第02章 生物制品制備的一般步驟

1、第二章 生物制品制備的一般步驟本章主要內(nèi)容：本章主要內(nèi)容：1. 1. 生物制品制備的一般步驟生物制品制備的一般步驟2. 2. 蛋白類生物制品的分離純化方法蛋白類生物制品的分離純化方法3. 3. 核酸類生物制品的分離純化方法核酸類生物制品的分離純化方法4. 4. 基因工程類生物制品的制備方法基因工程類生物制品的制備方法第一節(jié)第一節(jié) 生物制品制備的一般步驟生物制品制備的一般步驟一、原材料的選擇和保存方法一、原材料的選擇和保存方法原材料：原材料： 人體、動物、植物、微生物及海洋生物的組織、分泌物，人體、動物、植物、微生物及海洋生物的組織、分泌物，以及工程細胞、細菌及人工處理（如免疫）或改造過的動、以

2、及工程細胞、細菌及人工處理（如免疫）或改造過的動、植物。植物。（一）原材料選擇依據(jù)和注意事項（一）原材料選擇依據(jù)和注意事項1. 來源豐富，取材方便，價格便宜。來源豐富，取材方便，價格便宜。2. 來源清楚，質(zhì)量穩(wěn)定可控，最好有質(zhì)量檢驗報告。來源清楚，質(zhì)量穩(wěn)定可控，最好有質(zhì)量檢驗報告。3. 目標成分含量高，且易于與其他成分分離。故應注意動物目標成分含量高，且易于與其他成分分離。故應注意動物 的年齡、性別、生理狀態(tài)，植物的生長時期（季節(jié)），微的年齡、性別、生理狀態(tài)，植物的生長時期（季節(jié)），微 生物的對數(shù)生長期等。生物的對數(shù)生長期等。4. 由于是生物材料，故必須保持新鮮，可現(xiàn)用現(xiàn)取，或低溫保由于是生物

3、材料，故必須保持新鮮，可現(xiàn)用現(xiàn)取，或低溫保存?zhèn)溆?，以防止腐敗、變質(zhì)及微生物污染。存?zhèn)溆?，以防止腐敗、變質(zhì)及微生物污染。 低溫保存時，應將非目標組織如動物組織中的結(jié)締組織、低溫保存時，應將非目標組織如動物組織中的結(jié)締組織、脂肪組織，細菌的培養(yǎng)基等盡可能去掉。脂肪組織，細菌的培養(yǎng)基等盡可能去掉。（二）原材料的保存方法（二）原材料的保存方法1.1.低溫保存。低溫保存。短時間保存可在短時間保存可在-20-20，欲長期保存，則應在，欲長期保存，則應在- - 80 80或液氮中。或液氮中。不得對含有活性成分的生物材料反復凍融！不得對含有活性成分的生物材料反復凍融！2.2.脫水保存。脫水保存。使用丙酮將原材

4、料中的水分脫去。適應于少量價使用丙酮將原材料中的水分脫去。適應于少量價 值昂貴的原材料的保存。應注意，有機溶劑不能對活性成分值昂貴的原材料的保存。應注意，有機溶劑不能對活性成分 有影響。有影響。3.3.防腐劑保鮮。防腐劑保鮮。適應于液體原材料，如發(fā)酵液、提取液等。常適應于液體原材料，如發(fā)酵液、提取液等。常 用防腐劑有乙醇、苯酚、甘油等。用防腐劑有乙醇、苯酚、甘油等。二、目的產(chǎn)物的提取純化二、目的產(chǎn)物的提取純化（一）組織細胞破碎（一）組織細胞破碎 常用的方法：常用的方法：組織勻漿法、反復凍融、超聲振蕩、酶解組織勻漿法、反復凍融、超聲振蕩、酶解法、高壓破碎、滲透壓法、研磨法、高壓破碎、滲透壓法、研

5、磨等。等。 目的：目的：將目標分子以可溶態(tài)充分暴露出來，并與其他成將目標分子以可溶態(tài)充分暴露出來，并與其他成分分開，便于后續(xù)的高效率純化。分分開，便于后續(xù)的高效率純化。（二）固液分離（二）固液分離 方法：方法：離心、離心、膜過濾、自然沉降。膜過濾、自然沉降。 目的：目的：將細胞碎片或未充分破碎的組織等雜質(zhì)去掉。將細胞碎片或未充分破碎的組織等雜質(zhì)去掉。（三）目的產(chǎn)物的分離純化（三）目的產(chǎn)物的分離純化 除去可溶性雜質(zhì)，同時富集目的產(chǎn)物的過程，稱之為分除去可溶性雜質(zhì)，同時富集目的產(chǎn)物的過程，稱之為分離純化。這是生物制品制備的核心。離純化。這是生物制品制備的核心。 方法：方法：沉淀技術(shù)、離心技術(shù)、過（

6、超）濾技術(shù)、層析技術(shù)、沉淀技術(shù)、離心技術(shù)、過（超）濾技術(shù)、層析技術(shù)、萃取技術(shù)、電泳技術(shù)萃取技術(shù)、電泳技術(shù)等，是生物制品制備的常用技術(shù)。等，是生物制品制備的常用技術(shù)。 但應注意，但應注意，生物分子千差萬別，生物分子千差萬別，不同的目的產(chǎn)物，由于其不同的目的產(chǎn)物，由于其物理、化學性質(zhì)不同，生物學特性迥異，因此沒有一個方法適物理、化學性質(zhì)不同，生物學特性迥異，因此沒有一個方法適合于任何生物制品的分離純化合于任何生物制品的分離純化 工藝：工藝：制備某種生物制品的一系列技術(shù)方法的有機集成，制備某種生物制品的一系列技術(shù)方法的有機集成，稱之為該生物制品的制備工藝。稱之為該生物制品的制備工藝。 同樣，同樣，沒

7、有一個工藝適合于所有生物制品的制備。有時，沒有一個工藝適合于所有生物制品的制備。有時，同一種生物制品，在不同的實驗室或車間也很難套用同一個生同一種生物制品，在不同的實驗室或車間也很難套用同一個生產(chǎn)工藝；不同的操作者，使用同一個生產(chǎn)工藝，也很難達到同產(chǎn)工藝；不同的操作者，使用同一個生產(chǎn)工藝，也很難達到同樣的生產(chǎn)效果。樣的生產(chǎn)效果。第二節(jié)第二節(jié) 蛋白類生物制品的分離純化方法蛋白類生物制品的分離純化方法主要內(nèi)容：主要內(nèi)容：一、蛋白質(zhì)的理化學性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的理化學性質(zhì)二、蛋白質(zhì)提取、純化的特點二、蛋白質(zhì)提取、純化的特點三、蛋白質(zhì)提取、純化前的準備三、蛋白質(zhì)提取、純化前的準備四、蛋白質(zhì)提取、純化的一般步

8、驟四、蛋白質(zhì)提取、純化的一般步驟五、重組五、重組蛋白質(zhì)提取、純化的一般步驟蛋白質(zhì)提取、純化的一般步驟一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)共有以下共有以下7個性質(zhì)：個性質(zhì)：1. 1. 蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點2. 2. 蛋白質(zhì)的呈色反應蛋白質(zhì)的呈色反應3. 3. 蛋白質(zhì)的紫外吸收蛋白質(zhì)的紫外吸收4. 4. 蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的分子量5. 5. 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)6. 6. 蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀7. 7. 蛋白質(zhì)的變性與復性蛋白質(zhì)的變性與復性 當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH值時，蛋白質(zhì)解離成正、值時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，凈

9、電荷為負離子的趨勢相等，凈電荷為“O”，此時溶液的，此時溶液的pH值值稱為該蛋白質(zhì)的等電點稱為該蛋白質(zhì)的等電點(isoelectric point, pI)。 蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)溶液的pH大于等電點，該蛋白質(zhì)顆粒帶負大于等電點，該蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷，反之則帶正電荷。電荷，反之則帶正電荷。 蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)決定了它在電場中移蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)決定了它在電場中移動的方向。處于等電點的蛋白質(zhì)顆粒，在電場中并不動的方向。處于等電點的蛋白質(zhì)顆粒，在電場中并不移動。移動。 人體體液中許多蛋白質(zhì)的等電點在人體體液中許多蛋白質(zhì)的等電點在pH5.0左右，所左右，所以在體液中以負離子形式存在。以在體

10、液中以負離子形式存在。（一）蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點（一）蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點（二）蛋白質(zhì)的呈色反應（二）蛋白質(zhì)的呈色反應 1. 茚三酮反應茚三酮反應(Ninhydrin Reaction) -氨基酸與水化茚三酮氨基酸與水化茚三酮(苯丙環(huán)三酮戊烴苯丙環(huán)三酮戊烴)作用時，產(chǎn)生藍色作用時，產(chǎn)生藍色反應。蛋白質(zhì)是由許多反應。蛋白質(zhì)是由許多-氨基酸組成的，故也呈此顏色反應。氨基酸組成的，故也呈此顏色反應。 2. 雙縮脲反應雙縮脲反應(Biuret Reaction) 蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現(xiàn)紫紅色，稱為雙縮脲蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現(xiàn)紫紅色，稱為雙縮脲反應。凡分子中含有兩個以上反

11、應。凡分子中含有兩個以上CONH鍵的化合物，都呈此鍵的化合物，都呈此反應。反應。 3. 米倫反應米倫反應(Millon Reaction) 蛋白質(zhì)溶液中加入米倫試劑蛋白質(zhì)溶液中加入米倫試劑(亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液合液)，蛋白質(zhì)首先沉淀，加熱則變?yōu)榧t色沉淀。，蛋白質(zhì)首先沉淀，加熱則變?yōu)榧t色沉淀。 此外，蛋白質(zhì)溶液還可與酚試劑、乙醛酸試劑、濃硝酸等發(fā)此外，蛋白質(zhì)溶液還可與酚試劑、乙醛酸試劑、濃硝酸等發(fā)生顏色反應。生顏色反應。 （三）蛋白質(zhì)的紫外吸收（三）蛋白質(zhì)的紫外吸收 因為蛋白質(zhì)中含有因為蛋白質(zhì)中含有Tyr、Phe、Trp等芳香氨基酸，其紫等芳香氨基酸，其紫外吸

12、收最大峰的波長為外吸收最大峰的波長為280nm。而且光吸收值（。而且光吸收值（OD值）與蛋值）與蛋白質(zhì)的濃度程正相關(guān)。白質(zhì)的濃度程正相關(guān)。 測定蛋白質(zhì)濃度的方法：標準曲線法和經(jīng)驗公式法。測定蛋白質(zhì)濃度的方法：標準曲線法和經(jīng)驗公式法。標準曲線法標準曲線法:經(jīng)驗公式法：經(jīng)驗公式法： 蛋白質(zhì)濃度（蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）= 1.45OD280-0.74OD260注意：注意：在使用該公式時，在使用該公式時，OD280 應在應在0.10.7之間，所測值才之間，所測值才 比較準確。比較準確。（四）蛋白質(zhì)的分子量（四）蛋白質(zhì)的分子量 蛋白質(zhì)分子大小通常用道爾頓（蛋白質(zhì)分子大小通常用道爾頓（Dalton，Da

13、）或千道爾頓）或千道爾頓（kDa）表示，一般在）表示，一般在6103106之間。之間。 測定蛋白質(zhì)的分子量有許多方法，常用的有測定蛋白質(zhì)的分子量有許多方法，常用的有SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝膠電泳（胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、凝膠過濾法等。這些方法的誤差）、凝膠過濾法等。這些方法的誤差為為5%10%。 Dalton: A unit of mass very nearly equal to that of a hydrogen atom. Named after John Dalton (17661844), who developed the atomic theory of matte

14、r.理論推算法：理論推算法：蛋白質(zhì)分子量（蛋白質(zhì)分子量（Da）= 氨基酸數(shù)目氨基酸數(shù)目110SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)分子量蛋白質(zhì)洗脫體積與分子量的關(guān)系蛋白質(zhì)洗脫體積與分子量的關(guān)系分子篩層析示意圖分子篩層析示意圖 凝膠過濾法：凝膠過濾法： 又稱分子篩層析法又稱分子篩層析法 將幾種已知分子量的蛋白質(zhì)混合溶液上柱洗脫，記錄各種蛋白質(zhì)的洗脫將幾種已知分子量的蛋白質(zhì)混合溶液上柱洗脫，記錄各種蛋白質(zhì)的洗脫體積。以分子量的對數(shù)為縱坐標，以洗脫體積為橫坐標，作標準曲線。體積。以分子量的對數(shù)為縱坐標，以洗脫體積為橫坐標，作標準曲線。待測蛋白質(zhì)溶液在上述相同的層析條件下分離，記錄其洗脫體積，然后

15、待測蛋白質(zhì)溶液在上述相同的層析條件下分離，記錄其洗脫體積，然后根據(jù)標準曲線計算其分子量。根據(jù)標準曲線計算其分子量。 （五）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)（五）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 根據(jù)溶質(zhì)在溶劑中的顆粒大?。ǚ稚⒊潭龋梢园逊稚⒏鶕?jù)溶質(zhì)在溶劑中的顆粒大?。ǚ稚⒊潭龋?，可以把分散系統(tǒng)分為系統(tǒng)分為3類：類： 分散相質(zhì)點小于分散相質(zhì)點小于1nm的為真溶液，大于的為真溶液，大于100nm的為懸濁液，的為懸濁液，介于介于l100nm的為膠體溶液。的為膠體溶液。 分散相質(zhì)點在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，需具備分散相質(zhì)點在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，需具備3個條件：個條件： 1）分散相質(zhì)點大小在）分散相質(zhì)點大小在l100nm范圍內(nèi)，這樣大

16、小的質(zhì)點在范圍內(nèi)，這樣大小的質(zhì)點在動力學上是穩(wěn)定的，介質(zhì)分子對這種質(zhì)點碰撞的合力不等于零，動力學上是穩(wěn)定的，介質(zhì)分子對這種質(zhì)點碰撞的合力不等于零，使它能在介質(zhì)中不斷作使它能在介質(zhì)中不斷作布朗運動布朗運動（Brown movement）；）； 2）分散相的質(zhì)點帶有）分散相的質(zhì)點帶有同種電荷，互相排斥同種電荷，互相排斥，不易聚集成大，不易聚集成大顆粒而沉淀；顆粒而沉淀； 3）分散相的質(zhì)點能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成）分散相的質(zhì)點能與溶劑形成溶劑化層，例如與水形成水水化層化層（hydration mantle），質(zhì)點有了水化層，相互間不易靠攏），質(zhì)點有了水化層，相互間不易靠攏而聚集。而聚集。

17、（六）蛋白質(zhì)的沉淀（六）蛋白質(zhì)的沉淀 蛋白質(zhì)分子凝聚并從溶液中析出的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)沉蛋白質(zhì)分子凝聚并從溶液中析出的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)沉淀淀(precipitation)。 變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀，在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。淀，在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。 蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有三種穩(wěn)定因素：顆粒蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有三種穩(wěn)定因素：顆粒表面的水化層；電荷；布朗運動。表面的水化層；電荷；布朗運動。 除去前兩個穩(wěn)定因素除去前兩個穩(wěn)定因素(如調(diào)節(jié)溶液如調(diào)節(jié)溶液pH至等電點和加入脫水

18、至等電點和加入脫水劑劑)，蛋白質(zhì)便容易凝集析出。，蛋白質(zhì)便容易凝集析出。 1. 鹽析鹽析(Salting Out) 在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。常用的中性鹽有硫穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。 2. 重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)可以與重金屬離子如汞、鉛、銅、銀等結(jié)合成鹽蛋白質(zhì)可以與重金屬離子如汞、鉛、銅、銀等結(jié)合成鹽沉淀，沉淀的條件以沉淀，沉淀的條件以pH稍大于等電點為宜。因為此時蛋白質(zhì)稍大于等電點為宜。因為

19、此時蛋白質(zhì)分子有較多的負離子，易與重金屬離子結(jié)合成鹽。分子有較多的負離子，易與重金屬離子結(jié)合成鹽。 3. 生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質(zhì)生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)又可與生物堿試劑蛋白質(zhì)又可與生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某以及某些酸些酸(如三氯醋酸、過氯酸、硝酸如三氯醋酸、過氯酸、硝酸)結(jié)合成不溶性的鹽沉淀，沉結(jié)合成不溶性的鹽沉淀，沉淀的條件應當是淀的條件應當是pH小于等電點，這樣蛋白質(zhì)帶正電荷，易于小于等電點，這樣蛋白質(zhì)帶正電荷，易于與酸根負離子結(jié)合成鹽。與酸根負離子結(jié)合成鹽。常用的沉淀方法：常用的沉淀方法：4. 有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)有機溶劑沉淀蛋白

20、質(zhì) 可與水混合的有機溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水可與水混合的有機溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，在等電點時使的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，在等電點時使蛋白質(zhì)沉淀。在常溫下，有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。蛋白質(zhì)沉淀。在常溫下，有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此，但若在低溫條件下，則變性進例如酒精消毒滅菌就是如此，但若在低溫條件下，則變性進行較緩慢，可用于分離制備各種血漿蛋白質(zhì)。行較緩慢，可用于分離制備各種血漿蛋白質(zhì)。5. 加熱凝固加熱凝固 加熱蛋白質(zhì)溶液，可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固加熱蛋白質(zhì)溶液，可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固(coagu

21、lation)而而沉淀。沉淀。 加熱首先是使蛋白質(zhì)變性，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)被打開，加熱首先是使蛋白質(zhì)變性，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)被打開，呈松散狀不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，分子的不對稱性增加，疏水基團暴呈松散狀不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，分子的不對稱性增加，疏水基團暴露，進而凝聚成凝膠狀的蛋白塊。如煮熟的雞蛋，蛋黃和蛋露，進而凝聚成凝膠狀的蛋白塊。如煮熟的雞蛋，蛋黃和蛋清都凝固。清都凝固。 （七）蛋白質(zhì)的變性與復性（七）蛋白質(zhì)的變性與復性變性（變性（denaturation）：）： 在變性因素的作用下，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，空在變性因素的作用下，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，空間構(gòu)象被破壞，生物學功能喪失，理化性質(zhì)也發(fā)生改變的現(xiàn)

22、間構(gòu)象被破壞，生物學功能喪失，理化性質(zhì)也發(fā)生改變的現(xiàn)象。象。 變性蛋白質(zhì)溶解度降低，粘度增加，結(jié)晶性被破壞，易變性蛋白質(zhì)溶解度降低，粘度增加，結(jié)晶性被破壞，易發(fā)生沉淀。發(fā)生沉淀。復性（復性（Renaturation）: 在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)從伸展態(tài)恢復到折迭態(tài)，在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)從伸展態(tài)恢復到折迭態(tài)，并恢復其原來的理化性質(zhì)和生物活性。并恢復其原來的理化性質(zhì)和生物活性。 抗菌肽的提純；抗菌肽的提純；RNase A的配制的配制 與化學產(chǎn)品的分離制備相比較，蛋白質(zhì)的制備有以下主要與化學產(chǎn)品的分離制備相比較，蛋白質(zhì)的制備有以下主要特點：特點： 生物材料的生物材料的組成極其復雜組成極其復雜

23、。所以蛋白質(zhì)分子的分離純化。所以蛋白質(zhì)分子的分離純化方法差別極大，想找到一種適合各種蛋白質(zhì)分子分離制備的標方法差別極大，想找到一種適合各種蛋白質(zhì)分子分離制備的標準方法是不可能的。準方法是不可能的。 許多蛋白質(zhì)分子在生物材料中的許多蛋白質(zhì)分子在生物材料中的含量極微含量極微。 許多蛋白質(zhì)分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境許多蛋白質(zhì)分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境極易失活極易失活。 蛋白質(zhì)的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、蛋白質(zhì)的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、pH值、值、離子強度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響，很難準確離子強度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響，很難準確估計和判斷，因而實驗結(jié)果常

24、有很大的估計和判斷，因而實驗結(jié)果常有很大的經(jīng)驗成份經(jīng)驗成份，實驗，實驗重復性重復性較差較差，個人的實驗技術(shù)水平和經(jīng)驗對實驗結(jié)果有較大的影響。，個人的實驗技術(shù)水平和經(jīng)驗對實驗結(jié)果有較大的影響。二、蛋白質(zhì)提取、純化的特點二、蛋白質(zhì)提取、純化的特點三、蛋白質(zhì)提取、純化前的準備蛋白質(zhì)提取、純化前的準備 在進行蛋白質(zhì)的制備前，通常需要對以下幾方面的內(nèi)容加在進行蛋白質(zhì)的制備前，通常需要對以下幾方面的內(nèi)容加以確定或預先了解。以確定或預先了解。 明確實驗目的和要求?？蒲?、開發(fā)，還是要發(fā)現(xiàn)新的物明確實驗目的和要求。科研、開發(fā)，還是要發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)。質(zhì)。 通過文獻調(diào)研和預備性實驗，掌握目的蛋白質(zhì)的理化性通過文獻調(diào)研

25、和預備性實驗，掌握目的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學特性。如質(zhì)和生物學特性。如分子大小；溶解度；電荷；吸附性質(zhì)；熱分子大小；溶解度；電荷；吸附性質(zhì)；熱穩(wěn)定性；對配體分子的生物學親和力等。穩(wěn)定性；對配體分子的生物學親和力等。 建立相應的可靠的分析測定方法，這是制備蛋白質(zhì)的關(guān)建立相應的可靠的分析測定方法，這是制備蛋白質(zhì)的關(guān)鍵。鍵。 確定可能的技術(shù)路線和實驗方案，這是最困難的過程，確定可能的技術(shù)路線和實驗方案，這是最困難的過程，要求具有很高的綜合知識和實驗技術(shù)水平。要求具有很高的綜合知識和實驗技術(shù)水平。四、蛋白質(zhì)提取、純化的一般步驟四、蛋白質(zhì)提取、純化的一般步驟 1.1.選材：選材： 制備生物大分子，首先

26、要選擇適當?shù)纳锊牧?。制備生物大分子，首先要選擇適當?shù)纳锊牧稀?原則：原則：原材料來源充足；目標蛋白含量豐富；易于處理原材料來源充足；目標蛋白含量豐富；易于處理和提取。和提取。 2.2.生物材料的破碎和預處理：生物材料的破碎和預處理：常用的方法有組織勻漿法、常用的方法有組織勻漿法、研磨、反復凍融、溶菌酶、高壓破碎等。研磨、反復凍融、溶菌酶、高壓破碎等。 目的：目的：將目標蛋白以可溶態(tài)充分暴露出來，并與其他成將目標蛋白以可溶態(tài)充分暴露出來，并與其他成分分離。分分離。 3.3.粗分離：粗分離：將絕大多數(shù)雜質(zhì)去掉的過程。方法多為離心、將絕大多數(shù)雜質(zhì)去掉的過程。方法多為離心、鹽析、有機溶劑沉淀、吸附

27、、等電點、超濾等。鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、等電點、超濾等。 4.4.純化：純化：將粗提物中的雜質(zhì)進一步去除的過程，又稱為精將粗提物中的雜質(zhì)進一步去除的過程，又稱為精制。方法為各種層析技術(shù)，特別是親和層析技術(shù)。制。方法為各種層析技術(shù)，特別是親和層析技術(shù)。 5.5.鑒定：鑒定：包括包括3 3方面的內(nèi)容：含量；純度；活性。貫穿于方面的內(nèi)容：含量；純度；活性。貫穿于提取、純化的每一步。提取、純化的每一步。 含量：含量：凱氏定氮法、凱氏定氮法、FolinFolin- -酚試劑法（酚試劑法（LowryLowry法）和紫外法）和紫外吸收法等。吸收法等。 純度：純度：生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定

28、，要生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定，要求達到一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或求達到一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或HPLCHPLC和毛細管電和毛細管電泳都是一個峰。末端泳都是一個峰。末端AAAA測定。測定。 活性：活性：比活或生物活性鑒定。比活或生物活性鑒定。 6.6.產(chǎn)物的濃縮、干燥和保存產(chǎn)物的濃縮、干燥和保存。 與提取純化天然蛋白質(zhì)相比，重組蛋白質(zhì)的提取純化具與提取純化天然蛋白質(zhì)相比，重組蛋白質(zhì)的提取純化具有以下特點：有以下特點： 1.1. 細菌、酵母、傳代細胞等表達體系組成背景清楚，細菌、酵母、傳代細胞等表達體系組成背景清楚，用它們表達的重組蛋白的提取純化簡單、容易；用它們

29、表達的重組蛋白的提取純化簡單、容易； 2.2. 分泌表達的蛋白更易提取純化，且不被細胞內(nèi)蛋白分泌表達的蛋白更易提取純化，且不被細胞內(nèi)蛋白污染，特別是利用無血清培養(yǎng)時。污染，特別是利用無血清培養(yǎng)時。 3.3. 同一種蛋白質(zhì)，應用不同的表達系統(tǒng)表達，其提取同一種蛋白質(zhì)，應用不同的表達系統(tǒng)表達，其提取純化的策略可能完全不同。純化的策略可能完全不同。 4.4. 可根據(jù)可根據(jù)不同的表達系統(tǒng)特點，設計易于提取純化目不同的表達系統(tǒng)特點，設計易于提取純化目的蛋白的表達策略。的蛋白的表達策略。五、五、重組蛋白質(zhì)重組蛋白質(zhì)提取、純化特點提取、純化特點一般步驟：一般步驟： 1. 1. 細胞（菌體）與培養(yǎng)基的分離。細

30、胞（菌體）與培養(yǎng)基的分離。常用離心法（大量生常用離心法（大量生產(chǎn)可用連續(xù)離心機）。根據(jù)目的蛋白存在的部位，收集細胞產(chǎn)可用連續(xù)離心機）。根據(jù)目的蛋白存在的部位，收集細胞或培養(yǎng)基。或培養(yǎng)基。 2. 2. 細胞破碎。細胞破碎。常用的方法有超聲破碎、高壓破碎和反復常用的方法有超聲破碎、高壓破碎和反復凍融等。凍融等。目的：目的：將目標蛋白以可溶態(tài)充分暴露出來，并與其將目標蛋白以可溶態(tài)充分暴露出來，并與其他成分分離。他成分分離。若為分泌表達，本步驟可省略。若為分泌表達，本步驟可省略。 3. 3. 粗提。粗提。將絕大多數(shù)雜質(zhì)去掉的過程。方法多為離心、將絕大多數(shù)雜質(zhì)去掉的過程。方法多為離心、鹽析、有機溶劑沉淀

31、、吸附、等電點、超濾等。鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、等電點、超濾等。 4.4.精制：精制：將粗提物中的雜質(zhì)進一步去除。方法主要為各種層將粗提物中的雜質(zhì)進一步去除。方法主要為各種層析技術(shù)，特別是親和層析技術(shù)。析技術(shù)，特別是親和層析技術(shù)。 基因工程包涵體在純化前，需要可逆性的變性、復性處理?；蚬こ贪w在純化前，需要可逆性的變性、復性處理。 5. 5. 鑒定：鑒定：包括包括3 3方面的內(nèi)容：含量；純度；活性。貫穿于提方面的內(nèi)容：含量；純度；活性。貫穿于提取、純化的每一步。取、純化的每一步。 含量：含量：凱氏定氮法、凱氏定氮法、FolinFolin- -酚法（酚法（LowryLowry法）和紫外吸收

32、法法）和紫外吸收法等。等。 純度：純度：生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定。要求：生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定。要求：一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或HPLCHPLC和毛細管電泳都是一和毛細管電泳都是一個峰。末端氨基酸測定。個峰。末端氨基酸測定。 活性：活性：比活或生物活性鑒定。比活或生物活性鑒定。 6. 6. 產(chǎn)物的濃縮、干燥和保存產(chǎn)物的濃縮、干燥和保存。注意事項：注意事項： 防止目的蛋白的降解是關(guān)鍵。措施如下：防止目的蛋白的降解是關(guān)鍵。措施如下： 1.1.對宿主細胞或目的蛋白進行基因操作，防止蛋白水解。對宿主細胞或目的蛋白進行基因操作，

33、防止蛋白水解。如利用蛋白酶缺失的宿主菌或細胞；融合表達等。如利用蛋白酶缺失的宿主菌或細胞；融合表達等。 2.2.從重組蛋白溶液中除去蛋白酶。從重組蛋白溶液中除去蛋白酶。 3.3.抑制蛋白酶活性。如抑制劑（抑制蛋白酶活性。如抑制劑（EDTAEDTA、PMSFPMSF），降低操），降低操作溫度等。作溫度等。 4.4.迅速將表達的目的蛋白脫離表達體系。迅速將表達的目的蛋白脫離表達體系。 注意：注意：應同時聯(lián)合應用幾種方法。應同時聯(lián)合應用幾種方法。附：附：蛋白質(zhì)含量測定技術(shù)蛋白質(zhì)含量測定技術(shù)蛋白質(zhì)含量（純度）測定技術(shù)蛋白質(zhì)含量（純度）測定技術(shù) 蛋白質(zhì)定量測定技術(shù)是生物化學研究中最常用、最基本的蛋白質(zhì)定

34、量測定技術(shù)是生物化學研究中最常用、最基本的分析技術(shù)之一。蛋白質(zhì)定量測定的方法很多，基本上都是根據(jù)分析技術(shù)之一。蛋白質(zhì)定量測定的方法很多，基本上都是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理、化學或生物學特性建立的。蛋白質(zhì)的物理、化學或生物學特性建立的。 目前，常用的方法有：目前，常用的方法有：定氮法，比色法（定氮法，比色法（Folin酚試劑法酚試劑法(Lowry法）、考馬斯亮藍法（法）、考馬斯亮藍法（Bradford法）、紫外吸收法和雙法）、紫外吸收法和雙縮脲法縮脲法(Biuret法法)。其中其中Lowry法和法和Bradford法靈敏度最高，比法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏紫外吸收法靈敏1020倍，比倍，比Biure

35、t法靈敏法靈敏100倍以上。定氮法倍以上。定氮法雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標準蛋白質(zhì)。他方法的標準蛋白質(zhì)。微量凱氏（微量凱氏（KjeldahlKjeldahl）定氮法）定氮法 蛋白質(zhì)的元素組成中，氮的含量較為恒定，平蛋白質(zhì)的元素組成中，氮的含量較為恒定，平均為均為1616，即即1g1g氮相當于氮相當于6.25g6.25g蛋白質(zhì)。而生物樣蛋白質(zhì)。而生物樣品中非蛋白含氮化合物的量通常較小，故只要從生品中非蛋白含氮化合物的量通常較小，故只要從生物樣品中測定出總含氮量減去非蛋白含氮量，即可物樣品中測定出總含氮量減

36、去非蛋白含氮量，即可推算出樣品中蛋白質(zhì)含量。定氮法比較復雜，但較推算出樣品中蛋白質(zhì)含量。定氮法比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的準確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標準蛋白質(zhì)。標準蛋白質(zhì)。實驗原理實驗原理: : 樣品與濃硫酸共熱，含氮有機物即分解產(chǎn)生氨；樣品與濃硫酸共熱，含氮有機物即分解產(chǎn)生氨；氨與硫酸作用，變成硫酸氨；經(jīng)強堿堿化又分解釋氨與硫酸作用，變成硫酸氨；經(jīng)強堿堿化又分解釋放氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和放氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。的程度可計算得樣品之氮含量。 計算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品

37、中計算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白氮含量，須將總氮量減去非蛋白氮。蛋白氮含量，須將總氮量減去非蛋白氮。 樣品中蛋白質(zhì)的含量，用樣品中蛋白氮含量樣品中蛋白質(zhì)的含量，用樣品中蛋白氮含量 6.25即得。即得。雙縮脲法（雙縮脲法（BiuretBiuret法）：法）： 實驗借助于蛋白質(zhì)分子中肽鍵與雙縮脲試劑特殊實驗借助于蛋白質(zhì)分子中肽鍵與雙縮脲試劑特殊的顏色反應，通過分光光度計測定待測蛋白質(zhì)在的顏色反應，通過分光光度計測定待測蛋白質(zhì)在540 nm處的光密度值（處的光密度值（OD540） 。 以已知標準蛋白的光密度值為縱坐標，標準蛋白以已知標準蛋白的光密度值為縱坐標，標準蛋白濃度為橫坐標制作濃

38、度濃度為橫坐標制作濃度-光密度標準曲線，利用該標準光密度標準曲線，利用該標準曲線法求出待測蛋白質(zhì)含量。曲線法求出待測蛋白質(zhì)含量。實驗原理：實驗原理： 雙縮脲（雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)）是兩個分子脲經(jīng)180左右左右加熱，放出一分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲加熱，放出一分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個以上肽鍵的化合物都有雙縮脲反應?；騼蓚€以上肽鍵的化合物都有雙縮脲反應。 紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)紫色絡合物顏色的深

39、淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為圍為110mg/mL蛋白質(zhì)溶液。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫蛋白質(zhì)溶液。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。緩沖液和某些氨基酸等。紫色絡合物紫色絡合物FolinFolin酚法（酚法（LowryLowry法）法） 此法是在雙縮脲反應的基礎上發(fā)展起來的，此法是在雙縮脲反應的基礎上發(fā)展起來的，F(xiàn)olin酚試劑法最早由酚試劑法最早由Lowry建立，是最靈敏的測定建立，是最靈敏的測定方法之一。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，

40、方法之一。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即只是加入了第二種試劑，即Folin酚試劑，以增加酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。方法的靈顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。方法的靈敏度好于雙縮脲法，是目前教學、科研常用的蛋白質(zhì)敏度好于雙縮脲法，是目前教學、科研常用的蛋白質(zhì)含量測定方法。含量測定方法。 用用Folin酚試劑和未知蛋白質(zhì)反應產(chǎn)生藍色反酚試劑和未知蛋白質(zhì)反應產(chǎn)生藍色反應，通過分光光度計測定其在應，通過分光光度計測定其在700nm處的光密度值，處的光密度值，以已知標準蛋白的光密度值為縱坐標，標準蛋白濃度以已知標準蛋白的光密度值為縱坐標，標準蛋

41、白濃度為橫坐標制作濃度為橫坐標制作濃度-光密度標準曲線，利用該標準曲光密度標準曲線，利用該標準曲線法求出待測蛋白質(zhì)含量。線法求出待測蛋白質(zhì)含量。實驗原理：實驗原理： 顯色反應產(chǎn)生深蘭色的原因是：顯色反應產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復合物，并使肽鏈展蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復合物，并使肽鏈展開，其中的酪氨酸和色氨酸殘基充分暴露出來；開，其中的酪氨酸和色氨酸殘基充分暴露出來；Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭中的酪氨酸和色氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合

42、物）。在一定的條件下，蘭色的深淺和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。與蛋白質(zhì)的含量成正比。 本方法的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，本方法的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，可檢測的最低蛋白質(zhì)量達可檢測的最低蛋白質(zhì)量達5 g，通常測定范圍是，通常測定范圍是20250 g?？捡R斯亮蘭法（考馬斯亮蘭法（BradfordBradford法）法） 由由Bradford在在1976年建立的考馬斯亮蘭法，又稱年建立的考馬斯亮蘭法，又稱Bradford法，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設計法，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設計的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出

43、的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。但此法所優(yōu)點，是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。但此法所用樣品不能回收，不適合需回收樣品蛋白的濃度測定。用樣品不能回收，不適合需回收樣品蛋白的濃度測定。但此法所用樣品量較少，在生產(chǎn)和科研中仍然較多使但此法所用樣品量較少，在生產(chǎn)和科研中仍然較多使用。用。實驗原理：實驗原理： 考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)通過范德華引力結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位質(zhì)通過范德華引力結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（置（ max）由）由455nm變?yōu)樽優(yōu)?95nm，溶液的顏色也由，溶液的顏

44、色也由棕黑色變?yōu)樘m色。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白棕黑色變?yōu)樘m色。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的顏色符合比爾定律，與蛋白質(zhì)濃度成正比。質(zhì)的顏色符合比爾定律，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 干擾此法測定的主要物質(zhì)有：去污劑、干擾此法測定的主要物質(zhì)有：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（、十二烷基硫酸鈉（SDS）和）和0.1mol/L的的NaOH。紫外分光光度法：紫外分光光度法： 利用紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點是迅速、利用紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點是迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中（特別是在柱層析分

45、離在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中（特別是在柱層析分離中）廣泛應用。中）廣泛應用。實驗原理：實驗原理： 蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在質(zhì)，吸收高峰在280nm處。在該波長附近，吸光度處。在該波長附近，吸光度（OD值）與蛋白質(zhì)含量（值）與蛋白質(zhì)含量（0.1mg/ml1.0mg/ml）成正）成正比。根據(jù)這一特性，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。比。根據(jù)這一特性，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。第三節(jié)第三節(jié) 核酸類生物制品的核酸類生物制品的分離純化方法分離純化方

46、法 核酸核酸(DNA(DNA或或RNA)RNA)經(jīng)水解可得到很多核苷酸，因此核苷經(jīng)水解可得到很多核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位。酸是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位。 核酸是由很多單核苷酸聚合形成的長鏈大分子核酸是由很多單核苷酸聚合形成的長鏈大分子( (多聚核多聚核苷酸苷酸) )。 核酸是生物體的基本組成物質(zhì)，是重要的生物大分子之一！核酸是生物體的基本組成物質(zhì)，是重要的生物大分子之一！ 原核原核細胞的染色體細胞的染色體DNADNA基本呈裸露狀態(tài)，存在于類基本呈裸露狀態(tài)，存在于類核區(qū)。核區(qū)。 質(zhì)粒質(zhì)粒（plasmidplasmid）是一種獨立于染色體之外、能夠）是一種獨立于染色體之外、能夠自主復制的雙

47、鏈環(huán)狀自主復制的雙鏈環(huán)狀DNADNA。 真核真核細胞中細胞中, , DNADNA主要存在于核內(nèi)的染色體上，與主要存在于核內(nèi)的染色體上，與組蛋白結(jié)合，以核蛋白體的形式存在；線粒體、葉綠組蛋白結(jié)合，以核蛋白體的形式存在；線粒體、葉綠體中亦存在少量體中亦存在少量DNADNA。 RNARNA（mRNAmRNA、tRNAtRNA、rRNArRNA）主要存在于細胞質(zhì)中，）主要存在于細胞質(zhì)中，也以核蛋白體的形式存在。也以核蛋白體的形式存在。 生物細胞中的核酸種類、存在部位：生物細胞中的核酸種類、存在部位：DNA的性質(zhì)的性質(zhì)1. 1. 溶解性：溶解性：微溶于水，不溶于有機溶劑。微溶于水，不溶于有機溶劑。2.

48、2. 粘性：粘性：無分支，線或環(huán)狀；分子很長，在溶液中呈粘稠狀。無分支，線或環(huán)狀；分子很長，在溶液中呈粘稠狀。3. 3. 剛性：剛性：雙螺旋結(jié)構(gòu)具有剛性，受剪切力的作用，易斷裂。雙螺旋結(jié)構(gòu)具有剛性，受剪切力的作用，易斷裂。4. 4. 易降解：易降解：溶液中的溶液中的DNADNA易被核酸酶降解。易被核酸酶降解。5. 5. 變性變性/ /復性：復性：具有變性和復性現(xiàn)象（增色具有變性和復性現(xiàn)象（增色/ /減色效應）。減色效應）。6. 6. 內(nèi)切酶識別和切割：內(nèi)切酶識別和切割：被被型型限制性內(nèi)切酶識別和切割。具有限制性內(nèi)切酶識別和切割。具有 特異性。特異性。DNADNA制備的原理：制備的原理：1.1.

49、 DNA DNA蛋白和蛋白和RNARNA蛋白在不同的鹽溶液中的溶解度不同。蛋白在不同的鹽溶液中的溶解度不同。2.2. 蛋白質(zhì)的變性。蛋白質(zhì)的變性。3.3. DNA DNA不溶于有機溶劑。不溶于有機溶劑。 例如：例如：在稀鹽溶液中，核糖核蛋白的溶解度大于脫氧核糖在稀鹽溶液中，核糖核蛋白的溶解度大于脫氧核糖核蛋白；在濃鹽溶液中，則反之。據(jù)此，調(diào)整鹽濃度即可把這核蛋白；在濃鹽溶液中，則反之。據(jù)此，調(diào)整鹽濃度即可把這兩種核蛋白體分開兩種核蛋白體分開 分離得到的脫氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸鈉（分離得到的脫氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸鈉（SDS）使蛋白質(zhì)成分變性，讓使蛋白質(zhì)成分變性，讓DNA游離出來，再

50、用氯仿沉淀除去變性游離出來，再用氯仿沉淀除去變性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。 最后根據(jù)核酸只溶于水而不溶于有機溶劑的特點，加入無最后根據(jù)核酸只溶于水而不溶于有機溶劑的特點，加入無水乙醇，即可從除去蛋白質(zhì)的溶液中把水乙醇，即可從除去蛋白質(zhì)的溶液中把DNA沉淀出來，獲得沉淀出來，獲得DNA純品。純品。乙醇沉淀乙醇沉淀核蛋白體核蛋白體DNA核蛋白核蛋白RNA核蛋白核蛋白DNADNA純品純品蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)SDS稀鹽溶液稀鹽溶液細胞破碎細胞破碎 1. 抑制核酸酶活性，防止核酸降解。抑制核酸酶活性，防止核酸降解。DNA或或RNA的制備，最的制備，最主要的應防止核酸酶的降解，主要方法如下：主要的應防止核酸酶的降解，主要方

51、法如下： 1）低溫操作）低溫操作(冰水冰水)。 2）加入檸礞酸溶液）加入檸礞酸溶液(與與Mg2+結(jié)合，形成絡合物，降低核酸結(jié)合，形成絡合物，降低核酸酶活性酶活性)。 3）加入）加入SDS使酶變性。使酶變性。 4）RNA酶抑制劑。酶抑制劑。2. 應盡可能保持應盡可能保持DNA的完整性。防止剪切力作用，使的完整性。防止剪切力作用，使DNA斷斷 裂，動作須輕緩。裂，動作須輕緩。注意事項：注意事項：第四節(jié)第四節(jié) 基因工程制品的制備基因工程制品的制備主要內(nèi)容：主要內(nèi)容：1.1. 什么是什么是基因工程和基因工程和基因工程制品？基因工程制品？2.2. 獲得目的獲得目的DNADNA基因的方法有哪些？基因的方法

52、有哪些？3.3. DNADNA雙脫氧測序技術(shù)的基本原理；雙脫氧測序技術(shù)的基本原理；4.4. PCRPCR技術(shù)的基本原理及其應用；技術(shù)的基本原理及其應用；5.5. 核酸雜交技術(shù)的基本原理與應用。核酸雜交技術(shù)的基本原理與應用。 本義：本義：根據(jù)人們的意愿，利用工程設計的方法，在體外根據(jù)人們的意愿，利用工程設計的方法，在體外將克隆獲得的目的基因與適當?shù)妮d體進行切割和連接，構(gòu)建將克隆獲得的目的基因與適當?shù)妮d體進行切割和連接，構(gòu)建成正確的重組表達載體，再應用物理的、化學的或生物學的成正確的重組表達載體，再應用物理的、化學的或生物學的方法將該表達載體導入到細菌、動植物細胞或受精卵中，使方法將該表達載體導入

53、到細菌、動植物細胞或受精卵中，使目的基因在細胞或宿主體內(nèi)以瞬時方式或穩(wěn)定方式進行表達，目的基因在細胞或宿主體內(nèi)以瞬時方式或穩(wěn)定方式進行表達，借此研究目的基因的結(jié)構(gòu)與功能，或獲得該基因的表達產(chǎn)物。借此研究目的基因的結(jié)構(gòu)與功能，或獲得該基因的表達產(chǎn)物。這一過程就是基因工程。這一過程就是基因工程。 廣義：廣義：轉(zhuǎn)基因動物；克隆；基因打靶；基因組計劃等均轉(zhuǎn)基因動物；克隆；基因打靶；基因組計劃等均屬于基因工程的范疇。屬于基因工程的范疇。一、基因工程和基因工程制品的定義一、基因工程和基因工程制品的定義基因工程：基因工程：基因工程制品：基因工程制品： 利用基因工程的手段，將目的基因在適當?shù)乃蘩没蚬こ痰氖?/p>

54、段，將目的基因在適當?shù)乃拗骷毎騽?、植物體內(nèi)高效表達，經(jīng)提取純化和鑒主細胞或動、植物體內(nèi)高效表達，經(jīng)提取純化和鑒定后，所獲得的目的基因的表達產(chǎn)物，即為基因工定后，所獲得的目的基因的表達產(chǎn)物，即為基因工程制品。程制品。目的基因獲得目的基因獲得表達載體構(gòu)建表達載體構(gòu)建基因的導入基因的導入整合與表達的鑒定整合與表達的鑒定表達產(chǎn)物的提取、純化與鑒定表達產(chǎn)物的提取、純化與鑒定二、基因工程的基本步驟二、基因工程的基本步驟上游技術(shù)上游技術(shù)下游技術(shù)下游技術(shù)三、基因工程中的基本方法三、基因工程中的基本方法（一）核酸的提取純化（一）核酸的提取純化 1. DNA提取純化技術(shù)；提取純化技術(shù)； 2. plasmid提取

55、純化技術(shù)；提取純化技術(shù)； 3. mRNA提取純化技術(shù)。提取純化技術(shù)。（二）核酸電泳技術(shù)（二）核酸電泳技術(shù) 1. 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 2. SDS-PAGE核酸電泳技術(shù)核酸電泳技術(shù) 1. 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 2. SDS-PAGE 500200010007501002001 DL2000 marker1 DL2000 marker2 BamHI2 BamHI和和EcoRIEcoRI雙切雙切3 BamHI3 BamHI單切單切4 Hind4 Hind單切單切5 5 重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒pVAX1/ABPS1pVAX1/ABPS1 1 2 3 4 5真核細胞總真核細胞總RNA的電泳結(jié)

56、果：的電泳結(jié)果：（三）（三）DNADNA雙脫氧測序雙脫氧測序（四）核酸雜交技術(shù)（四）核酸雜交技術(shù)（probe） 1）原理；原理； 2）標記物；標記物； 3）種類；種類； 4）應用應用 1. Dot blot2. Southern blot： DNA（五）（五）PCRPCR技術(shù)技術(shù) 1.1.基本原理基本原理 2.2.引物設計引物設計 1)1)長度長度; 2)GC%; ; 2)GC%; 3)stem-loop; 4)dimer; 3)stem-loop; 4)dimer; 5) 5)錯配錯配; ; 6)5 6)5末端可以不配對。末端可以不配對。 3.3.應用應用: : 科學研究；醫(yī)學與獸醫(yī)臨床?？?/p>

57、學研究；醫(yī)學與獸醫(yī)臨床。Kary B. MullisLa Jolla, CA, USA. B.1944DNADNA生物合成與生物合成與PCRPCR方法合成方法合成DNADNA的異同點的異同點: :1.1.相同點：相同點：均為酶促反應；均需要模板和引物；底物為均為酶促反應；均需要模板和引物；底物為dNTP； 半保留復制；均為半保留復制；均為5 3方向復制。方向復制。2.2.不同點：不同點：1）反應條件不同：體內(nèi)為生理條件，體外為反應條件不同：體內(nèi)為生理條件，體外為94、52及及72 等變溫條件；等變溫條件；2）參與反應的物質(zhì)種類和數(shù)量不同；參與反應的物質(zhì)種類和數(shù)量不同；3 3）引物不同，體內(nèi)為引

58、物不同，體內(nèi)為RNARNA，體外為，體外為DNADNA，且在，且在DNADNA合成后，前者合成后，前者 被切除掉，后者作為終產(chǎn)物的一部分；被切除掉，后者作為終產(chǎn)物的一部分；4 4）體內(nèi)為半不連續(xù)合成，體外為連續(xù)合成；體內(nèi)為半不連續(xù)合成，體外為連續(xù)合成；5 5）體內(nèi)單復制原點或多復制原點，單方向或雙方向復制；體內(nèi)單復制原點或多復制原點，單方向或雙方向復制；6 6）體內(nèi)受細胞周期的調(diào)控，體外按人們的意愿進行；體內(nèi)受細胞周期的調(diào)控，體外按人們的意愿進行；7 7）體內(nèi)具有校正、修復的功能（錯配率較低），體外無（錯配體內(nèi)具有校正、修復的功能（錯配率較低），體外無（錯配 率較高）；率較高）；8 8）體內(nèi)體

59、內(nèi)DNADNA的復制為全部染色體的復制為全部染色體DNADNA的復制，體外僅復制兩引物的復制，體外僅復制兩引物 之間的之間的DNADNA序列。序列。四、基因工程中的工具四、基因工程中的工具 （一）載體（一）載體 1.1.質(zhì)粒質(zhì)粒( (plasmidplasmid) ) 2.2.粘粒粘粒( (cosmidcosmid) ) 3.3.phagephage或其他病毒，如腺病毒、桿狀病毒等。或其他病毒，如腺病毒、桿狀病毒等。 （二）工具酶（二）工具酶 1.1.限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 2.2.外切酶外切酶 3.3.連接酶連接酶 4.4.聚合酶聚合酶: klenow: klenow I I 5. 5.核

60、酸酶核酸酶 （三）宿主菌：（三）宿主菌： DH5 , JM101, JM109, DE3等。等。五、獲得目的基因的方法五、獲得目的基因的方法 基因文庫：基因文庫：基因組文庫和基因組文庫和cDNA文庫；文庫； PCR； 化學合成?；瘜W合成。 還有還有DD-PCR以及以及基因芯片基因芯片等技術(shù)。等技術(shù)。應對獲得的目的基因進行測序鑒定！應對獲得的目的基因進行測序鑒定！六、重組質(zhì)粒（表達載體）的構(gòu)建與鑒定六、重組質(zhì)粒（表達載體）的構(gòu)建與鑒定1. DNA（載體和目的片段）的酶切與回收。（載體和目的片段）的酶切與回收。2. 目的片段與載體的連接。二者的摩爾比應滿足以下目的片段與載體的連接。二者的摩爾比應滿