條帶分析及解決方法剖析

1、現(xiàn)象原因解決反影(白色條帶,黑色背景)1 HRP過高(背景較高)至少成倍稀釋一抗/二抗(可410倍)*注1顯影后膜上條帶處變?yōu)辄S色2 HRP過高(敏感性太高)至少成倍稀釋一抗/二抗(可410倍)*注2信號(hào)弱或無3 HRP過高引起底物迅速耗竭至少成倍稀釋一抗/二抗(可410倍)*注34 抗體-抗原系統(tǒng)敏感性過低提高抗體濃度/蛋白上樣量*注45 轉(zhuǎn)膜不充分/過轉(zhuǎn)優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件*注56 HRP或底物活性降低測試活性或選用敏感底物 *注6高背景7 HRP過高(背景較高)至少成倍稀釋一抗/二抗(可410倍)*注78 封閉時(shí)間不足延長封閉時(shí)間4度過夜最好*注89 抗體與封閉液有交叉更換封閉液(如3%BSA的

2、TBST)*注910 TBST洗脫不足增加洗脫時(shí)間、次數(shù)、用量*注1011 暴光時(shí)間過長降低暴光時(shí)間*注1112 抗原-抗體濃度過高降低抗體濃度或蛋白上樣量*注12條帶內(nèi)無顯影的白點(diǎn)13 轉(zhuǎn)膜不良（如有氣泡在膠-膜之間)精細(xì)操作*注1314 膜平衡不均/油脂污染按說明書平衡膜/戴手套用平頭鑷子持膜*注1415 膜與X光片間有氣泡顯影前去除氣泡*注15非特異性條帶16 抗體交叉反應(yīng)至少成倍稀釋一抗/二抗(可410倍)*注1617 SDS非特異性結(jié)合蛋白條帶使用無SDS轉(zhuǎn)膜液*注17散在小圓斑18 封閉液有雜質(zhì)顆粒靜置牛奶使大顆粒沉淀，僅用上層*注18*注1 其具體問題有二：一是背景較高,二是沒有

3、條帶.形成機(jī)制為條帶處HRP很快將底物耗竭，則不發(fā)光不使膠片感光而為白色,周圍因背景HRP較低而持續(xù)發(fā)光一段時(shí)間使膠片感光為黑色。這種常見于高濃度抗體并且封閉/洗脫不好的情況下。如果沒有背景則就是原因3的現(xiàn)象。在暗室可以看到條帶周圍熒光而條帶處為暗。如是則要么通過降低抗體解決，要么動(dòng)作迅速早期未耗竭底物時(shí)壓片，否則一旦耗竭通過減少壓片時(shí)間不能解決問題。也可以過一段時(shí)間鼿RP稍減后重加底物迅速壓片。還有另外一種反影現(xiàn)象就是壓出條帶粗大模糊，但條帶中心是空的白色，原因和上面的一樣，主要是條帶中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的熒光帶，但與上面的區(qū)別主要在于特異性要好一些，若繼續(xù)發(fā)展則就是原因

4、3的現(xiàn)象。其分析和解決同上。*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的產(chǎn)物使膜發(fā)黃,壓出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的現(xiàn)象同時(shí)存在，只是一種現(xiàn)象，在壓過的膜可以看出來（只在加底物后一段時(shí)間出現(xiàn)，幾小時(shí)后可能還會(huì)消退，有時(shí)甚至剛加底物12min就可以看出來，所以要把握時(shí)機(jī)）。如果沒有達(dá)到原因1和原因3的程度，那么這種情況一定能夠看到很強(qiáng)的熒光，是一種良好的狀態(tài),是我們所期盼的。如果壓出正常片子而不出現(xiàn)原因1和原因3的現(xiàn)象,可以不予處理。但因?yàn)闊晒馓珡?qiáng)極易導(dǎo)致條帶增粗變大，所以也可以不稀釋抗體而通過調(diào)整壓片時(shí)間來解決，一般壓10s30s，甚至可以35s，即時(shí)根據(jù)結(jié)果在暗室調(diào)整,熒光持

5、續(xù)時(shí)間長的話都可連續(xù)壓十?dāng)?shù)張片子而效果良好。但也有這種情況，就是由于HRP過強(qiáng)無論怎么減少壓片時(shí)間條帶都依然粗大（如果時(shí)間過短如100kd）蛋白而言，一般不會(huì)出現(xiàn)過轉(zhuǎn)情況，轉(zhuǎn)膜不充分是主要原因，增加轉(zhuǎn)膜力度無非是加大電壓/電流，延長時(shí)間。但對于小分子蛋白（30kd就要注意了，15kd尤其要當(dāng)心）很可能出現(xiàn)過轉(zhuǎn)，麗春紅染膜或觀察marker有沒有穿膜可以確認(rèn)，沒有麗春紅也可以考染轉(zhuǎn)膜后的膠，如果是一片空白，則要小心了，可適當(dāng)降低轉(zhuǎn)膜力度。對于低分子量一般轉(zhuǎn)膜液不要加SDS以防過轉(zhuǎn)，抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南提供的針對中低分子量的濕轉(zhuǎn)緩與高分子量的相比也是不含SDS的。*注6 測試HRP或底物活性：于暗室E

6、P管加底物A、B液各500ul，加入1ul HRP偶聯(lián)二抗，若底物立即發(fā)出藍(lán)光并于隨后數(shù)分鐘內(nèi)消失說明HRP和底物尚好。此外試劑公司還開發(fā)一些超級(jí)底物，其敏感度可達(dá)到pg級(jí)，但價(jià)格昂貴，對某些表達(dá)較低的蛋白效果會(huì)好些，而且也超級(jí)省抗體（其推薦抗體稀釋比高達(dá)1:10,000以上）。我用的是敏感度為ng級(jí)的底物，大部分western都還可以，pg級(jí)的還放在手里，沒舍得用。*注7 高背景原因是因?yàn)镠RP偶聯(lián)二抗結(jié)合到膜上，其原因包過直接結(jié)合、通過膜上蛋白間接結(jié)合、通過一抗（主要指多抗中的雜抗體）間接結(jié)合、通過封閉物（與封閉物交叉反應(yīng)）間接結(jié)合、洗脫不徹底等原因造成的。在稀釋抗體降低背景的同時(shí)也會(huì)降低

7、對目的蛋白的結(jié)合效率，意即以犧牲信號(hào)強(qiáng)度為代價(jià)。不過在此提出另外一種和稀釋抗體恰相反的做法提高抗體濃度。這種辦法適用于HRP結(jié)合到膜上較多而且底物相對極其敏感（如pg級(jí)底物，因極其敏感可把結(jié)合到膜上的極其微量抗體產(chǎn)生的背景也顯示出來，而這種背景在ng級(jí)底物即使壓片過夜也沒有顯示），無論如何稀釋抗體和加強(qiáng)洗膜都不能消除背景或者條帶和背景隨稀釋呈等比例遞減甚至條帶遞減速度比背景還快，如果稀釋抗體則壓片時(shí)間需延長而背景反而因此更加明顯。這種情況下認(rèn)為需要提高抗體含量以提高條帶顯示程度，而背景隨抗體濃度提高并不加強(qiáng)的很厲害，如是則可以通過減少壓片時(shí)間而達(dá)到突出條帶降低背景的目的（我最近帶一個(gè)研究生使用

8、pg級(jí)超級(jí)底物時(shí)發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象并使用此方法解決背景高的難題，當(dāng)時(shí)一抗稀釋為原來的4倍，二抗稀釋為原來的10倍，即總稀釋為原來的40倍仍然可以看到背景的熒光但條帶的熒光卻減了許多導(dǎo)致條帶和背景都無法區(qū)分了，后來回復(fù)原來濃度并稍微延長孵育時(shí)間則條帶熒光明顯蓋過背景并減少壓片時(shí)間至5s解決）。*注8 這一點(diǎn)似乎多數(shù)人都不重視，所以有時(shí)候會(huì)有些意外。我一般室溫24h，但4度過夜確實(shí)是最好的。另外在平皿中搖似乎比封口膜更容易掌握并獲得較好的效果，對新手似乎更好。*注9 實(shí)際上牛奶對于多數(shù)抗體來說還是很好的，但所有二抗也都寫著：與牛奶可能有交叉反應(yīng)。BSA蛋白單一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。單用TBST

9、也可以，此法雖然減少了交叉，但單就封閉能力而言卻也因此而降低*注10 一般10min*3次就足夠了，如果不放心可按自己意志加強(qiáng)時(shí)間、次數(shù)、洗脫液用量。*注11 以犧牲敏感度為代價(jià)其最低標(biāo)準(zhǔn)是使目的條帶能夠正常顯影，對一切原因有效，但效果局限。*注12 以犧牲敏感度為代價(jià)其最低標(biāo)準(zhǔn)是使目的條帶能夠正常顯影，僅對膜上蛋白和一抗引起的有效。*注13 主要是氣泡在膠-膜之間引起的絕緣區(qū)使蛋白無法通過而不能到達(dá)膜上，這一步在操作時(shí)尤其要小心，我自己犯過，也看到其他人犯過。我的辦法是把膠鋪到膜上，先使其一邊接觸膜的一邊，這樣就會(huì)在膠和膜交界的地方形成一個(gè)水相前緣，然后慢慢落下凝膠，這樣這個(gè)水相前緣就會(huì)逐漸

10、推進(jìn)直至膠膜重合，如是則不會(huì)有氣泡產(chǎn)生。把膠鋪到膜上而非相反是因?yàn)槟z是透明的，可以看到水相前緣以及有無氣泡產(chǎn)生。*注14 膜平衡不均或有油脂污染的表現(xiàn)是膜上有疏水的通明色和蛋白幾無（麗春紅染），這點(diǎn)并不多見。*注15 這一點(diǎn)我是抄pierce的說明書的，我沒遇到過，膜與X光片間有氣泡也不影響熒光通過，這個(gè)我可以肯定。似乎不透明的東西才會(huì)導(dǎo)致。*注16 非特異性條帶在普通多抗比較多見，純化多抗會(huì)好的多，但單抗也不是絕對沒有，我也遇到過。關(guān)于wetern的抗體選擇在此提出我的觀點(diǎn)：最理想的是混合單抗，其次是純化多抗，單抗和多抗各有局限和特點(diǎn)，根據(jù)個(gè)人對特異性需求和蛋白的穩(wěn)定性而定?？紤]的參數(shù)主要是

11、抗原表位和特異性兩個(gè)因素，不包含每個(gè)抗體價(jià)格。混合單抗雖然針對多個(gè)表位但代價(jià)太高，需購置多個(gè)單抗然后混合，很少有人這么做。純化多抗基本具有混合多抗的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)，表位多，穩(wěn)定性好，特異性也不差，我覺得是實(shí)際中的首選。單抗雖然特異性好，但如果其針對的表位在提取蛋白時(shí)被破壞則其敏感度為會(huì)下降甚至為0，故不穩(wěn)定。普通多抗雖然表位多，但因含其他抗體，特異性差了好多，會(huì)有很多雜帶乃至背景。實(shí)際我做的抗體多數(shù)都是普通多抗，只要封閉的好，效果還是很不錯(cuò)的；單抗雖說不穩(wěn)定，但實(shí)際中我都能做出來，尤其是內(nèi)參，強(qiáng)烈推薦只選單抗。*注17 此點(diǎn)我根本不知道，完全是拷貝pierce說明書的*注18 主要原因是牛奶里面會(huì)

12、有一些不懸浮的大顆粒，這些東西對封閉無益。我所有的牛奶全是配好后在4度靜置（最好放在尖底的管子內(nèi)），這樣那些大顆粒就會(huì)沉淀到底部，吸取時(shí)不要擔(dān)心牛奶不均而特意混勻，我只吸上面的，下面的顆粒則不要取。如是則在也沒有遇到這種現(xiàn)象。不推薦過濾牛奶，因?yàn)楹臅r(shí)極長且得率極低。我用過幾次但后來廢棄了這種做法。注1 另外一種反影現(xiàn)象就是壓出條帶粗大模糊，但條帶中心是空的白色 注2但因?yàn)闊晒馓珡?qiáng)極易導(dǎo)致條帶增粗變大注7高背景注16非特異性條帶注18散在小圓斑因?yàn)榉忾]不充分,這3者很容易聯(lián)合出現(xiàn),下面是一張典型圖,3者均含注16非特異性條帶下面是一張非特異性較高的圖,雖有背景但相對較低注13主要是氣泡在膠-膜之間引起的絕緣區(qū)使蛋白無法通過而不能到達(dá)膜上氣泡主要是中間一條帶的上緣的半圓形缺失.我實(shí)際的片子上可以隱約看出是一個(gè)圓形的氣泡,周圍一圈還有個(gè)很形象的邊界再提供一個(gè)如何在western顯影圖上判斷蛋白降解的例子.如下圖,與最右邊一條帶相比,左邊3條帶顯影分子量散落下移（不能有上移，因分子量變?。侠黄?，即為降解。在考染膠上判斷有無降解一是大分子量是否完全，二是背景是否清晰，三是小分子量區(qū)是否模糊。降解是非均一性的，蛋白會(huì)不同程度斷裂形成大大小小的片段。在膠上則降低各條帶含量，增加條帶間蛋白形成背景，小片段在小分子量區(qū)