第九章免疫學(xué)方法及其應(yīng)用(修改)

1、第九章第九章 傳染與免疫傳染與免疫第一節(jié) 傳染 自學(xué)第二節(jié) 非特異性免疫第三節(jié) 特異性免疫自學(xué)！病原微生物感染病原微生物感染機(jī)體對抗機(jī)體對抗免疫免疫免疫學(xué)幾個基本概念免疫學(xué)幾個基本概念免疫免疫(immunity)：是人和動物機(jī)體的一種是人和動物機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng)，保護(hù)性反應(yīng)，其作用是其作用是“識別識別”和排除抗原性和排除抗原性“異物異物”，以維持機(jī)，以維持機(jī)體生理的平衡和穩(wěn)定。體生理的平衡和穩(wěn)定。免疫學(xué)：免疫學(xué)：研究機(jī)體自我識別和對抗原性異物排斥反應(yīng)研究機(jī)體自我識別和對抗原性異物排斥反應(yīng)的一門科學(xué)。的一門科學(xué)。傳統(tǒng)的免疫概念：傳統(tǒng)的免疫概念：機(jī)體抵抗病原微生物的能力，即機(jī)體抵抗病原微生物的能

2、力，即抗傳染免疫抗傳染免疫1.1.免疫免疫和免疫學(xué)和免疫學(xué)2.2.免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)：免疫系統(tǒng)：具有自身的運(yùn)行機(jī)制并可與其他系統(tǒng)相互具有自身的運(yùn)行機(jī)制并可與其他系統(tǒng)相互配合、相互制約，共同維持機(jī)體在生命過程中總的生配合、相互制約，共同維持機(jī)體在生命過程中總的生理平衡。理平衡。免疫系統(tǒng)的任務(wù)是消滅免疫系統(tǒng)的任務(wù)是消滅“異己異己”“異己異己”來自兩個方面來自兩個方面: :外來的入侵者：外來的入侵者： 侵入身體的各種侵入身體的各種致病菌致病菌包括哪些？包括哪些？(2)“(2)“變壞了的變壞了的”自身細(xì)胞。自身細(xì)胞。(1)(1) 細(xì)胞癌變細(xì)胞癌變免疫系統(tǒng)的生理功能免疫系統(tǒng)的生理功能免疫防御免疫防

3、御機(jī)體機(jī)體排斥排斥外源性抗原異物的能力。外源性抗原異物的能力。免疫自穩(wěn)免疫自穩(wěn)機(jī)體機(jī)體識別和清除識別和清除自身衰老殘損的組織自身衰老殘損的組織 、細(xì)胞，維持正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。、細(xì)胞，維持正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。免疫監(jiān)視免疫監(jiān)視機(jī)體機(jī)體殺傷和清除殺傷和清除異常突變細(xì)胞，機(jī)體異常突變細(xì)胞，機(jī)體 監(jiān)視和抑制惡性腫瘤在體內(nèi)生長。監(jiān)視和抑制惡性腫瘤在體內(nèi)生長。(1)(1)探針帶來探針帶來 細(xì)菌入侵細(xì)菌入侵(2)(2)吞噬細(xì)胞趕吞噬細(xì)胞趕 赴赴“現(xiàn)場現(xiàn)場”(3)(3)消滅入侵消滅入侵恢復(fù)健康恢復(fù)健康 機(jī)機(jī)體防御機(jī)制體防御機(jī)制人體第一道防線人體第一道防線天然免疫天然免疫(非特異性免非特異性免疫疫)屏障結(jié)構(gòu)、非特異性免

4、疫細(xì)胞和免疫分子組成。屏障結(jié)構(gòu)、非特異性免疫細(xì)胞和免疫分子組成。人體第二道防線人體第二道防線獲得性免疫獲得性免疫(特異性免特異性免疫疫)分類：分類：n體液免疫體液免疫 n細(xì)胞免疫細(xì)胞免疫 抗感染免疫的構(gòu)成因素抗感染免疫的構(gòu)成因素天然免疫與獲得性免疫的關(guān)系天然免疫與獲得性免疫的關(guān)系在抗感染免疫過程中，天然免疫與獲得性免疫相互依賴在抗感染免疫過程中，天然免疫與獲得性免疫相互依賴與協(xié)作，共同發(fā)揮消除病原微生物感染的作用與協(xié)作，共同發(fā)揮消除病原微生物感染的作用。吞噬細(xì)胞的吞噬和殺菌過程示意圖吞噬細(xì)胞的吞噬和殺菌過程示意圖第三節(jié)第三節(jié) 特異性免疫特異性免疫包括兩個基本內(nèi)容：包括兩個基本內(nèi)容：（1 1）免

5、疫原性：免疫原性：抗原刺激有機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反抗原刺激有機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反 應(yīng)的能力；應(yīng)的能力；（2 2）反應(yīng)原性：反應(yīng)原性：抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生 特異性結(jié)合反應(yīng)的能力；特異性結(jié)合反應(yīng)的能力；抗原性：抗原性：免疫原性和反應(yīng)原性的統(tǒng)稱。免疫原性和反應(yīng)原性的統(tǒng)稱。 三免疫分子及其在體液免疫中的作用三免疫分子及其在體液免疫中的作用、抗原與抗體簡介抗原與抗體簡介抗抗 原原(antigen) 定義：定義：凡是能刺激有機(jī)體凡是能刺激有機(jī)體( (人或人或動物體動物體) )產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生抗體， 并能與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性并能與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。結(jié)合的物質(zhì)。

6、(一一)、抗、抗 原原1 1、抗原的基本性質(zhì)、抗原的基本性質(zhì)（1 1）異物性）異物性 （2 2）大分子量）大分子量 （3 3）特異性）特異性 抗原刺激機(jī)體后只能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體并能與之結(jié)合。抗原刺激機(jī)體后只能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體并能與之結(jié)合。 特異性是由抗原表面的抗原決定基特異性是由抗原表面的抗原決定基( (簇簇) ) 決定的。決定的。 抗原決定基（表位）：抗原決定基（表位）：抗原分子中決定抗原特異性的基抗原分子中決定抗原特異性的基 本結(jié)構(gòu)或具有化學(xué)活性的基團(tuán)。本結(jié)構(gòu)或具有化學(xué)活性的基團(tuán)。 抗原決定基抗原決定基是與抗體特異性結(jié)合的基本單位。是與抗體特異性結(jié)合的基本單位。（4 4）化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜）化學(xué)結(jié)構(gòu)

7、復(fù)雜 免疫原性的形成還要求蛋白質(zhì)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜。極性基團(tuán)愈多或含支鏈氨基酸愈多，以及帶芳香族氨基酸多的蛋白質(zhì)抗原性愈強(qiáng)。 2、抗原的種類、抗原的種類按抗原性的完整與否及其在機(jī)體內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)，按抗原性的完整與否及其在機(jī)體內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)， 可分為完全抗原和不完全抗原。可分為完全抗原和不完全抗原。（1 1）完全抗原與不完全抗原）完全抗原與不完全抗原 完全抗原完全抗原 既有免疫原性又有反應(yīng)原性。即能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并既有免疫原性又有反應(yīng)原性。即能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并 與產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)或體外與產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)或體外( (試管內(nèi)試管內(nèi)) )發(fā)生反應(yīng)的抗原。發(fā)生反應(yīng)的抗原。 如細(xì)菌、病

8、毒、外毒素、血清白蛋白、花粉蛋白、 不完全抗原（半抗原）不完全抗原（半抗原） 只有反應(yīng)原性而沒有免疫原性。即不能單獨(dú)刺激機(jī)體產(chǎn)生只有反應(yīng)原性而沒有免疫原性。即不能單獨(dú)刺激機(jī)體產(chǎn)生 抗體，若與蛋白質(zhì)或膠體顆粒結(jié)合，形成大分子復(fù)合物成抗體，若與蛋白質(zhì)或膠體顆粒結(jié)合，形成大分子復(fù)合物成 為完全抗原，則可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。為完全抗原，則可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。 如各種低分子量的藥物、脂類和多糖等都屬于不完全抗原。（2 2）細(xì)菌抗原）細(xì)菌抗原菌體抗原菌體抗原 （O O抗原）抗原）在細(xì)胞壁上，主要抗原。主要成分為脂多糖。根據(jù)在細(xì)胞壁上，主要抗原。主要成分為脂多糖。根據(jù)O O抗原的抗原的組成不同進(jìn)行分群。組成不

9、同進(jìn)行分群。O O抗原抗原耐熱耐熱，121121，2h2h不被破壞。不被破壞。如沙門氏菌屬的O抗原不同分成67個血清群。 鞭毛抗原（鞭毛抗原（H H抗原）抗原）在鞭毛中，由蛋白質(zhì)組成，具有不同的種和型特異性，可作在鞭毛中，由蛋白質(zhì)組成，具有不同的種和型特異性，可作菌型鑒別。菌型鑒別。H H抗原不耐熱，抗原不耐熱，56568080，303040min40min即被破壞。即被破壞。在制備O抗原時(shí)常用煮沸法消除H抗原。2 2、抗原的種類、抗原的種類（2 2）細(xì)菌抗原）細(xì)菌抗原表面抗原（表面抗原）表面抗原（表面抗原）包圍在細(xì)菌細(xì)胞壁最外面，故稱。表面抗原隨菌種和結(jié)構(gòu)的包圍在細(xì)菌細(xì)胞壁最外面，故稱。表面

10、抗原隨菌種和結(jié)構(gòu)的不同可有不同的名稱。不同可有不同的名稱。如肺炎鏈球菌莢膜抗原；大腸桿菌、痢疾志賀氏菌 包膜抗原或K抗原，沙門氏菌屬Vi抗原等。菌毛抗原菌毛抗原 存在于菌毛中的抗原，也具有特異的抗原性。存在于菌毛中的抗原，也具有特異的抗原性。外毒素和類毒素外毒素和類毒素 細(xì)菌外毒素具有很強(qiáng)的抗原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗毒素抗體。細(xì)菌外毒素具有很強(qiáng)的抗原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗毒素抗體。外毒素經(jīng)外毒素經(jīng)0.3%0.3%0.4%0.4%甲醛溶液處理后使其失去毒性，但仍保持甲醛溶液處理后使其失去毒性，但仍保持抗原性，即成為類毒素?？乖?，即成為類毒素。2 2、抗原的種類、抗原的種類（2 2）細(xì)菌抗原）細(xì)菌抗

11、原(二二)、抗、抗 體體(antibody,Ab)定義：定義：抗原刺激有機(jī)體抗原刺激有機(jī)體( (人或動物人或動物) )所產(chǎn)生的具有特異性的免疫所產(chǎn)生的具有特異性的免疫球蛋白。球蛋白。抗體是由B細(xì)胞識別抗原后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的一類糖蛋白，能與相應(yīng)抗原表位結(jié)合，是介導(dǎo)體液免疫的重要免疫分子。分泌型分泌型(secreted Ig, ,sIg)：膜型膜型(membrane Ig, ,mlg)：在在血清血清和組織液中，和組織液中，占全部機(jī)體血清的占全部機(jī)體血清的20%25%。具有抗體的各種免疫功能具有抗體的各種免疫功能是是B細(xì)胞表面的抗原受體。細(xì)胞表面的抗原受體。含有免疫球蛋白的血清，稱為含有免疫

12、球蛋白的血清，稱為免疫血清或抗血清。免疫血清或抗血清。(二二)、抗、抗 體體1 1、抗體的性質(zhì)、抗體的性質(zhì)（1 1）免疫球蛋白是一種糖蛋白，具有蛋白質(zhì)的通性。）免疫球蛋白是一種糖蛋白，具有蛋白質(zhì)的通性。 凡能破壞球蛋白的各種理化因素均能使之滅活；能被多 種蛋白水解酶裂解；可以在乙醇、三氯醋酸或中性鹽類 中沉淀，生產(chǎn)上常用50%飽和硫酸銨或硫酸鈉從免疫血 清中提取抗體球蛋白。（2 2）在體外）在體外 ( (試管內(nèi)試管內(nèi)) )，抗體可與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)，抗體可與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié) 合并出現(xiàn)可見反應(yīng)；合并出現(xiàn)可見反應(yīng)； 在體內(nèi)，與其他防御機(jī)能協(xié)同作用下殺滅病原菌，起在體內(nèi)，與其他防御機(jī)能協(xié)

13、同作用下殺滅病原菌，起 到抗感染作用。到抗感染作用。但某些抗體在機(jī)體內(nèi)與相應(yīng)的抗原相遇時(shí)，能引起變態(tài)反應(yīng)變態(tài)反應(yīng)。如青霉素過敏等。（3 3）由不同細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體具有不均一性和結(jié)構(gòu)的）由不同細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體具有不均一性和結(jié)構(gòu)的 多樣性。多樣性。 例如將血清電泳時(shí)，免疫球蛋白主要分布于球蛋白區(qū)，因而曾稱抗體為球蛋白，也有少量延伸到區(qū)和2區(qū)。 抗體作為一種球蛋白，對異種動物又是很好抗原。因此抗體作為一種球蛋白，對異種動物又是很好抗原。因此, ,抗體抗體 即是抗體，又是抗原。利用此種特性可以制備抗免疫球蛋白即是抗體，又是抗原。利用此種特性可以制備抗免疫球蛋白 抗體抗體( (或稱抗抗體或稱抗抗體)

14、 )，用于熒光抗體技術(shù)中，用于熒光抗體技術(shù)中( (間接法間接法) )。1 1、抗體的性質(zhì)、抗體的性質(zhì)2 2、抗體的基本結(jié)構(gòu)、抗體的基本結(jié)構(gòu)兩條重鏈兩條重鏈(H(H鏈鏈) )兩條輕鏈兩條輕鏈(H(H鏈鏈) )440440個氨基酸殘基組成，分子量約個氨基酸殘基組成，分子量約505070kD70kD220220個氨基酸組成，分子量約個氨基酸組成，分子量約22.5kD22.5kD。二硫鍵二硫鍵(-SS-)(-SS-)根據(jù)重鏈的氨基酸順序同源程度的差異，可將根據(jù)重鏈的氨基酸順序同源程度的差異，可將IgIg分為類和亞分為類和亞類。人的免疫球蛋白共類。人的免疫球蛋白共5 5類：類：IgG IgG 、IgA

15、IgA 、Ig MIg M、IgDIgD和和IgEIgE2 2、抗體的基本結(jié)構(gòu)、抗體的基本結(jié)構(gòu)N N端端可變區(qū)可變區(qū)恒定區(qū)恒定區(qū)鍵間二硫鍵鍵間二硫鍵輕鏈輕鏈重鏈重鏈C C端端CDR區(qū)區(qū)識別抗原識別抗原構(gòu)架區(qū)構(gòu)架區(qū)2 2、抗體的基本結(jié)構(gòu)、抗體的基本結(jié)構(gòu)免疫抗體免疫抗體3 3、抗體的種、抗體的種類類 （1 1）根據(jù)抗體獲得方式分類）根據(jù)抗體獲得方式分類天然抗體天然抗體自身抗體自身抗體（2 2）根據(jù)抗體作用對象分類）根據(jù)抗體作用對象分類抗菌性抗體抗菌性抗體抗毒性抗體抗毒性抗體抗病毒性抗體抗病毒性抗體過敏性抗體過敏性抗體動物患傳染病后或經(jīng)人工注射疫苗后產(chǎn)生動物先天就有的抗體，可以遺傳給后代 機(jī)體對自身

16、組織成分產(chǎn)生的抗體 細(xì)菌或內(nèi)毒素刺激機(jī)體所產(chǎn)生的抗體 細(xì)菌外毒素刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體 病毒刺激機(jī)體而產(chǎn)生的抗體，阻止病毒侵害異種動物血清進(jìn)入機(jī)體后所產(chǎn)生的使動物發(fā)生過敏反應(yīng)的抗體 4 4、人工制備抗體、人工制備抗體（1 1）多克隆抗體）多克隆抗體( (polyclonal antibody，PoAb) ) 定義：定義： 將抗原免疫動物，刺激動物體內(nèi)多個將抗原免疫動物，刺激動物體內(nèi)多個B B細(xì)胞克隆產(chǎn)生細(xì)胞克隆產(chǎn)生 的抗體，是針對多種抗原決定基的混合抗體。的抗體，是針對多種抗原決定基的混合抗體。特點(diǎn)：特點(diǎn)： 來源廣泛、制備容易，但不易大量制備；來源廣泛、制備容易，但不易大量制備； 特異性不高，常出

17、現(xiàn)交叉反應(yīng)；特異性不高，常出現(xiàn)交叉反應(yīng)；評價(jià)：評價(jià)：應(yīng)用受到限制。應(yīng)用受到限制。4 4、人工制備抗體、人工制備抗體（2 2）單克隆抗體單克隆抗體(monoclonal antibody(monoclonal antibody，McAbMcAb) ) 原理原理: : 淋巴細(xì)胞增殖分化的漿細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖分化的漿細(xì)胞 ( (來自脾臟，有抗原特異性來自脾臟，有抗原特異性, ,能產(chǎn)生抗體，但短壽能產(chǎn)生抗體，但短壽) ) 骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞 ( (無抗原特異性，但長壽，能在體外無限繁殖無抗原特異性，但長壽，能在體外無限繁殖) ) 利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合， 獲

18、得既能在體外培養(yǎng)又能產(chǎn)生單一抗體的雜交瘤細(xì)胞。獲得既能在體外培養(yǎng)又能產(chǎn)生單一抗體的雜交瘤細(xì)胞。特點(diǎn)：特點(diǎn)：純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、無或少血清交叉反應(yīng)，純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、無或少血清交叉反應(yīng)， 制備成本低等特性。制備成本低等特性。 已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。 4 4、人工制備抗體、人工制備抗體單克隆抗體制備示意圖單克隆抗體制備示意圖單克隆抗體制作過程單克隆抗體制作過程4 4、人工制備抗體、人工制備抗體（2 2）單克隆抗體）單克隆抗體(monoclonal antibody(monoclonal antibody，McAbMcAb) ) 應(yīng)用：

19、應(yīng)用：已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。 對微生物病原體的鑒定。對微生物病原體的鑒定。 特異性抗原或特異性抗原或腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的檢測和鑒定。腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的檢測和鑒定。 疾病的被動免疫治療和生物導(dǎo)向藥物的制備。疾病的被動免疫治療和生物導(dǎo)向藥物的制備。 檢測血液中的藥物含量。檢測血液中的藥物含量。 分離某些昂貴的生物活性物質(zhì)。分離某些昂貴的生物活性物質(zhì)。 4 4、人工制備抗體、人工制備抗體（3 3）基因工程抗體）基因工程抗體（重組抗體）重組抗體） 在基因水平上對在基因水平上對IgIg分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，重新組裝成的分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，重新組裝成的

20、新型抗體分子。新型抗體分子。特點(diǎn)：特點(diǎn)：保留天然抗體的特異性和主要生物學(xué)活性，去除或減少保留天然抗體的特異性和主要生物學(xué)活性，去除或減少 了無關(guān)結(jié)構(gòu)，并可賦予抗體分子以新的生物學(xué)活性。了無關(guān)結(jié)構(gòu)，并可賦予抗體分子以新的生物學(xué)活性。迄今已成功構(gòu)建多種基因工程抗體，如人-鼠嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體(ScFv)、雙特異性抗體(BsAb)及噬菌體抗體等。 一一. . 抗原與抗體反應(yīng)的一般規(guī)律抗原與抗體反應(yīng)的一般規(guī)律抗原抗體反應(yīng)：抗原抗體反應(yīng)：抗原與相應(yīng)抗體之間在體內(nèi)或體外所發(fā)生的抗原與相應(yīng)抗體之間在體內(nèi)或體外所發(fā)生的 特異性結(jié)合反應(yīng)。特異性結(jié)合反應(yīng)。體內(nèi)反應(yīng)體內(nèi)反應(yīng)：介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒

21、素等作用；：介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應(yīng)體外反應(yīng)：根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應(yīng)的：根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應(yīng)的 介質(zhì)不同，可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)介質(zhì)不同，可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié) 合反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。合反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多用血清作因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多用血清作試驗(yàn)，故體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為試驗(yàn)，故體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清學(xué)反應(yīng)。血清學(xué)反應(yīng)。第四節(jié)第四節(jié) 免疫學(xué)方法及其應(yīng)用免疫學(xué)方法及其應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)的一般特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)的一般

22、特點(diǎn)1.1.特異性與交叉性特異性與交叉性 特異性：一種抗原只能與它相應(yīng)的抗體結(jié)合。特異性：一種抗原只能與它相應(yīng)的抗體結(jié)合。交叉性：兩種不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、交叉性：兩種不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、 抗體間構(gòu)型部分相同，就可出現(xiàn)交叉反應(yīng)?？贵w間構(gòu)型部分相同，就可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2.2.可逆性可逆性 抗體與抗原的結(jié)合是分子表面的一種物理結(jié)合即非共價(jià)鍵的結(jié)抗體與抗原的結(jié)合是分子表面的一種物理結(jié)合即非共價(jià)鍵的結(jié)合，在一定條件下可以發(fā)生解離。分開后，二者的性質(zhì)不變。合，在一定條件下可以發(fā)生解離。分開后，二者的性質(zhì)不變。3.3.定比性定比性 抗原物質(zhì)是多價(jià)的；抗體是雙價(jià)的。

23、抗原物質(zhì)是多價(jià)的；抗體是雙價(jià)的。抗原抗體的結(jié)合是抗原抗原抗體的結(jié)合是抗原抗體抗體抗原抗原抗體這樣順次結(jié)合，只抗體這樣順次結(jié)合，只有有當(dāng)兩者比例合適時(shí)，聚集成較大的復(fù)合物才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。當(dāng)兩者比例合適時(shí)，聚集成較大的復(fù)合物才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。抗原抗體反應(yīng)的一般特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)的一般特點(diǎn)3.3.定比性定比性圖圖7-4 7-4 沉淀反應(yīng)的沉淀反應(yīng)的曲線每一個每一個Y Y字形的字形的IgIg單單體分子能結(jié)合體分子能結(jié)合2 2個抗個抗原表位，稱之為兩原表位，稱之為兩價(jià)；價(jià)； 分泌型分泌型IgAIgA為為4 4價(jià)；五聚體價(jià)；五聚體IgMIgM理論理論上為上為1010價(jià)，但由于價(jià)，但由于立體構(gòu)型立體構(gòu)型 的

24、空間阻的空間阻位，一般只能結(jié)合位，一般只能結(jié)合5 5個抗原表位。個抗原表位。抗原抗體反應(yīng)的一般特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)的一般特點(diǎn)4.4.階段性階段性 第一階段：發(fā)生特異性反應(yīng)，特點(diǎn)是反應(yīng)快，不被肉眼所見。第一階段：發(fā)生特異性反應(yīng)，特點(diǎn)是反應(yīng)快，不被肉眼所見。第二階段：可見階段，是非特異性的。反應(yīng)較慢，受到電解第二階段：可見階段，是非特異性的。反應(yīng)較慢，受到電解 質(zhì)、質(zhì)、pHpH值和溫度的影響。值和溫度的影響。5.5.敏感性敏感性 高度的敏感性，用于定性，還可用于定量和定位。高度的敏感性，用于定性，還可用于定量和定位。影響抗原抗體反應(yīng)的因素影響抗原抗體反應(yīng)的因素1.1.電解質(zhì)電解質(zhì)4.4.雜質(zhì)異物雜質(zhì)異

25、物0.850.85的的NaClNaCl生理鹽水生理鹽水2.2.溫度溫度 37 37水浴水浴3.pH3.pH值值多數(shù)血清學(xué)反應(yīng)的適宜多數(shù)血清學(xué)反應(yīng)的適宜pHpH值為值為6 68 8二、抗原二、抗原、抗體間的主要反應(yīng)抗體間的主要反應(yīng)1 1、凝集反應(yīng)、凝集反應(yīng)2 2、沉淀反應(yīng)、沉淀反應(yīng)3 3、免疫電泳、免疫電泳4 4、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 三、主要抗原抗體反應(yīng)三、主要抗原抗體反應(yīng)( (一一) )、凝集反應(yīng)、凝集反應(yīng) 定義：定義：顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體在有電解質(zhì)合適條件下反應(yīng)顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體在有電解質(zhì)合適條件下反應(yīng) 并出現(xiàn)肉眼可見的凝集團(tuán)現(xiàn)象。（并出現(xiàn)肉眼可見的凝集團(tuán)現(xiàn)象。（凝集原，凝集素

26、） 一般稀釋抗體一般稀釋抗體( (抗血清抗血清) )，使其與抗原有一合適比例。，使其與抗原有一合適比例。1 1 直接凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng) 玻片法玻片法 定性試驗(yàn)。用已知抗體檢測未知抗原。定性試驗(yàn)。用已知抗體檢測未知抗原。 用途：鑒定菌種，菌種分型，測定ABO血型等。 試管法試管法 定量試驗(yàn)。用已知抗原測定血清中抗體有無及相對含量定量試驗(yàn)。用已知抗原測定血清中抗體有無及相對含量 發(fā)生明顯凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度（抗體效價(jià)，滴度發(fā)生明顯凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度（抗體效價(jià)，滴度 ) )，以表示血清中抗體的相對含量。，以表示血清中抗體的相對含量。 用途：測定患傳染病的人或家畜血清中的抗體，診斷三、主要

27、抗原抗體反應(yīng)三、主要抗原抗體反應(yīng)2. 2. 間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)定義：定義：利用某些與免疫無關(guān)的均一的小顆粒物質(zhì)作為載體，利用某些與免疫無關(guān)的均一的小顆粒物質(zhì)作為載體， 將可溶性抗原將可溶性抗原( (或抗體或抗體) )吸附于表面，如與相應(yīng)的抗體吸附于表面，如與相應(yīng)的抗體 ( (或抗原或抗原) )結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，發(fā)生結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，發(fā)生 凝集現(xiàn)象。凝集現(xiàn)象。表面吸附抗原表面吸附抗原( (或抗體或抗體) )的載體微球稱為免疫微球。的載體微球稱為免疫微球。特點(diǎn)：特點(diǎn)：增大體積，敏感，可檢測極微量抗原。增大體積，敏感，可檢測極微量抗原。根據(jù)所用載體不同，常用的間

28、接凝集反應(yīng)有間接血球凝集反根據(jù)所用載體不同，常用的間接凝集反應(yīng)有間接血球凝集反應(yīng)，碳凝集反應(yīng)，乳膠凝集反應(yīng)等。還有間接凝集抑制反應(yīng)，應(yīng)，碳凝集反應(yīng)，乳膠凝集反應(yīng)等。還有間接凝集抑制反應(yīng)，三、主要抗原抗體反應(yīng)三、主要抗原抗體反應(yīng)( (二二) )、沉淀反應(yīng)、沉淀反應(yīng) 定義：定義：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在條可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在條 件下，形成肉眼可見的沉淀物。（件下，形成肉眼可見的沉淀物。（沉淀原，沉淀素） 凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)的區(qū)別：凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)的區(qū)別： 凝集反應(yīng)的抗原是顆粒性抗原，總表面積小，做抗體稀釋。凝集反應(yīng)的抗原是顆粒性抗原，總表面積小，做抗體

29、稀釋。 沉淀反應(yīng)的抗原是可溶性的膠體溶液，單位面積抗原多，需沉淀反應(yīng)的抗原是可溶性的膠體溶液，單位面積抗原多，需 抗體量多，抗原稀釋。抗體量多，抗原稀釋。 以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。 類型：類型：環(huán)狀法、絮狀法和瓊脂擴(kuò)散法（單向和雙向）。環(huán)狀法、絮狀法和瓊脂擴(kuò)散法（單向和雙向）。三、主要抗原抗體反應(yīng)三、主要抗原抗體反應(yīng)圖圖7-5 7-5 瓊脂雙向擴(kuò)散的幾種不同方式結(jié)果示意圖瓊脂雙向擴(kuò)散的幾種不同方式結(jié)果示意圖 3 3、免疫電泳、免疫電泳 將瓊脂擴(kuò)散和電泳技術(shù)相結(jié)合的血清學(xué)檢驗(yàn)方法。將瓊脂擴(kuò)散和電泳技術(shù)相結(jié)合的血清學(xué)檢驗(yàn)方法。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：特異性強(qiáng)、很高的

30、靈敏性和分辨力。特異性強(qiáng)、很高的靈敏性和分辨力。 用途：用途：分析抗原或抗體純度。分析抗原或抗體純度。 類型：類型：對流免疫電泳、火箭電泳、雙向免疫電泳、瓊脂免疫對流免疫電泳、火箭電泳、雙向免疫電泳、瓊脂免疫 電泳。電泳。（1 1）對流免疫電泳）對流免疫電泳 這是一種將雙向擴(kuò)散與電泳技術(shù)結(jié)合而成的方法。這是一種將雙向擴(kuò)散與電泳技術(shù)結(jié)合而成的方法。 原理：原理：抗原與抗體分別置于凝膠板電場負(fù)、正極附近的小孔抗原與抗體分別置于凝膠板電場負(fù)、正極附近的小孔 中，通電后，抗原向正極移動，而抗體則向負(fù)極移動中，通電后，抗原向正極移動，而抗體則向負(fù)極移動 ，結(jié)果在兩孔間合適的抗原、抗體濃度處會形成一條，結(jié)

31、果在兩孔間合適的抗原、抗體濃度處會形成一條 沉淀線。沉淀線。 乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和甲種胎兒蛋白(AFP)等的檢測。3 3、免疫電泳、免疫電泳（2 2）火箭免疫電泳）火箭免疫電泳定義：定義：抗原在含定量抗抗原在含定量抗體的瓊脂中向一個方向體的瓊脂中向一個方向泳動，兩者比例合適時(shí)泳動，兩者比例合適時(shí)，在較短時(shí)間內(nèi)生成如，在較短時(shí)間內(nèi)生成如火箭狀或錐狀的沉淀火箭狀或錐狀的沉淀線。線。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。圖圖7-6 7-6 火箭電泳結(jié)果示意圖火箭電泳結(jié)果示意圖（3 3）雙向免疫電泳）雙向免疫電泳這是一種將火箭電泳與

32、血清免疫電泳相結(jié)合的方法這是一種將火箭電泳與血清免疫電泳相結(jié)合的方法定義：定義：先將血清用電泳分離出各成分，然后切下凝膠板轉(zhuǎn)移先將血清用電泳分離出各成分，然后切下凝膠板轉(zhuǎn)移 至另一已加有抗血清的凝膠上，進(jìn)入垂直方向的第二至另一已加有抗血清的凝膠上，進(jìn)入垂直方向的第二 次電泳，形成呈連續(xù)火箭樣的沉淀線。次電泳，形成呈連續(xù)火箭樣的沉淀線。 圖圖7-7 7-7 雙向免疫電泳示意圖雙向免疫電泳示意圖 3 3、免疫電泳、免疫電泳（4 4）瓊脂免疫電泳）瓊脂免疫電泳先進(jìn)行瓊脂平板電泳再做雙向瓊脂先進(jìn)行瓊脂平板電泳再做雙向瓊脂擴(kuò)散的血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。擴(kuò)散的血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。定義：定義：先將抗原樣品在瓊脂凝膠中電

33、先將抗原樣品在瓊脂凝膠中電泳，不同抗原成分因其遷移率的不同泳，不同抗原成分因其遷移率的不同而分離成區(qū)帶，挖一條平行的抗體槽，而分離成區(qū)帶，挖一條平行的抗體槽，加入抗血清做雙向擴(kuò)散，在兩者比例加入抗血清做雙向擴(kuò)散，在兩者比例適合處形成可見的弧形沉淀線。適合處形成可見的弧形沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，即根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，即可分析樣品中所含的抗原成分和含量。可分析樣品中所含的抗原成分和含量。瓊脂免疫電泳示意圖(三三)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)定義：定義：有補(bǔ)體參與，并以綿羊紅血球和溶血素有補(bǔ)體參與，并以綿羊紅血球和溶血素( (紅細(xì)胞的紅細(xì)胞的 特異抗體特異抗體) )是否發(fā)生溶

34、血反應(yīng)作指示的一種高靈敏是否發(fā)生溶血反應(yīng)作指示的一種高靈敏 度的抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)。度的抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)。原理：原理：補(bǔ)體沒有特異性，可與任何抗原抗體復(fù)合物發(fā)生結(jié)補(bǔ)體沒有特異性，可與任何抗原抗體復(fù)合物發(fā)生結(jié) 合合( (即不能與單獨(dú)的抗原或抗體結(jié)合即不能與單獨(dú)的抗原或抗體結(jié)合) )，一旦結(jié)合后，一旦結(jié)合后 并不再游離，但不能顯示肉眼可見現(xiàn)象。并不再游離，但不能顯示肉眼可見現(xiàn)象。通常應(yīng)用通常應(yīng)用溶血系統(tǒng)作為指示劑溶血系統(tǒng)作為指示劑，以判定補(bǔ)體是否已被抗原抗，以判定補(bǔ)體是否已被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。游離補(bǔ)體，就會出現(xiàn)肉眼可見的溶血反應(yīng)。體復(fù)合物結(jié)合。游離補(bǔ)體，就會出現(xiàn)肉眼可見的溶血反應(yīng)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

35、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)有抗原、抗體、補(bǔ)體、紅血球、溶血素有抗原、抗體、補(bǔ)體、紅血球、溶血素5 5種種成分參加，并分屬于反應(yīng)系統(tǒng)和指示系統(tǒng)。成分參加，并分屬于反應(yīng)系統(tǒng)和指示系統(tǒng)。4 4、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 圖圖7-9 7-9 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)示意圖補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)示意圖 4 4、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（1 1）反應(yīng)系統(tǒng)）反應(yīng)系統(tǒng)( (試驗(yàn)系統(tǒng)、結(jié)合系統(tǒng)試驗(yàn)系統(tǒng)、結(jié)合系統(tǒng)) ) 由已知抗原由已知抗原( (或抗體或抗體) )、被檢抗體、被檢抗體( (或抗原或抗原) )和補(bǔ)體組成。和補(bǔ)體組成。先加入抗原、抗體，再加入補(bǔ)體，混合后作用一定時(shí)間。先加入抗原、抗體，再加入補(bǔ)體，混合后作用一定時(shí)間。如果抗原和抗體相

36、對應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，則補(bǔ)體就被如果抗原和抗體相對應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，則補(bǔ)體就被結(jié)合，否則即為游離狀態(tài)。結(jié)合，否則即為游離狀態(tài)。（2 2）指示系統(tǒng)）指示系統(tǒng)( (溶血系統(tǒng)溶血系統(tǒng)) )由紅血球由紅血球( (抗原抗原) )和溶血素和溶血素( (抗體抗體) )組成。組成。在反應(yīng)系統(tǒng)完畢后，再向試管內(nèi)加入綿羊紅血球和溶血素。在反應(yīng)系統(tǒng)完畢后，再向試管內(nèi)加入綿羊紅血球和溶血素。不發(fā)生溶血：不發(fā)生溶血：補(bǔ)體被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，陽性反應(yīng)。補(bǔ)體被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，陽性反應(yīng)。發(fā)生溶血：發(fā)生溶血： 液體中的抗原抗體不相對應(yīng)，沒有發(fā)生結(jié)合，液體中的抗原抗體不相對應(yīng)，沒有發(fā)生結(jié)合， 補(bǔ)體依然游離存在，反

37、應(yīng)陰性。補(bǔ)體依然游離存在，反應(yīng)陰性。三、免疫標(biāo)記技術(shù)三、免疫標(biāo)記技術(shù)現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)包括免疫標(biāo)記技術(shù)、免疫定位分析、免疫親現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)包括免疫標(biāo)記技術(shù)、免疫定位分析、免疫親和層析和免疫生物傳感器技術(shù)等，其中尤以免疫標(biāo)記技術(shù)發(fā)和層析和免疫生物傳感器技術(shù)等，其中尤以免疫標(biāo)記技術(shù)發(fā)展最快，應(yīng)用最廣。展最快，應(yīng)用最廣。免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)：將某些小分子物質(zhì)作為標(biāo)記劑（如熒光素、：將某些小分子物質(zhì)作為標(biāo)記劑（如熒光素、酶、放射性同位素或電子致密物質(zhì)等）結(jié)合到抗原或抗體上酶、放射性同位素或電子致密物質(zhì)等）結(jié)合到抗原或抗體上，不，不 抗原抗體反應(yīng)，更容易觀察，提高檢測的靈敏度?？乖贵w反應(yīng)，更容易觀察，

38、提高檢測的靈敏度。標(biāo)記劑：與抗原或抗體結(jié)合的小分子物質(zhì)。標(biāo)記劑：與抗原或抗體結(jié)合的小分子物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，反應(yīng)速度快，容特異性強(qiáng)，靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，反應(yīng)速度快，容 易觀察；易觀察； 既可用于定性、定量分析，又可用于分子定位等工作既可用于定性、定量分析，又可用于分子定位等工作 現(xiàn)代免疫技術(shù)現(xiàn)代免疫技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)1 1、免疫熒光技術(shù)、免疫熒光技術(shù)2 2、免疫酶技術(shù)、免疫酶技術(shù)3 3、放射免疫測定法、放射免疫測定法4 4、免疫電鏡技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)定義：定義：一種將結(jié)合有熒光素的熒光抗體與抗原反應(yīng)，以提高一種將結(jié)合有熒光素的熒光抗體與抗原反應(yīng)，以提高

39、 免疫反應(yīng)靈敏度和適合顯微鏡觀察的免疫標(biāo)記技術(shù)。免疫反應(yīng)靈敏度和適合顯微鏡觀察的免疫標(biāo)記技術(shù)。熒光素濃度在熒光素濃度在1010-8-8時(shí)，仍可受激發(fā)而射出肉眼可見的熒光。時(shí)，仍可受激發(fā)而射出肉眼可見的熒光。原理：原理：在一定條件下以化學(xué)方法將熒光素與抗體結(jié)合，制成在一定條件下以化學(xué)方法將熒光素與抗體結(jié)合，制成 熒光素抗體，但不影響抗體的免疫活性。如果標(biāo)本中熒光素抗體，但不影響抗體的免疫活性。如果標(biāo)本中 的抗原與熒光素抗體結(jié)合著染后，在熒光顯微鏡下成的抗原與熒光素抗體結(jié)合著染后，在熒光顯微鏡下成 為發(fā)出熒光的可見物體，即可達(dá)到檢出抗原的目的。為發(fā)出熒光的可見物體，即可達(dá)到檢出抗原的目的。常用的熒

40、光素有異硫氰酸熒光素常用的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)(FITC)和羅丹明和羅丹明(RB200)(RB200)，在藍(lán)紫光激發(fā)下，分別發(fā)出鮮明的綠色熒光和橙黃色熒光。在藍(lán)紫光激發(fā)下，分別發(fā)出鮮明的綠色熒光和橙黃色熒光?；痉椒ǎ夯痉椒ǎ褐苯臃ǎg接法、補(bǔ)體結(jié)合法和標(biāo)記法。直接法，間接法、補(bǔ)體結(jié)合法和標(biāo)記法。 (一一)、免疫熒光技術(shù)、免疫熒光技術(shù)（熒光抗體法）熒光抗體法）( (一一) )、免疫熒光技術(shù)、免疫熒光技術(shù)（熒光抗體法）（熒光抗體法）（1 1）直接法）直接法（2 2）間接法）間接法（3 3）補(bǔ)體結(jié)合法）補(bǔ)體結(jié)合法（4 4）標(biāo)記法）標(biāo)記法圖圖7-10 7-10 免疫熒光抗體法原理示意

41、圖免疫熒光抗體法原理示意圖直接免疫熒光法直接免疫熒光法間接接免疫熒光法間接接免疫熒光法 免疫熒光技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的血清學(xué)檢驗(yàn)方法。免疫熒光技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的血清學(xué)檢驗(yàn)方法。 一種酶作標(biāo)記的抗體或抗抗體的一種酶作標(biāo)記的抗體或抗抗體的高靈敏度高靈敏度的免疫標(biāo)記技術(shù)。的免疫標(biāo)記技術(shù)。原理：原理：利用酶與抗原或抗體結(jié)合后，既不改變抗原或抗體的利用酶與抗原或抗體結(jié)合后，既不改變抗原或抗體的 疫學(xué)反應(yīng)特異性，也不影響酶本身的活性，在特異抗疫學(xué)反應(yīng)特異性，也不影響酶本身的活性，在特異抗 原抗體反應(yīng)后，于相應(yīng)而合適的酶底物作用下，產(chǎn)生原抗體反應(yīng)后，于相應(yīng)而合適的酶底物作用下，產(chǎn)生 可見的不溶性可見的不溶性

42、有色產(chǎn)物有色產(chǎn)物。與免疫熒光技術(shù)區(qū)別：與免疫熒光技術(shù)區(qū)別：有色的沉淀物可在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞水平的抗原追蹤，有色的沉淀物可在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞水平的抗原追蹤，也可在電子顯微鏡下進(jìn)行分子水平的觀察，又能用分光光度也可在電子顯微鏡下進(jìn)行分子水平的觀察，又能用分光光度計(jì)定量測定酶作用底物分解的量。計(jì)定量測定酶作用底物分解的量。( (二二) )、免疫酶技術(shù)、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）（酶免疫測定技術(shù)）目前常用辣根過氧化物酶目前常用辣根過氧化物酶(HRP)(HRP)，也有用堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，也有用堿性磷酸酶標(biāo)記抗體( (二二) )、免疫酶技術(shù)、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）（酶免疫測定技術(shù)）1.1

43、.酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法( (enzyme linked immunosorbant assay， ELISAELISA，酶標(biāo)法，酶標(biāo)法) ) ELISA ELISA 是目前應(yīng)用最廣泛的生物學(xué)技術(shù)之一。是目前應(yīng)用最廣泛的生物學(xué)技術(shù)之一。 原理：原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持免疫活性。使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo) 抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性?？乖蚩贵w既保留其免疫活性，又保留酶的活性。ELISAELISA試驗(yàn)中需要有試驗(yàn)中需要有3 3

44、種試劑：種試劑：固相的抗原或抗體。固相的抗原或抗體。 目前多用聚苯乙烯酶標(biāo)板目前多用聚苯乙烯酶標(biāo)板( (微量滴定板微量滴定板) )作為固相載體作為固相載體酶標(biāo)記的抗原或抗體。酶標(biāo)記的抗原或抗體。酶作用的底物。酶作用的底物。抗原捕獲抗原捕獲ELISAELISA1 1、把抗體固定在、把抗體固定在固相支持物上固相支持物上（9696孔板）；孔板）；2 2、加入蛋白質(zhì)樣、加入蛋白質(zhì)樣品保溫，再洗去品保溫，再洗去未結(jié)合的雜蛋白；未結(jié)合的雜蛋白；3 3、加入第二抗體，、加入第二抗體，第二抗體結(jié)合一第二抗體結(jié)合一個供檢測用的酶個供檢測用的酶（辣根過氧化物（辣根過氧化物酶）酶）4 4、洗去未結(jié)合第、洗去未結(jié)合第

45、二抗原，酶活測二抗原，酶活測定。定。ELISA for HIV antibodyMicroplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity( (二二) )、免疫酶技術(shù)、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）（酶免疫測定技術(shù)）1. 1. 酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，特異性強(qiáng)。靈敏度高，特異性強(qiáng)。酶標(biāo)抗體制備容易，且高度穩(wěn)定而有效期長。酶標(biāo)抗體制備容易，且高度穩(wěn)定而有效期長。操作簡便操作簡便應(yīng)用范圍廣泛。應(yīng)用范圍廣泛。 ELISA技術(shù)用于檢測多種病原菌抗原或抗體、血液及其 他體液中微量蛋白成分、細(xì)胞因子等。

46、 在食品加工領(lǐng)域，ELISA技術(shù)可用于測定蛋白質(zhì)，也可 用于測定各種生物活性成分，如異黃酮半抗原。在食品安全方面，用于檢測食品中農(nóng)藥殘留，以及檢測食品中的病原菌及其毒素，如沙門氏菌及其內(nèi)毒素和腸毒素、大腸桿菌及其腸毒素和腸細(xì)胞出血毒素、金黃色葡萄球菌及其腸毒素、霉菌和真菌毒素。1. 1. 酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法ELISAELISA方法：方法：將可溶性抗體或抗原吸附到聚苯乙烯等固相載體將可溶性抗體或抗原吸附到聚苯乙烯等固相載體 上，再滴加酶標(biāo)記的抗原或抗體，然后添加底物上，再滴加酶標(biāo)記的抗原或抗體，然后添加底物 ，進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，以酶標(biāo)儀測定。，進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，以酶標(biāo)儀測定。 雙抗體夾心法

47、雙抗體夾心法 本法用于檢測抗原。本法用于檢測抗原。圖圖7-11 7-11 雙抗體夾心法測抗原示意圖雙抗體夾心法測抗原示意圖 標(biāo)本標(biāo)本（含抗體）（含抗體）酶標(biāo)酶標(biāo)抗體抗體 底物底物 固相抗體固相抗體1.1.酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法間接法間接法 圖圖7-11 7-11 間接法測抗原示意圖間接法測抗原示意圖 標(biāo)本標(biāo)本（含抗體）（含抗體）酶標(biāo)酶標(biāo)抗體抗體 底物底物 固相抗原固相抗原1. 1. 酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法斑點(diǎn)酶免疫吸附法斑點(diǎn)酶免疫吸附法 (dot-ELISA) (dot-ELISA) 本法原理與上述兩法相同，方法上的不同之處是：本法原理與上述兩法相同，方法上的不同之處是：A A 用

48、硝酸纖維薄膜取代上述微量滴定板；用硝酸纖維薄膜取代上述微量滴定板；B B 最終顯色反應(yīng)是不溶于水的有色沉淀物，最終顯色反應(yīng)是不溶于水的有色沉淀物，例如，堿性磷酸酶的底物不能用對硝基酚磷酸鹽，而要用氮藍(lán)四唑(NBT)等。最終可從薄膜上沉淀物顏色的有無或多少確定結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高靈敏度高( (比普通比普通ELISAELISA高高1010100100倍倍) )，與放射免疫測定相當(dāng)。，與放射免疫測定相當(dāng)。1.1.酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法生物素生物素- -親和素系統(tǒng)（親和素系統(tǒng)（BAS)BAS)在在ELISAELISA中的應(yīng)用中的應(yīng)用 親和素親和素是存在于蛋清中的堿性糖蛋白，一個親和素分子由

49、是存在于蛋清中的堿性糖蛋白，一個親和素分子由4 4個亞個亞基組成，可與基組成，可與4 4個生物素分子穩(wěn)定結(jié)合；個生物素分子穩(wěn)定結(jié)合；生物素生物素是存在于蛋黃中的維生素是存在于蛋黃中的維生素H H，化學(xué)方法制成的生物素衍生，化學(xué)方法制成的生物素衍生物物生物素生物素- -羥基琥珀亞胺酯羥基琥珀亞胺酯(BNHS)(BNHS)可與蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原、可與蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原、抗體、酶、熒光素、核苷酸等結(jié)合形成生物素化的分子?？贵w、酶、熒光素、核苷酸等結(jié)合形成生物素化的分子。生物素與親和素結(jié)合具有高度親和力，且均能耦聯(lián)抗體、抗原生物素與親和素結(jié)合具有高度親和力，且均能耦聯(lián)抗體、抗原和辣根過氧化物酶而不影響其生

50、物學(xué)活性。和辣根過氧化物酶而不影響其生物學(xué)活性。1. 1. 酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法生物素生物素- -親和素系統(tǒng)（親和素系統(tǒng)（BAS)BAS)在在ELISAELISA中的應(yīng)用中的應(yīng)用 在生物素在生物素- -親和素系統(tǒng)中，借助所形成的親和素親和素系統(tǒng)中，借助所形成的親和素- -生物素酶復(fù)合生物素酶復(fù)合物，追蹤生物素標(biāo)記的抗原或抗體，通過酶催化底物顯色，可物，追蹤生物素標(biāo)記的抗原或抗體，通過酶催化底物顯色，可檢出相應(yīng)的抗體或抗原。檢出相應(yīng)的抗體或抗原。由于抗原或抗體分子可耦聯(lián)多個生物素，且由于抗原或抗體分子可耦聯(lián)多個生物素，且1 1個親和素分子可結(jié)個親和素分子可結(jié)合合4 4個生物素分子，可以連

51、接更多的生物素化的分子，形成一種個生物素分子，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。如此組成的新生物放大系統(tǒng)，進(jìn)一步提高類似晶格的復(fù)合體。如此組成的新生物放大系統(tǒng)，進(jìn)一步提高ELISAELISA檢測的靈敏度。檢測的靈敏度。BASBAS除用于抗原抗體檢測外，還可用于檢除用于抗原抗體檢測外，還可用于檢測測DNADNA和和RNARNA。1. 1. 酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法生物素生物素- -親和素系統(tǒng)（親和素系統(tǒng)（BAS)BAS)在在ELISAELISA中的應(yīng)用中的應(yīng)用 生物素生物素- -親和素系統(tǒng)在親和素系統(tǒng)在ELISAELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大?？梢栽诠滔嗌项A(yù)先包被親和素，包被，亦可用于終反應(yīng)放大?？梢栽诠滔嗌项A(yù)先包被親和素，再用吸附法包被固相的抗體或抗原，進(jìn)而再與生物素結(jié)合，通再用吸附法包被固相的抗體或抗原，進(jìn)而再與生物素結(jié)合，通過生物素過生物素- -親和素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗原固相化。這種親和素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗原固相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。此外，在常規(guī)暴露。此外，在常規(guī)ELIS