提取方法對(duì)茶多酚氧化酶活性的影響

1、提取方法對(duì)茶多酚氧化酶活性的影響 李立祥吳紅梅（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部茶葉生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室合肥230036） 摘要本文采用不同緩沖液勻漿法及其浸提法、丙酮粉法提取茶多酚氧化酶，比較提酶方法對(duì)酶活性和酶劑活性的影響。結(jié)果表明：緩沖液勻漿法提取酶活性的效果優(yōu)于珍酮粉法；勻漿浸提法提取酶活性的效果高于緩沖液勻漿法；并以檸檬酸鹽緩沖液勻漿浸提法提取效果最好。而酶制劑的單位酶活性則是丙酮粉法較高，分別為緩沖液勻漿法及勻漿浸提法的1235倍。關(guān)鍵詞提取方法茶多酚氧化酶酶活性酶制劑茶多酚氧化酶（氧化還原酶，PPO，EC.1）是茶中一類(lèi)重要末端氧化酶類(lèi)，它不僅在茶樹(shù)生理代謝過(guò)程中起著重要的作用，而且在茶葉加

2、工中，尤其在紅茶加工過(guò)程中對(duì)于催化多酚類(lèi)物質(zhì)的氧化變化也起著主導(dǎo)作用。茶氧化酶類(lèi)的研究始于19世紀(jì)末20世紀(jì)初，近百年來(lái)人們進(jìn)行了大量的研究和探索，已取得巨大的成就，但較多的集中于研究多酚氧化酶的性質(zhì)、同工酶、活性及影響因子，而對(duì)多酚氧化酶的應(yīng)用研究很少；隨著當(dāng)前茶色素研究的深入，體外應(yīng)用酶促氧化茶多酚制取茶色素是未來(lái)趨勢(shì)，開(kāi)展茶多酚氧化酶應(yīng)用研究尤為重要和迫切。筆者就茶多酚氧化酶提取方法對(duì)其活性的影響進(jìn)行了研究，旨在為茶多酚氧化尋求較好的制備方法，為應(yīng)用酶促茶多酚氧化制取茶色素奠定基礎(chǔ)。1實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1材料鮮葉采摘于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶園福鼎大白茶品種一芽二葉及一芽三葉初展，洗凈后放入冰箱待

3、用。1.2茶多酚氧化酶提取1.2.1丙酮粉法：稱(chēng)取洗凈茶鮮葉（20冷凍）25g，放入組織搗碎機(jī)內(nèi)，加225ml冷丙酮（20）搗碎5（即5min，下同）（3+2分兩次進(jìn)行，中間停5），然后迅速抽濾，濾渣用80%的冷丙酮洗至液體無(wú)色為止，所得的濾渣即為丙酮粉，干燥后的丙酮粉置于冰箱中備用。稱(chēng)取1g丙酮粉放于研缽中，加10ml0.1M檸檬酸0.2M磷酸氫二鈉緩沖液，2g石英砂，2gPVP，冰浴研靡20，離心（400rpm）10，取上清液，即為粗酶液。1.2.2勻漿法：稱(chēng)取茶鮮葉（冷凍）25g，放入組織搗碎機(jī)內(nèi)，加PVP50g，再分別加入冷藏的檸檬酸磷酸鹽緩沖液（pH5.6）或檸檬酸鹽緩沖液（pH5.

4、6）或磷酸鹽緩沖液（pH5.8，已是最低pH值）。搗碎5（3+2分兩次進(jìn)行，中間停5），四層紗布抽濾，壓擠法擠出濾液，濾渣放入研缽中，加入25g石英砂，25ml緩沖液于冰浴中研磨（勻漿5），尼龍布過(guò)濾，壓擠法擠出濾液，把兩次濾液合并，4000rpm離心10，取上清液即為粗酶液。1.2.3勻漿浸提法（亦又稱(chēng)勻漿法，但筆者為區(qū)別勻漿法將其稱(chēng)為勻漿浸提法）：將上述不同緩沖液勻漿法所制取的濾液分別取10ml，放置4冰箱中浸提12h，中間攪拌3次，離心（4000rpm）15，取上清液即為粗酶液。1.3PPO酶活性測(cè)定取粗酶液1ml，加2mlpH5.6的0.1檸檬酸鹽緩沖液，加入反應(yīng)混合液3ml（反應(yīng)混合

5、液按0.1檸檬酸鹽緩沖液pH5.6:0.1%脯氨酸:1%鄰苯二酚10:2:3配制）；37恒溫水浴鍋保溫10，立即加入1N偏磷酸0.7ml終止瓜，460nm波長(zhǎng)處用10mm比色皿比色，空白混合液中用檸檬酸鹽緩沖液pH5.6代替鄰苯二酚。酶活性以每分鐘OD460nm增加0.1為1個(gè)活力單位。2結(jié)果與討論2.1提酶方法對(duì)PPO酶活性的影響茶葉酶學(xué)研究中影響酶活性的因素很多，緩沖液的組成、pH值、提酶溫度、茶多酚除盡程度、勻漿方法及浸提等均影響酶的活性。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（表1）可以看出，在提酶溫度、PVP相同的條件下，緩沖液的組成和pH值對(duì)酶活性影響較大，酶活性表現(xiàn)為檸檬酸磷酸鹽緩沖液檸檬酸鹽緩沖液磷酸鹽

6、緩沖液，pH5.6pH5.8，緩沖液pH值和組成不同對(duì)酶活性產(chǎn)生的影響達(dá)一倍；筆者采用緩沖液勻漿浸提法可獲得較同類(lèi)型緩沖液勻漿法高的酶活性，平均高出30%，與劉仲華和Roberts的結(jié)果相一致。同時(shí)，丙酮粉法對(duì)酶活性損失較大，其鮮葉總酶活性?xún)H是緩沖液勻漿法和浸提法的1/5、1/7。很明顯在茶PPO酶活性提取方面，緩沖液勻漿法和勻漿浸提法丙酮粉法具有優(yōu)勢(shì)。茶葉中PPO酶可分為液離態(tài)和束縛態(tài)兩類(lèi)，通常丙酮粉法所得的是PPO總酶活，而勻漿法所得則為可深性酶活性。Tween80增容、鮮葉萎凋和勻漿浸提均有利于洲離態(tài)可溶性酶活性提高。筆者研究的結(jié)果也證實(shí)了勻漿浸提對(duì)PPO酶活性確有提高；從本實(shí)驗(yàn)和過(guò)去的

7、研究可以看出，茶鮮葉中游離態(tài)和部分束縛態(tài)PPO酶以緩沖液勻漿法提取較為有利，一方面由于緩沖液勻漿法體積較大，酶蛋白易于溶出，采用浸提法可使束縛態(tài)的PPO酶部分轉(zhuǎn)化為可溶性的酶溶出，提高PPO酶得率；另一方面緩沖液較接近茶鮮葉細(xì)胞液生理特性，酶溶出后活性損失較小。因此，茶樣品PPO酶活性研究應(yīng)選擇緩沖液勻漿浸提法。表1提酶方法對(duì)酶活性及酶劑活力的影響方法鮮葉(g)酶液體積(ml)酶活性U/ml鮮葉酶活性(U/g)鮮葉總酶活性(U)酶液(粉)單位酶活性檸檬酸鹽緩沖液勻漿法pH5.6勻漿浸提法412h253400.2543.45486.3600.254U/ml0.3314.502112.5400.3

8、31U/ml磷酸鹽緩沖液勻漿法pH5.8勻漿浸提法412h25367.50.1151.69142.2630.115U/ml0.1552.27956.9630.155U/ml檸檬酸磷酸鹽緩沖液勻漿法pH5.6勻漿浸提法412h25356.60.2463.50887.6990.24U/ml0.3014.202107.3070.301U/ml丙酮粉法253.75g0.4060.60915.2254.06U/ml2.2提酶方法對(duì)酶劑活力的影響從鮮葉中提PPO酶的活性方面，丙酮粉法提酶效果最差，但其酶制劑中單位酶活性卻很高，分別是緩沖液法及緩沖液浸提法的1235倍；丙酸粉法酶劑重量較少，僅為緩沖液法及緩沖液浸提法的1/10，因此，丙酮粉法由于操作簡(jiǎn)便、體積小、易于貯存、酶劑活性較高，仍應(yīng)是茶葉PPO酶提取酶制劑較好的方法。作為茶PPO酶的應(yīng)用，酶制劑不僅要考慮酶活性得率，更要著眼酶制劑本身的活性、體積和應(yīng)用性。緩沖液勻漿法雖然提取活性得率較高，但酶液本身活性不高，不得于酶的應(yīng)用，尚需進(jìn)行濃縮、提純才能達(dá)到的應(yīng)用要求；就目前國(guó)內(nèi)條件而言，高活性PPO酶大量的生產(chǎn)尚不具備條件。相對(duì)而言，丙酮粉法雖對(duì)PPO酶提取活性損失較大，活性得