃度由低到高依次為0、0.20、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25和50g/L,記錄此時的Penh值，每次霧化吸入2min，記錄3min。有創(chuàng)組則是將小鼠行氣管插管后用Buxco有創(chuàng)肺功能儀測定其RL值。六、氣道炎癥氣道反應(yīng)性檢測后行支氣管肺泡灌洗（PBS0.8mlX3次），回收支氣管肺泡灌洗液，離心，細胞沉淀重懸，取部分計算

16、細胞總數(shù)，余下部分制備涂片，HE染色后行細胞分類計數(shù)，每張涂片計數(shù)400個細胞，記錄各種細胞數(shù)目。七、統(tǒng)計學處理實驗結(jié)果以？x玄表示，為進行無創(chuàng)組和有創(chuàng)組氣道反應(yīng)性相關(guān)分析，分別將每個Mch激發(fā)濃度下的Penh與RL組轉(zhuǎn)換為與NS激發(fā)的基礎(chǔ)值的百分比（Mch激發(fā)的Penh值或RL值/NS激發(fā)的Penh值或RL值x100%）來表示。采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析，兩組樣本均數(shù)進行t檢驗或相關(guān)分析，P<0.05、P<0.01表示差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果一、小鼠的氣道反應(yīng)性小鼠在各濃度級Mch激發(fā)下，各組RL變化各異，具體見表1。Penh升為基礎(chǔ)水平2倍時的Mch濃度定為PC100。無創(chuàng)

17、哮喘組PC100均<6.25g/L,對照組PC100均>12.5g/L。具體分布見表2。無創(chuàng)哮喘組Log2（10PC100）值（5.36土0.84）顯著低于對照組（7.97土0.82）（P<0.01）。表1各濃度級Mch激發(fā)下各組的平均氣道阻力組別Mch(g/L)基線生理鹽水0.200.390.781.563.,126.2512.5025.0050.00無創(chuàng)對照組0.480.450.460.490.450.520.,520.540.771.392.03無創(chuàng)哮喘組0.450.460.520.490.520.650.,961.382.413.905.25有創(chuàng)對照組1.571.61

18、1.681.852.212.412.,613.224.075.056.81有創(chuàng)哮喘組1.781.842.053.123.904.145.,145.857.108.8311.01注：Mch:乙酰甲膽堿表2無創(chuàng)哮喘組和無創(chuàng)對照組PC100分布組別PC100(g/L)0.000.200.390.781.563.126.2512.5025.0050.00無創(chuàng)哮喘組無創(chuàng)對照組注：“”個數(shù)表示PC100分布數(shù)目用無創(chuàng)方法測得的小鼠氣道反應(yīng)性如圖2所示，其氣道反應(yīng)性是以小鼠在NS激發(fā)下的Penh值為基準，取其他各個濃度級Mch激發(fā)下的Penh值與其百分比來反映。對于用有創(chuàng)方法測得的RL值也是用類似的方法轉(zhuǎn)換

19、成比值來表示。兩種方法(無創(chuàng)與有創(chuàng))分別測定的模型組與對照組的氣道高反應(yīng)性結(jié)果見圖2、圖3。將無創(chuàng)哮喘組和有創(chuàng)哮喘組的氣道反應(yīng)性相應(yīng)值行兩樣本的t檢3軟彳導(dǎo)P>0.05。0000.200.39H781.563.126.25125025-0050.00乙陸甲膽豌孚"1注:與尢創(chuàng)對照組相比P<005圖2無創(chuàng)哮喘維和無創(chuàng)時照組的氣道反應(yīng)曲葭MJMlJOloJOyJJOD7(舊的事加2011(I3一¥珀占副0.000.200.390.7B1.563J26.2512502S.0050.00乙甌甲膽映幽注：與有創(chuàng)村照組相比P<0.05圖3存創(chuàng)哮喘組和有創(chuàng)對照組的氣道反

20、應(yīng)曲線二、氣道反應(yīng)性的相關(guān)性將反映無創(chuàng)哮喘組和有創(chuàng)哮喘組氣道反應(yīng)性的Penh值和RL行相關(guān)分析得出其相關(guān)系數(shù)R=0.96(P<0.01)。見圖4。K-062t遭阻力"mHjU*匚圖4無創(chuàng)嘮喘組和仃創(chuàng)哮喘組氣道反應(yīng)性相關(guān)圖三、氣道炎癥見表3。表3各實驗組肺泡灌洗液細胞涂片的細胞分類組別鼠數(shù)嗜酸粒細胞（%）中性粒細胞（%）淋巴細胞（%）巨噬細胞（%）無創(chuàng)對照組80.38±0.5210.63±5.1814.75±6.3474.25±5.55無創(chuàng)哮喘組1054.00±5.96a7.252t.3910.435-0728.335.64有創(chuàng)對

21、照組80.63±0.7412.00±4.8714.00±4.1073.37±6.84有創(chuàng)哮喘組1055.93±5.92b7.733t.5511.882t8124.487.12注：與無創(chuàng)對照組相比，aP<0.01;與有創(chuàng)對照組相比，bP<0.01討論國外對小鼠氣道反應(yīng)性測定的方法研究頗多。最早的為電刺激離體氣管平滑肌收縮能力測定。由于是離體測定，故難以反映氣道受刺激后黏液分泌和黏膜水腫等情況；又因為標本只是取自大氣道，所以不能完全反映小氣道病變所引起的肺通氣功能障礙。1967年，Palecek等1首次建立體積描記法測定肺阻抗，此方法是

22、通過氣管切開和機械通氣的方式進行的，因此存在麻醉及手術(shù)等影響因素，而且不能對同一動物進行反復(fù)檢測。后來，Likens等2將此法改進為經(jīng)口氣管插管，實現(xiàn)了重復(fù)檢測，但對小鼠行經(jīng)口氣管插管則有一定的技術(shù)難度。1979年，Pennock等3建立了雙室體積描記法，但此法需要限制小鼠活動，不適進行長期監(jiān)測。1997年，Hamelmann等4初步建立了無創(chuàng)的單腔整體體積描計法，克服了雙室體積描記的不足。該方法是根據(jù)哮喘時Te延長、表現(xiàn)為呼氣末暫停時間延長即Penh來定量反映氣流受限程度。但Penh并不是反映RL的一個直接指標，目前仍存在不少爭議。目前國內(nèi)對哮喘小鼠的評價多數(shù)僅立足于氣道炎性指標，不能完全反

23、映哮喘的病理生理特征。本實驗率先在國內(nèi)采用單腔的整體體積描計法檢測BALB/c小鼠的氣道反應(yīng)性，探討Penh作為氣道反應(yīng)性無創(chuàng)檢測指標的可行性，嘗試建立無創(chuàng)高效的氣道反應(yīng)性檢測方法。既往已證實，同樣方法制作的哮喘模型，以有創(chuàng)檢測的方式測得的氣道反應(yīng)性已明確高于對照組51本實驗的有創(chuàng)哮喘組與對照組相比也同樣證實有明顯的氣道高反應(yīng)性。提示本實驗建立的無創(chuàng)的氣道反應(yīng)性檢測方法可能與既往經(jīng)典的有創(chuàng)檢測方法有一定的相關(guān)性。而將反映無創(chuàng)哮喘組和有創(chuàng)哮喘組的氣道反應(yīng)性的Penh值和RL值行相關(guān)分析，結(jié)果非常接近1（P<0.01）,證實兩種方法密切相關(guān)。無創(chuàng)哮喘組從Mch為3.12g/L開始出現(xiàn)Penh

24、明顯升高，而有創(chuàng)哮喘組從0.39g/L就開始呈現(xiàn)這樣的變化，提示無創(chuàng)方法的敏感性稍低。這可能與Mch在有創(chuàng)方法中是通過插管直接作用于下氣道，而在無創(chuàng)法中要經(jīng)過鼻部等上氣道后才作用于下氣道有關(guān)。但是兩組反應(yīng)性差異無統(tǒng)計學意義，說明兩種方法測得的反應(yīng)性相當。此外，在檢測小鼠氣道反應(yīng)性過程中，行無創(chuàng)方法的小鼠不必麻醉，而且每次可以同時檢測6只小鼠，動態(tài)觀察也不受限；這些在有創(chuàng)方法中都無法實現(xiàn)。從氣道炎性指標上看，無創(chuàng)哮喘組和有創(chuàng)哮喘組的嗜酸粒細胞明顯高于各自的對照組(P<0.01)。而本實驗所制作的模型是參照我所于2006年已成功制作的哮喘模型5,說明該模型的氣道炎性有良好的重復(fù)性。綜上所述，以Penh為主要測定指標的無創(chuàng)肺功能檢測方法作為BALB/c雌鼠氣道高反應(yīng)性的檢測可行、高效。至于