引物保護堿基列表--百度文庫

1、11月13日引物合成的詳解4.需要什么級別的引物?答：引物常用的純化方式C18脫鹽，OPC屯化，PAGE屯化，HPLC屯化根據(jù)實驗需要，確定訂購引物的純度級別。應(yīng)用一般PCR擴增一般PCR擴增診斷PCR擴增DNA測序亞克隆，點突變等基因構(gòu)建（全基因合成）反義核酸引物長度要求<45base>45base<40base20base左右根據(jù)實驗要求定根據(jù)實驗要求定根據(jù)實驗要求定修飾引物根據(jù)實驗要求定純度級別要求OPCPAGEOPC,PAGEOPCOPC,PAGE,HPLCPAGEPAGEPAGE,HPLC8 .如何計算引物的濃度?答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。引物一般配制成

2、10-50pmol/ul。一般情況下，建議將引物的濃度配制成50pmol/ul,加水的體積（微升）按下列方式計算：V（微升尸O皺*（乘）33*（乘）*（乘）20000/（除）引物的分子量。引物的分子量可以從合成報告單上獲得。如果需要配制成其他濃度，按上述公式換算。注意：1OD260=33ug/ml.9 .如何計算引物的Tm值？答：引物設(shè)計軟件都可以給出Tm與引物長度、堿基組成、引物使用緩沖的離子強度有關(guān)。長度為25mer以下的引物，Tm計算公式為：Tm=4c(G+C)+2C(A+T)對于更長的寡聚核甘酸，Tm計算公式為：Tm=81.5+16.6xLog10Na+0,41(%GC)-600/si

3、ze公式中，Size=引物長度。11 .如何溶解引物？答：干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前最好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據(jù)計算出的體積加入去離子無菌水或10mMTrispH7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸儲水，因為有些蒸儲水的pH值比較低(pH4-5),引物在這種條件下不穩(wěn)定。12 .如何保存引物？答：引物合成后，經(jīng)過一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。引物在溶解前，室溫狀態(tài)下可以長期保存。溶解后的引物-20度可以長期保存。如果對實驗的重復性要求較高，合成的O膜較大，建議分裝，避免反復凍融。修飾熒

4、光引物需要避光保存。13 .合成的引物5'端是否有磷酸化答：合成的引物5'為羥基，沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核普酸激酶進行5'端磷酸化，或者要求引物合成公司合成時直接在5'或3'端進行磷酸化，需要另外收費。14 .引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？連接反應(yīng)需要引物的5'磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應(yīng)的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結(jié)構(gòu)，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？答

5、：引物合成時，每一步反應(yīng)效率都不能達到100%產(chǎn)生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCRT增，不可能絕對保證擴增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%E確。要知道，引物合成中發(fā)生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCRT增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。19. TaqMan探針設(shè)計的基本原則是什么？答：下列原則供您參考。 TaqMan探針位置盡可能靠近擴增引物（擴增產(chǎn)物50-150bp）,但不能與引

6、物重疊。 長度一般為18-40mer。 G-C含量控制在40-80%左右。 避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGG豉更多G出現(xiàn)。 在引物的5'端避免使用G選用比較多的堿基Co 退火溫度Tm控制在68-70C左右有用的熒光染料參數(shù)Name吸收波長發(fā)射波長colors6-FAM(6-carboxy-fluorescein)494nm518nmGreenTET(5-tetrachloro-fluorescein)521nm538nmOrangeHEX(5-hexachloro-fluorescein)535nm553nmPinkTAMRA(tetramethyl-6-carboxyrho

7、damine)560nm582nmRoseROX(6-carboxy-x-rhodamine)587nm607nmRedCy3(Indodicarbocyanine)552nm570nmRedCy5(Indodicarbocyanine)643nm667nmViolet20.Primer設(shè)計的基本原則是什么?答：引物設(shè)計的下列原則供您參考。 引物長度一般在18-35mer。 G-C含量控制在40-60%左右。 避免近3'端有酶切位點或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 如果可能避免在3'端最后5個堿基有2個以上的G或C。 如果可能避免在3'端最后1個堿基為A。 避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要

8、避免GGG豉更多G出現(xiàn)。 退火溫度Tm控制在58-60C左右。 如果是設(shè)計點突變引物，突變點應(yīng)盡可能在引物的中間。21 .為什么引物的OD260/OD28。、于1.5?答：引物應(yīng)該全是DNA但是OD260/OD280勺比值為什么那么低，怎么會有蛋白質(zhì)污染？引物化學合成，哪里有機會污染到蛋白質(zhì)？需要指出的是OD260/OD280勺比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280勺比值過低一般是由于引物中C/T的含量比較高所致。下表是一個20mer同聚體引物的OD260/OD280勺比值，清楚表明OD260/OD280勺比值與弓I物的堿基組成密切相關(guān)。A260/280ratiosofCrude2

9、0-merOligosofDifferingBaseCompositionsBaseCompositionA260/2805-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-32.505-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-31.855-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-31.155-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-31.145-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-31.6622 .同樣的OD用PAGE僉測，EB染色為什么深淺不一？答：通常可以用EB染色的方法來判斷雙鏈DNA勺量（如質(zhì)粒DNA）,因為EB可以嵌合到雙鏈DNAK而合成的單鏈DNA由于堿基組成不同，形成二級

10、結(jié)構(gòu)的可能性不同，EB的染色程度也會有差異，比如Oligo（dT）等不形成二級結(jié)構(gòu)，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。同樣道理，用EB染色來照片不適合所有引物。23 .引物不純會有什么后果？答：引物不純可能會導致：1）非特異性擴增；2）無法用預(yù)先設(shè)計在引物5'端酶切位點的酶切開，特別是沒有保護堿基的引物；3）用于測序出現(xiàn)雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。24 .已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了？答：如果溶解引物的水PH過低或污染了菌或核酸酶，會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引物加

11、入量不準確。建議分裝引物，避免反復凍溶。建議使用10mMTrispH7.5緩沖液溶解引物，因為有些蒸儲水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩(wěn)定。還有一種可能性是引物沒有問題，而是PCR®用材料特別是模板的質(zhì)量與先前使用的不完全一致。25 .PCR擴增不出就引物有問題嗎？答：基本不是。當今發(fā)展出各色各樣的PCFT增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決PCRT增中遇到的擴不出、擴增效率低的問題。如巢式PC就是擴增那些拷貝數(shù)很低的基因片段。有些重復片段的擴增，GC含量高的片段，非要采用特殊擴增手段才能擴增出了。引物擴增不出，主要是下列兩種情況比較常見（1）RT-PCR請注意

12、，很多基因通過常規(guī)RT-PCRT法是很難擴增出來的。RT-PCR成功的關(guān)鍵在于RT的反應(yīng)的RN質(zhì)量和目標基因在特定組織和細胞中含量。（2）從基因組中擴增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴格控制用量?；蚪MDNAi高，會影響反應(yīng)體系中的Mg和pH。16:14|添加評論|固定鏈接|寫入日志%ChainCleavageEnzymeOligoSequence,X1保護堿基列表hrAccIGGTCGAC800CG9TCGASG1000CCGTCGACGG1200AflIIICACATGT800CCACATGTG10>90>90CCACATGGGG12>90&g

13、t;90Length2hr20AscIGGCGCGCC8>90>90AGGCGCGCC10>90>90口GGCGCGCC12>90>90AvalCCCCGGG850>90C(CCCG(GG10>90>90TC(CCCG(GGA12>90>90BamHICGGATCC81025CG3GATCC310>90>90CGGGATCGCG12>90>90BglllCAGATCT800GAAGATCTC1075>90GGAGATCTCC1225>90BssHIIGGCGCGC800AG3CGCGXT100

14、0TTG3CGCGAA1250>90BstEIIGGGT(A/T)ACC9010BstXIAACTGCAGAAAATGCATTGG2200AAAACTGCAGAATGCATTGG242550CTGCAGACAATGCATTGGCAT2725>90ClaICATCGAT800GATCGAT800CCATCGATG10>90>90CCATCGATGG125050EcoRIGGAATTC8>90>90CG3AATTCG10>90>90CCGGAATTCGG12>90>90HaeIIIGG3GCCCC8>90>90AGGGCCCT

15、10>90>90TTGGGCCCAA12>90>90HindIIICAAGCTT800CCAAGCTTG1000CCAAGCTTGG121075KpnIGGGTACC800GGTACCC10>90>90CGGGTACCCG12>90>90MluIGACGCGT800C6CGCGCG102550NcoICCCATGG800CATGCATGCATG145075NdelCCATATG800CCATATGG1000CGCATATGCG1200GGGTTTATATAAACCC1800GGAATTCATATGAATTCC2075>90GGGAATCAT

16、ATGAATTCCC2275>90NhelGGCTAGC800CG3CTAGC3101025CTAGCTAGKAG121050NotlIIGCGGCCGC1200AllGCGGCCGCA161010AAATAGCGGCCGCTAAA201010ATAAGAACGGCCGAAACTAT242590AAGGAAAAAAGGCCGAAAGGAAAA2825>90NsilTGCATGCATCA1210>90CCATGCAT3GTTCTGCAGTT22>90>90PaclTTAATTAA800GTTAATTAA10025CCTTAATTAAG120>90PmelGTH

17、AAAC800GGTTTAAAC10025G(GIIIAAACC12050AGCIIGIIIAAACGCGCGCCGG2475>90PstlGCTGCAG800TGCCTGCATGCA141010AACTGCAAACCAATGCATTGG22>90>90AAA&TGCASCAATGCATTGGAA24>90>90CTGCAAACCAATGCATTGGATGCAT2600PvulCCGATCG800ATCGATCAT101025TCGATCCGA12010SaclCGAGCTC81010SacllGCCGCGG800TCCCGCGISA1250>90S

18、allGTCGACTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800GG3TCGACTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG301050ACGGTCGACTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA321075SealGAGTACT81025AAAAGTACnTT127575SmalCCCGGG6010CCCCGGG8010CCCCGGIS101050TCCCCGGG12>90>90SpelGACTAGCTG(ACTAGCTCCGACTAGTCGCTAACTAGTTAGSphlStulGGCATGCCATGCATGATGACAGCATGATGTAAGGCCTTGAAGGCCTCAAAAGG