AgilentHPLC儀器組成及基本操作步驟

1、Agilent1200HPLC儀器組成及基本操作步驟Agilent1200HPLC結(jié)構(gòu)圖真空脫氣機(jī)：仁手動(dòng)進(jìn)樣器4、柱溫箱（色i普柱:固定相2.輸液系統(tǒng)（四元泵）1.溶劑（流動(dòng)相）一5.檢測(cè)器高效液相色譜法（HPLC：是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，以高壓輸送流動(dòng)相，采用高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器，發(fā)展而成的現(xiàn)代液相色譜分析方法。它具有分離效率高、選擇性好、分析速度快、檢測(cè)靈敏度高、操作自動(dòng)化和應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。一. 溶劑瓶裝置溶劑使用棕色玻璃瓶會(huì)避免藻類的生長(zhǎng)；所用的水為重蒸水；溶劑選用色譜純，使用前要用0.22卩m的過(guò)濾膜過(guò)濾；使用新鮮配制的流動(dòng)相，特別是水溶劑或鹽緩沖液，建議不超過(guò)兩天；避免

2、溶劑瓶暴露在直射陽(yáng)光下。避免使用下述可腐蝕鋼鐵的溶劑：堿金屬鹵化物及其酸溶液（如：碘化鋰、氯化鉀等）；高濃度無(wú)機(jī)酸，如硝酸、硫酸；可能含有過(guò)氧化物的色譜醇醚（如THF二氧六環(huán)、二丙基乙醚）。這些在使用前必須用干燥氧化鋁過(guò)濾除去過(guò)氧化物；含強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液（如EDTA乙二胺四乙酸）；四氯化碳與2-異丙醇或四氫呋喃的混合液。二. 在線脫氣裝置瓶頭部件(G1311-60003)沼刑瓶箱輸出管子央(G1322-S73iXJ)潔詵閥廉潢管(5062-2461)輸出毛細(xì)管至自動(dòng)譴樣器(G1312-67306)MCCV漩絨麼漏管的接頭【50鴕2如6再訂購(gòu)包裝，5m)在線脫氣機(jī)工作原理3M（只赫匹個(gè)制通道中的一

3、個(gè)）真空箱四元泵真空脫氣機(jī)由一個(gè)四通道（有四個(gè)管狀塑料膜）真空箱和一個(gè)真空泵構(gòu)成。打開真空脫氣機(jī)的電源開關(guān)后，控制電路即開啟真空泵，真空泵運(yùn)行使真空箱內(nèi)產(chǎn)生部分真空。真空度由壓力傳感測(cè)定，根據(jù)傳感器信號(hào)，真空脫氣機(jī)通過(guò)運(yùn)行或關(guān)閉真空泵來(lái)維持真空度。溶劑瓶中的溶劑在LC泵的抽動(dòng)下流過(guò)真空箱內(nèi)的特殊管狀塑料膜。當(dāng)溶劑經(jīng)過(guò)真空管時(shí)，溶劑中溶解的氣體將滲透過(guò)塑料膜進(jìn)入真空箱，到達(dá)真空脫氣機(jī)出口時(shí)，溶劑幾乎被完全脫氣而不含有任何氣體。三. Agilent1200四元泵5四蹶縣統(tǒng)打啲23"55當(dāng)鹽溶液和有機(jī)溶劑混合時(shí)，鹽溶液可能與有機(jī)溶劑完全混溶，而不會(huì)出現(xiàn)沉淀。但是在梯度閥的混合點(diǎn)，重力作用使

4、鹽顆粒沉淀下來(lái)。通常，閥的A通道用于水相/鹽溶液，而泵的B通道用于有機(jī)溶劑。如果使用的是這樣的配置，鹽將落回到鹽溶液中，并被溶解。A:水相B:甲醇C:乙腈D:緩沖鹽當(dāng)泵頭安裝有沖洗附件時(shí)，由于該附件中也有密封墊，這樣就會(huì)增加活塞桿運(yùn)動(dòng)時(shí)的阻力。所以開泵前一定要打開seal-wash,用10%異丙醇沖洗泵。10%異丙醇有助于降低水的表面張力，并有抑菌作用。不要用其它溶劑代替。四. 手動(dòng)進(jìn)樣器先使閥處于裝樣(load)位置，用微量注射器將試樣注入貯樣管(samplingloop)。進(jìn)樣時(shí)，轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯至進(jìn)樣(injection)位置，貯樣管內(nèi)的試樣由流動(dòng)相帶入色譜柱。定量環(huán)為20卩l(xiāng)。五. 檢測(cè)器按其

5、適用范圍檢測(cè)器可分為通用型和專屬型兩大類。專屬型檢測(cè)器只能檢測(cè)某些組分的某一性質(zhì)，如紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。通用型檢測(cè)器檢測(cè)的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，如示差折光和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。紫外檢測(cè)器的工作原理是朗伯-比爾定律。紫外檢測(cè)器包括固定波長(zhǎng)、可變波長(zhǎng)和光電二極管陣列檢測(cè)器?？勺儾ㄩL(zhǎng)紫外檢測(cè)器一般采用氘燈為光源，能夠按需要選擇組分的最大吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)，從而提高靈敏度?；静僮鞑襟E實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜋z測(cè)樣品的性質(zhì)，選擇相應(yīng)的分析色譜柱； 配制分析的樣品和流動(dòng)相，選用色譜純流動(dòng)相或用0.22卩m的過(guò)濾膜過(guò)濾(進(jìn)口甲醇和乙腈不用過(guò)濾)； 檢驗(yàn)儀器和

6、計(jì)算機(jī)的電源線，數(shù)據(jù)線是否連接完好。開機(jī) 將所用的通路小心放入試劑瓶中（防止濾頭破裂），色譜柱按流速的方向裝好，要擰緊并在柱頭和柱尾的下面墊上濾紙； 先打開總電源的開關(guān)，然后打開計(jì)算機(jī)的電源，待計(jì)算機(jī)運(yùn)行穩(wěn)定； 從上到下依次打開脫氣機(jī)、泵、柱溫箱、檢測(cè)器的電源開關(guān)； 待儀器自檢完成后，雙擊桌面上的“聯(lián)機(jī)”圖標(biāo)，打開工作站（如圖一所示）設(shè)定參數(shù) 更改樣品信息：?jiǎn)螕暨\(yùn)行控制下的樣品信息彈出對(duì)話框（如圖二所示），更改操作者姓名、子目錄和所存儲(chǔ)的文件的文件名。 設(shè)置試劑瓶的填充量：?jiǎn)螕艚缑嫔系脑噭┢康膱D標(biāo)，設(shè)定溶劑的體積（如圖三所示） 啟動(dòng)各個(gè)模塊：點(diǎn)擊啟動(dòng)泵、柱溫箱的快捷鍵，啟動(dòng)泵和柱溫箱，等柱壓穩(wěn)

7、定后才能啟動(dòng)檢測(cè)器。 設(shè)置柱溫箱：在圖標(biāo)上點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，單擊設(shè)置柱溫箱出現(xiàn)對(duì)話框（如圖四所示）然后設(shè)置實(shí)驗(yàn)所需要的柱溫。 脫氣：?jiǎn)螕舯玫膱D標(biāo)，點(diǎn)擊設(shè)置泵，彈出對(duì)話框（如圖五所示）先將閥旋開12圈，設(shè)置流速為5ml/min,含量為100%依次purge各個(gè)管路，一般先purge水相再purge有機(jī)相。每個(gè)管路purge35分鐘，purge時(shí)一定要認(rèn)真檢查濾頭和管路中是否殘留有氣泡。Purge完后，將流速設(shè)為1ml/min，并迅速將閥擰緊，用100%甲醇或乙腈沖洗柱子，待柱壓穩(wěn)定后可以打開檢測(cè)器。 單擊檢測(cè)器的圖標(biāo)，然后單擊設(shè)置VWD信號(hào)可出現(xiàn)對(duì)話框（如圖六所示），可以設(shè)置所用的波長(zhǎng)。注意：若流動(dòng)

8、相里有緩沖鹽就先用100%甲醇或乙腈沖洗柱子半個(gè)小時(shí)然后還要用95%水和5%純甲醇或純乙腈沖洗柱子最少15分鐘，然后再用你所需要的流動(dòng)相比例走基線。基線穩(wěn)定后就可以進(jìn)樣分析。在對(duì)話框中可以設(shè)置梯度洗脫（如圖八所示）數(shù)據(jù)分析：雙擊桌面上的脫機(jī)圖標(biāo)，出現(xiàn)對(duì)話框然后單擊文件夾圖標(biāo)（如圖九所示）關(guān)機(jī) 樣品分析完后，用100%甲醇或乙腈沖洗柱子最少半個(gè)小時(shí)。如果流動(dòng)相里有緩沖鹽要先用95%水和5%純甲醇或乙腈沖柱子半個(gè)小時(shí)，然后再用100%甲醇或乙腈沖洗柱子半個(gè)小時(shí)。 沖洗完后，將流速設(shè)為Oml/min，將水相中的濾頭放入有機(jī)相中，將閥打開，設(shè)流速設(shè)為5ml/min，含量為100%，purge水相的管路

9、。若用的有緩沖鹽，要先將濾頭放入純水中purge35分鐘，然后再放入有機(jī)相中purge35分鐘。各個(gè)管路purge完后，將閥擰緊。 依次關(guān)閉界面上的泵、柱溫箱和檢測(cè)器。關(guān)閉聯(lián)機(jī)和脫機(jī)的界面，然后關(guān)閉計(jì)算機(jī)。 從下到上依次關(guān)閉儀器的各個(gè)模塊的電源開關(guān)，然后換下色譜柱。 關(guān)閉總電源。注意事項(xiàng)： 配制流動(dòng)相所用的水要為重蒸水，新鮮配制，使用前要用0.22卩m的過(guò)濾膜過(guò)濾。要用色譜級(jí)的有機(jī)試劑。 有機(jī)系和水系的濾膜要分開，有機(jī)系的濾膜也可以過(guò)濾水系，但是水系的濾膜不能過(guò)濾有機(jī)系，有機(jī)相會(huì)腐蝕濾膜。 供試品一定要用0.45卩m的濾頭過(guò)濾，否則會(huì)引起進(jìn)樣閥阻塞。 泵啟動(dòng)前要開啟seal-wash，用10%

10、異丙醇沖洗泵。設(shè)流速為一分鐘三滴，若流動(dòng)相中含有緩沖鹽，設(shè)流速為三秒鐘一滴。 流動(dòng)相使用前要進(jìn)行脫氣，脫氣前一定要將閥打開12圈，purge時(shí)要仔細(xì)檢查濾頭和管路中是否有氣泡，脫氣完后將流速設(shè)為1ml/min后，迅速將閥擰緊（不要擰的過(guò)緊）。注意觀察壓力，若壓力大于10bar，要與管理員聯(lián)系。 一定要將柱頭和柱尾擰緊，防止漏液。如果漏液，將流速設(shè)為0ml/min，然后再將柱子裝好。用100卿醇或乙腈沖洗柱子時(shí)，注意觀察柱壓如果柱壓過(guò)大，要將流速設(shè)為0ml/min，然后檢查原因，防止將臟東西流入檢測(cè)器。 為保護(hù)檢測(cè)器，等柱壓穩(wěn)定后再開啟檢測(cè)器。 進(jìn)樣品前要修改樣品信息，否則會(huì)將上一個(gè)樣品的信息覆

11、蓋。 進(jìn)樣前后都要用甲醇清洗進(jìn)樣針和進(jìn)樣閥。 樣品分析完后，為保護(hù)濾頭，要將水相中的管路放入有機(jī)相中purge35分鐘。為什么溶劑和樣品要過(guò)濾?溶劑和樣品過(guò)濾非常重要，它會(huì)對(duì)色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對(duì)分析結(jié)果的影響。色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。為什么HPLC用緩沖鹽時(shí)要加在線Seal-wash選項(xiàng)？HPLC用緩沖鹽時(shí),由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象,析出的細(xì)小鹽粒非常堅(jiān)硬,它附著在藍(lán)寶石活塞桿上,隨著藍(lán)寶石活塞桿的往復(fù)運(yùn)動(dòng),容易產(chǎn)生劃痕,并磨損密封墊,造成漏液等故障現(xiàn)象。在線Seal-wash選項(xiàng)能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。緩沖鹽的濃度在0.1mol或大于0.1m