第五章動物細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)

1、第五章第五章 動物細(xì)胞融合與雜交動物細(xì)胞融合與雜交5.1 細(xì)胞融合與雜交細(xì)胞融合與雜交一、概念一、概念v細(xì)胞融合：細(xì)胞融合：兩個或兩個以上相同的細(xì)胞兩個或兩個以上相同的細(xì)胞合并形成一個細(xì)胞的過程。合并形成一個細(xì)胞的過程。v細(xì)胞雜交：細(xì)胞雜交：兩個或兩個以上不同的細(xì)胞兩個或兩個以上不同的細(xì)胞合并形成一個細(xì)胞的過程，包括合并形成一個細(xì)胞的過程，包括種內(nèi)雜種內(nèi)雜交交和和種間雜交。種間雜交。二、原理二、原理 異核體階段異核體階段雜種細(xì)胞形成雜種細(xì)胞形成同核體同核體異核體異核體合核體合核體關(guān)鍵是膜的融合：關(guān)鍵是膜的融合：v兩個親本細(xì)胞并列，細(xì)胞膜接觸兩個親本細(xì)胞并列，細(xì)胞膜接觸v膜組織局部破壞膜組織局部

2、破壞v形成包圍融合細(xì)胞的連續(xù)胞膜形成包圍融合細(xì)胞的連續(xù)胞膜細(xì)胞融合過程可分為：細(xì)胞融合過程可分為：凝集：凝集：細(xì)胞凝集與細(xì)胞膜的糖蛋白有關(guān)細(xì)胞凝集與細(xì)胞膜的糖蛋白有關(guān)蛋白質(zhì)分子重新分布：蛋白質(zhì)分子重新分布：是細(xì)胞融合的必要前提是細(xì)胞融合的必要前提脂質(zhì)分子重排：脂質(zhì)分子重排：是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合的關(guān)鍵是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合的關(guān)鍵胞質(zhì)合并：胞質(zhì)合并：后續(xù)的穩(wěn)定步驟。后續(xù)的穩(wěn)定步驟。1.1.病毒介導(dǎo)融合：病毒介導(dǎo)融合：（1 1）誘導(dǎo)原理誘導(dǎo)原理三、細(xì)胞融合方法三、細(xì)胞融合方法（2 2）操作步驟操作步驟(3) (3) 病毒誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)病毒誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)2.2.化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合（化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合（P107P10

3、7）（1 1）化學(xué)融合劑的種類）化學(xué)融合劑的種類三、細(xì)胞融合方法三、細(xì)胞融合方法（2）PEG誘導(dǎo)的原理誘導(dǎo)的原理 （3 3）PEGPEG誘導(dǎo)的特點(diǎn)誘導(dǎo)的特點(diǎn)sp3雜化，有孤對電子，雜化，有孤對電子，可與可與H2O形成形成H鍵而具鍵而具有強(qiáng)烈的吸水性。有強(qiáng)烈的吸水性。3.電融合技術(shù)電融合技術(shù)三、細(xì)胞融合方法三、細(xì)胞融合方法v電融合的特點(diǎn)電融合的特點(diǎn) 融合頻率高，對細(xì)胞傷害小融合頻率高，對細(xì)胞傷害小正弦交變電場對細(xì)胞的長時間作用會損傷細(xì)胞正弦交變電場對細(xì)胞的長時間作用會損傷細(xì)胞非特異性融合非特異性融合三、細(xì)胞融合方法三、細(xì)胞融合方法磁磁-電融合電融合聲聲-電融合電融合電電-機(jī)械融合機(jī)械融合細(xì)胞化學(xué)

4、聚集融合細(xì)胞化學(xué)聚集融合生物素生物素-抗生物素抗生物素-抗原抗原-抗體橋聯(lián)抗體橋聯(lián)4. 激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合（1）原理：）原理： 光鑷所形成的光學(xué)勢阱會把細(xì)胞拉向光束中光鑷所形成的光學(xué)勢阱會把細(xì)胞拉向光束中心，鉗住細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)了對生物粒子的遠(yuǎn)距離、心，鉗住細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)了對生物粒子的遠(yuǎn)距離、非接觸式捕獲。非接觸式捕獲。（2）特點(diǎn)：）特點(diǎn)： 可對單個核細(xì)胞進(jìn)行操作，但設(shè)備昂貴，操可對單個核細(xì)胞進(jìn)行操作，但設(shè)備昂貴，操作技術(shù)要求高。作技術(shù)要求高。三、細(xì)胞融合方法三、細(xì)胞融合方法5. 微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)（1 1）原理：）原理： 將微通道網(wǎng)絡(luò)整合到生物芯片上

5、，使將微通道網(wǎng)絡(luò)整合到生物芯片上，使得微流控系統(tǒng)成為細(xì)胞融合的理想平臺得微流控系統(tǒng)成為細(xì)胞融合的理想平臺（2 2）特點(diǎn)：）特點(diǎn)： 實(shí)現(xiàn)大量單個成對細(xì)胞的融合實(shí)現(xiàn)大量單個成對細(xì)胞的融合（二）細(xì)胞融合的方法（二）細(xì)胞融合的方法6.6.細(xì)胞融合的影響因素細(xì)胞融合的影響因素v細(xì)胞的種類和性質(zhì)細(xì)胞的種類和性質(zhì) 細(xì)胞表面性質(zhì)細(xì)胞表面性質(zhì) 細(xì)胞種類細(xì)胞種類 親本細(xì)胞的親緣關(guān)系親本細(xì)胞的親緣關(guān)系v融合溫度及融合溫度及PH等環(huán)境條件等環(huán)境條件v離子強(qiáng)度及離子種類離子強(qiáng)度及離子種類三、細(xì)胞融合方法三、細(xì)胞融合方法四、四、 融合子檢出的選擇系統(tǒng)融合子檢出的選擇系統(tǒng)v遺傳互補(bǔ)選擇遺傳互補(bǔ)選擇v營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)選擇營養(yǎng)缺

6、陷型互補(bǔ)選擇v抗性互補(bǔ)選擇抗性互補(bǔ)選擇v形態(tài)特征互補(bǔ)選擇形態(tài)特征互補(bǔ)選擇v生長特性選擇生長特性選擇H, 次黃嘌呤次黃嘌呤; A, 氨基喋呤氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶胸腺嘧啶五、融合子的鑒定方法五、融合子的鑒定方法v細(xì)胞學(xué)鑒定：細(xì)胞學(xué)鑒定：染色體數(shù)目，形態(tài)結(jié)構(gòu)染色體數(shù)目，形態(tài)結(jié)構(gòu)v生化分析：生化分析：同工酶譜為雙親的總和同工酶譜為雙親的總和v分子生物學(xué)鑒定：分子生物學(xué)鑒定：DNA探針探針六、細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用六、細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用v基因定位和人類基因圖譜繪制基因定位和人類基因圖譜繪制v腫瘤免疫的研究：腫瘤樹突狀細(xì)胞疫苗腫瘤免疫的研究：腫瘤樹突狀細(xì)胞疫苗v單克隆抗體的生產(chǎn)單克隆抗體的生產(chǎn)v動物新品

7、種的培育動物新品種的培育5.2 雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù)一、一、B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)原理：原理：細(xì)胞融合細(xì)胞融合+克隆選擇理論克隆選擇理論 Emil von Behring, 1901, antitoxinsGeoreges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibodySusumu Tonegama,1987, structure of Ig geneGerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibodyPaul Ehrlich , 1908, prod

8、uction of antibodyNobel Prize winners免疫球蛋白的免疫球蛋白的單體分子結(jié)構(gòu)單體分子結(jié)構(gòu) 飼養(yǎng)細(xì)胞的作用：飼養(yǎng)細(xì)胞的作用：v提高培養(yǎng)細(xì)胞的密度，使待克隆細(xì)胞容易生提高培養(yǎng)細(xì)胞的密度，使待克隆細(xì)胞容易生存與繁殖。存與繁殖。v腹腔細(xì)胞能清除培養(yǎng)中的死亡細(xì)胞，從而促腹腔細(xì)胞能清除培養(yǎng)中的死亡細(xì)胞，從而促進(jìn)單個細(xì)胞克隆的生長。進(jìn)單個細(xì)胞克隆的生長。v飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放諸如細(xì)胞生長因子類物質(zhì)，飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放諸如細(xì)胞生長因子類物質(zhì)，起到促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖的作用。起到促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖的作用。飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：腹腔巨噬細(xì)胞腹腔巨噬細(xì)胞7. 7. 雜交瘤細(xì)胞的凍存與

9、復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇v目的：目的：保種保種v方法：方法：離心收集雜交瘤細(xì)胞懸液，用含離心收集雜交瘤細(xì)胞懸液，用含10DMSO和和10FBS的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，若短期的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，若短期保存，可置保存，可置-80度冰盒中；若長期保存，則從冰盒度冰盒中；若長期保存，則從冰盒轉(zhuǎn)入液氮中。轉(zhuǎn)入液氮中。v復(fù)蘇：復(fù)蘇：如果凍存的細(xì)胞是來自如果凍存的細(xì)胞是來自96孔板的一孔，復(fù)孔板的一孔，復(fù)蘇后也應(yīng)接種到蘇后也應(yīng)接種到96孔板的一個孔中孔板的一個孔中8.8.單克隆抗體的規(guī)?；a(chǎn)單克隆抗體的規(guī)?；a(chǎn) 主要有兩種方法主要有兩種方法（1 1）體外法：用人工反應(yīng)器大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞）體外法：用人

10、工反應(yīng)器大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞（2 2）體內(nèi)法：用生物體作為細(xì)胞反應(yīng)器大規(guī)模培）體內(nèi)法：用生物體作為細(xì)胞反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)9.9.融合后雜交瘤不生長的原因分析：融合后雜交瘤不生長的原因分析：v聚乙二醇有毒聚乙二醇有毒v小牛血清的質(zhì)量有問題；小牛血清的質(zhì)量有問題；v支原體污染支原體污染vHATHAT有問題有問題10.10.雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體原因分析雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體原因分析 融合后經(jīng)融合后經(jīng)HATHAT選擇有細(xì)胞克隆出現(xiàn)，但不選擇有細(xì)胞克隆出現(xiàn)，但不能篩選出產(chǎn)生特異抗體的雜交瘤，常見原因能篩選出產(chǎn)生特異抗體的雜交

11、瘤，常見原因是：是：v抗體檢測法不夠敏感抗體檢測法不夠敏感vHATHAT選擇失敗選擇失敗v動物免疫不成功動物免疫不成功v染色體丟失和克隆競爭染色體丟失和克隆競爭三、三、T淋巴細(xì)胞雜交瘤淋巴細(xì)胞雜交瘤v概念：概念：T淋巴細(xì)胞亞群經(jīng)有絲分裂原刺激淋巴細(xì)胞亞群經(jīng)有絲分裂原刺激后能分泌多種淋巴因子。將之與胸腺瘤或后能分泌多種淋巴因子。將之與胸腺瘤或淋巴瘤淋巴瘤BW5147株融合而建立的株融合而建立的T淋巴細(xì)淋巴細(xì)胞雜交瘤株。胞雜交瘤株。v淋巴因子：淋巴因子：干擾素、白細(xì)胞介素干擾素、白細(xì)胞介素2、巨噬、巨噬細(xì)胞激活因子等細(xì)胞激活因子等四、抗體的發(fā)展現(xiàn)狀四、抗體的發(fā)展現(xiàn)狀v人鼠型雜交瘤：人鼠型雜交瘤：人

12、淋巴細(xì)胞人淋巴細(xì)胞+鼠骨髓瘤細(xì)胞鼠骨髓瘤細(xì)胞 問題：易丟失人染色體問題：易丟失人染色體v人型雜交瘤：人型雜交瘤：人淋巴細(xì)胞人淋巴細(xì)胞+人骨髓瘤細(xì)胞人骨髓瘤細(xì)胞 問題：問題：尚未獲得理想的瘤系，尚未獲得理想的瘤系， 建株困難，抗體產(chǎn)量太低等建株困難，抗體產(chǎn)量太低等1.人源單克隆抗體人源單克隆抗體2.鼠源單克隆抗體鼠源單克隆抗體v鼠衍生雜交瘤：鼠衍生雜交瘤： 問題：問題：出現(xiàn)人抗鼠抗體反應(yīng)出現(xiàn)人抗鼠抗體反應(yīng) 鼠抗體不能有效激活人免疫系統(tǒng)鼠抗體不能有效激活人免疫系統(tǒng)(1)(1)抗體抗體DNADNA重組重組 通過基因工程技術(shù)用人蛋白取代鼠抗體的通過基因工程技術(shù)用人蛋白取代鼠抗體的恒定區(qū)，仍保留鼠蛋白在

13、抗體中的可變區(qū)，恒定區(qū)，仍保留鼠蛋白在抗體中的可變區(qū)，形成約含有形成約含有65%65%人蛋白的嵌合抗體。人蛋白的嵌合抗體。 問題：問題：含有一定量的鼠蛋白，親和力差，產(chǎn)含有一定量的鼠蛋白，親和力差，產(chǎn)量低，純化費(fèi)用高，臨床效果差量低，純化費(fèi)用高，臨床效果差3.基因工程抗體基因工程抗體人鼠嵌合抗體人鼠嵌合抗體(2)(2)噬菌體表達(dá)技術(shù)噬菌體表達(dá)技術(shù) 用體外基因克隆技術(shù)將用體外基因克隆技術(shù)將B B細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆出來，插入噬菌體表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)。出來，插入噬菌體表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)。問題：問題：沒有經(jīng)過天然抗體成熟，親和力低沒有經(jīng)過天然抗體成熟，

14、親和力低需要相當(dāng)復(fù)雜的抗體基因技術(shù)和多輪篩選才能獲得。需要相當(dāng)復(fù)雜的抗體基因技術(shù)和多輪篩選才能獲得。3.基因工程抗體基因工程抗體(3)(3)外因鼠技術(shù)外因鼠技術(shù) 將小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗體的基因滅活，然后將人的將小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗體的基因滅活，然后將人的抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠早期胚胎，獲得含有人抗體的抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠早期胚胎，獲得含有人抗體的小鼠小鼠外因鼠。外因鼠。 前景：前景：100%100%全人源化單克隆抗體全人源化單克隆抗體 20112011年全球有年全球有7 7種治療性全人單克隆抗體種治療性全人單克隆抗體獲得美國獲得美國FDAFDA和歐盟的批準(zhǔn)，這些全人抗體幾乎完和歐盟的批準(zhǔn)，這些全人抗體幾乎完全由轉(zhuǎn)基

15、因小鼠產(chǎn)生。全由轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生。3.基因工程抗體基因工程抗體五、單克隆抗體的應(yīng)用五、單克隆抗體的應(yīng)用v疾病的診斷或特異性抗原（蛋白）的檢測疾病的診斷或特異性抗原（蛋白）的檢測免疫膠體金快速檢測試紙免疫膠體金快速檢測試紙v疾病的診斷或特異性抗原（蛋白）的檢測疾病的診斷或特異性抗原（蛋白）的檢測v被動免疫治療被動免疫治療v大分子蛋白的提純大分子蛋白的提純v生物導(dǎo)向藥物生物導(dǎo)向藥物五、單克隆抗體的應(yīng)用五、單克隆抗體的應(yīng)用生物導(dǎo)向藥物生物導(dǎo)向藥物H7N9新型流感病毒新型流感病毒雞雞 鴨鴨 野鳥野鳥思考：思考：面對高突變的病毒，面對高突變的病毒，McAb在診斷與治療的過程在診斷與治療的過程中是否顯得力不從心，抗體的未來發(fā)展又該朝向何方？中是否顯得力不從心，抗體的未來發(fā)展又該朝向何方？謝謝各位！謝謝各位！小結(jié)：小結(jié)：v了解細(xì)胞融合的方法和原理，以及各自的優(yōu)缺點(diǎn)。了解細(xì)胞融合的方法和原