拉曼與紅外光譜在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用

1、現(xiàn)代儀器分析技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用摘要：結(jié)構(gòu)生物學(xué)是以生物大分子結(jié)構(gòu)及其運(yùn)動的測定為基礎(chǔ)來闡明生命現(xiàn)象的科學(xué)。序列-空間結(jié)構(gòu)-功能是提出的結(jié)構(gòu)生物學(xué)中心法則。也就是說生物大分子三維結(jié)構(gòu)測定是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的核心，其主要層次是三維結(jié)構(gòu)。而對任何生物大分子發(fā)揮生物功能認(rèn)識上的突破必然是建立在對其三維結(jié)構(gòu)闡明的基礎(chǔ)上。目前對大分子結(jié)構(gòu)的解析的手段主要都是建立在紅外光譜、紫外光譜、拉曼光譜、X-射線衍射以及核磁共振的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。這里主要介紹紅外光譜、拉曼光譜、X-射線衍射以及核磁共振在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的運(yùn)用。關(guān)鍵詞：結(jié)構(gòu)生物學(xué)；紅外光譜；紫外光譜；拉曼光譜；X-射線衍射；核磁共振AbstractStr

2、ucturalbiologyisabranchofsciencethatisbasedonthemeasurementofstructureofbiomacromoleculeanditsaction.Sequence,spacialstructureandfunctioniscentralprincipleofstructuralbiologyproposedbyPetsko.Namely,themeasurementsofthree-dimensionalstructureofbiomacromoleculeisthecoreproblemsofstructuralbiology,thei

3、mportantpartisthreedimensionalstructure.Thereisonexceptionthatanycognitonofbiomacromoleculemustbeonthefoundationof川uminatingthree-dimensionalstructure.Currently,thebasedmethodsofmeasurementisinfraredspectroscopy,ultravioletspectrum,Ramanspectrum,X-raydiffractionandnuclearmagneticresonance.Hence,infr

4、aredspectroscopy,ultravioletspectrum,Ramanspectrum,X-raydiffractionandnuclearmagneticresonancewillbecoveredinthisarticle.Keywords：structuralbiology;infraredspectroscopyultravioletspectrum；Ramanspectrum；X-raydiffraction；nuclearmagneticresonance1引言1.1 結(jié)構(gòu)生物學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)一直是分子生物學(xué)的重要組成部分，由于近年來的飛速發(fā)展，它已成為分子生物學(xué)的前沿和

5、主流，并且從當(dāng)前的發(fā)展趨勢來看必將成為整個生命科學(xué)前沿和帶頭學(xué)科之一。在人類完成人類基因組工作草圖繪制后，生命科學(xué)進(jìn)入后基因時代，結(jié)構(gòu)生物學(xué)將處在具有戰(zhàn)略性的關(guān)鍵地位，在人類基因組測定之后，將進(jìn)一步集中研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，特別是蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，這是揭示基因組功能的基本途徑。結(jié)構(gòu)生物學(xué)自誕生之日起，就以最直觀、最可靠的特點(diǎn)成為人們研究和揭示生命活動微觀分子機(jī)理的強(qiáng)大武器。經(jīng)過近四五十年的發(fā)展，結(jié)構(gòu)生物學(xué)融合了X光衍射、NMR、電子顯微鏡、原子力顯微鏡、分子光譜等一大批生物物理和生物化學(xué)的技術(shù)手段，實(shí)現(xiàn)了從早期的單一分子結(jié)構(gòu)測定向研究大分子復(fù)合物功能與結(jié)構(gòu)關(guān)系的跨越，進(jìn)一步的系統(tǒng)生物學(xué)、細(xì)胞

6、生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等分支學(xué)科間的交叉融合，細(xì)胞成像等技術(shù)的滲透，使得結(jié)構(gòu)生物學(xué)家們開始思考和解決新的問題。單分子化學(xué)和三維重構(gòu)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的重點(diǎn)在于對生物大分子的研究，那么結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方法的進(jìn)展尤其是生物大分子研究方法的研究就顯得猶為重要。1.2 現(xiàn)代儀器分析技術(shù)現(xiàn)代儀器分析的方法很多，按照測量過程中所觀測的性質(zhì)進(jìn)行分類，可分為光學(xué)分析法、電化學(xué)分析法、色譜分析法、質(zhì)譜分析法、熱分析法、放射化學(xué)分析法和電鏡分析法等；而現(xiàn)代儀器分析所采用的分析儀器是化學(xué)、光學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)、機(jī)械及計(jì)算機(jī)科學(xué)等現(xiàn)代科學(xué)綜合發(fā)展的產(chǎn)物。而它在生命科學(xué)的運(yùn)用已不可或缺，自上世紀(jì)70年代以來，世界各發(fā)達(dá)國家都將生命科

7、學(xué)及其有關(guān)的生物工程列為科學(xué)研究中最優(yōu)先發(fā)展的領(lǐng)域，在歐、美、日等地區(qū)和國家具有戰(zhàn)略意義的宏大研究規(guī)劃“尤利卡計(jì)劃”，“人類基因圖”及“人體研究新前沿”中，生物大分子的結(jié)構(gòu)分析研究都占據(jù)重要的位置。當(dāng)前采用以色譜、質(zhì)譜、核磁共振、熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光和免疫分析以及化學(xué)傳感器、生物傳感器、化學(xué)修飾電極和生物電分析化學(xué)等為主體的各種分析手段，不但在生命體和有機(jī)組織的整體水平上,而且在分子和細(xì)胞水平上來認(rèn)識和研究生命過程中某些大分子及生物活性物質(zhì)的化學(xué)和生物本質(zhì)方面，已日益顯示出十分重要的作用。1.3 結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的方法結(jié)構(gòu)生物學(xué)的主要方法和技術(shù)基礎(chǔ)全部來自現(xiàn)代物理、化學(xué)和數(shù)學(xué)的最新發(fā)展，尤其是物

8、理學(xué)新的方法和技術(shù)。因此很多結(jié)構(gòu)生物學(xué)家之前都是物理學(xué)家，在這之中薛定川的思想在生物學(xué)界具有巨大的影響力，影響了幾代生物學(xué)家，其中DNA結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)者沃森和克里克就是一個典型的例子。總得來說，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的主要研究方法有紅外光譜、拉曼光譜、X-射線衍射以及核磁共振，當(dāng)然也有電子顯微學(xué)方法，但在此處不做介紹。2紅外光譜的結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用紅外光譜在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用主要是傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）的運(yùn)用，F(xiàn)TIR具有掃描速度快、光通量大、高分辨率、高信噪比、測定光譜范圍寬的特點(diǎn)，并配備有功能很強(qiáng)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，因而已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)研究。止匕外，傅里葉變換紅外光譜儀能在

9、分子水平上直接了解所研究分子或體系的結(jié)構(gòu)，得到基因生物功能信息；更重要的是紅外光譜樣品三態(tài)均可，用量少，不破壞樣品結(jié)構(gòu)，所以它即可以研究樣品的表面結(jié)構(gòu)，又可以研究樣品的整體結(jié)構(gòu)。因而，傅立葉變換紅外光譜儀的發(fā)展實(shí)現(xiàn)了由化學(xué)領(lǐng)域發(fā)展到分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，從離體分析發(fā)展到在體無損分析1。此外，紅外光譜學(xué)已從二維紅外光譜學(xué)發(fā)展為三維紅外光譜學(xué)，即二維紅外光譜和時間分辨光譜。我們都知道生物大分子在行使其功能時不是處于靜止的狀態(tài)，而是在不斷運(yùn)動之中，所以僅知道其結(jié)構(gòu)無法闡釋這些生物大分子的功能。時間分辨光譜學(xué)，又稱頻閃光譜學(xué)，它是將光譜儀器的快速多重掃描功能和計(jì)算機(jī)快速采集、處理數(shù)據(jù)的功能相結(jié)

10、合，從而運(yùn)用在與時間有關(guān)的領(lǐng)域20時間分辨光譜主要研究物理或化學(xué)變化的中間過渡過程，即隨時間的瞬變過程。我們都知道，在人類完成人類基因圖譜之后，生物學(xué)進(jìn)入了后基因組時代，人們不在研究單一的基因而是要解釋這些基因的功能，而基因的功能在很大程度上是有蛋白質(zhì)分子體現(xiàn)出來的，雖然有很多的基因是以RNA的形式發(fā)揮其功能的，但最終都是在生物大分子上體現(xiàn)基因的功能?；虻墓δ芏际且源蠓肿又g相互作用的方式體現(xiàn)出來，要解釋這些相互作用的方式，這些生物大分子的結(jié)構(gòu)解析以及在時間上的結(jié)構(gòu)變化顯得尤為重要。這里主要介紹紅外光譜在蛋白質(zhì)中的運(yùn)用。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)以及二級結(jié)構(gòu)的一些功能一直是生化學(xué)家和結(jié)構(gòu)生物學(xué)家研究的

11、熱點(diǎn)。由于二維紅外光譜學(xué)在具有很好的分辨率，因而它在蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)研究上具有巨大的優(yōu)勢。二維紅外光譜對蛋白二級結(jié)構(gòu)研究的主要內(nèi)容是利用二維相關(guān)譜，對它們的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，以及它們的二級結(jié)構(gòu)在溫度、壓力等外界因素變化時發(fā)生的改變。但是在研究蛋白的二級結(jié)構(gòu)時，尤其是酰胺I帶，酰胺II帶以及酰胺I'帶時會面臨譜峰嚴(yán)重重疊的問題，傳統(tǒng)的紅外光譜法只能采用分峰等數(shù)學(xué)方法加以解決，不過如果采用二維相關(guān)譜這些問題將會得到解決。此外，在研究的過程中，蛋白質(zhì)每一種構(gòu)象中的氨基官能團(tuán)上的質(zhì)子，與笊交換的速度是不一樣的，所以為了激發(fā)樣品比較好的一種方法是采用氫-笊交換3。3拉曼光譜在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用1

12、928年印度物理學(xué)家拉曼和克利希南在研究單色光在液體中散射時，不僅觀察到與入射光頻率相同的瑞利散射，而且還發(fā)現(xiàn)兩側(cè)有強(qiáng)度很弱，且與入射光頻率不同的散射光譜，這便是拉曼光譜。拉曼光譜和吸收光譜不同，拉曼光譜研究被樣品散射的光，而不是吸收或發(fā)射的光。在結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究中，人們通常采用X射線晶體學(xué)方法測定大分子的結(jié)構(gòu)，然而這將會面臨一系列的問題，因?yàn)閄射線晶體學(xué)研究的對象是晶體，但很多生物大分子很難結(jié)晶，甚至無法得到晶體。此外，在生物大分子的結(jié)構(gòu)中往往從一個區(qū)域到另一個區(qū)域常存在結(jié)構(gòu)變化，這對常規(guī)的X射線晶體學(xué)方法是很棘手的，然而，如果利用拉曼光譜對其研究就不會存在這些問題4。大分子的正常結(jié)構(gòu)是維持

13、生命體正常功能的前題。而拉曼效應(yīng)可以包含原子的位置、電子的分布以及分子間的相互作用，它是研究分子結(jié)構(gòu)與功能最有效的方法之一。止匕外，激光共振拉曼光譜的靈敏度、所需樣品的量少，而且可以得到大量的結(jié)構(gòu)信息；它可對大分子的不同色團(tuán)選擇性共振激發(fā)，而且相互間不會受到影響。生物大分子的振動頻率非常復(fù)雜，振動頻率與分子中固定的分子群體中的幾何分布和鍵的配置有關(guān)，而且它們能反應(yīng)分子間的相互作用，分子的這些特性便可影響分子的拉曼光譜5。一般而言，超純的核酸或蛋白質(zhì)有30-40條拉曼光譜線出現(xiàn)在300-170瞅數(shù)范圍內(nèi)，因而它可獲得核酸的有序結(jié)構(gòu)、堿基堆積以及蛋白質(zhì)的主鏈構(gòu)象：a-螺旋、,折疊、回折結(jié)構(gòu)、無規(guī)則

14、卷曲、側(cè)鏈殘基的構(gòu)型和所處環(huán)境等信息6。4X-射線衍射在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用直到現(xiàn)在，單晶X射線衍射法是測定包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的生物大分子結(jié)構(gòu)的最常用、最基本的方法之一。它的特點(diǎn)是所研究的對象是晶體，所以在一定程度上存在局限性,尤其是對生物膜蛋白結(jié)構(gòu)的解析，很多膜蛋白極難得到可運(yùn)用于單晶X射線衍射的晶體，到目前為止，也只有數(shù)個膜蛋白得到中等程度分辨率的結(jié)構(gòu)。但是，同步輻射光源的運(yùn)用，極大地體現(xiàn)出它的意義；同時因?yàn)橥捷椛涔庠戳炼群蜏?zhǔn)直性高，而且光譜分布寬，這極大地促進(jìn)了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展。漢堡的DESY同步輻射實(shí)驗(yàn)室Rosenbaum于1971年最早運(yùn)用同步輻射光源對肌肉進(jìn)行X射線衍射研究70于此同時

15、，不少科學(xué)家利用同步輻射對蛋白質(zhì)品進(jìn)行研究，并在斯坦福的SPEAR上進(jìn)行了早起的嘗試8,90預(yù)計(jì)在以后的時間里，在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域，單晶X射線衍射法依舊是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的主要方法之一。5核磁共振在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用核磁共振（NMR）是指核磁矩不為零的原子核，在外磁場的作用下，核自旋能級發(fā)生塞曼分裂，共振吸收特定頻率的射頻輻射的物理過程。與其它光譜學(xué)方法相比，核磁共振的優(yōu)點(diǎn)是可以探測到每一個原子的共振頻率。核磁共振波譜技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用很廣，可以用來研究生物高分子及其復(fù)合物在溶液中的三維結(jié)構(gòu)和功能；研究動態(tài)的生物大分子之間以及與配基的相互作用；研究生物大分子的動態(tài)行為；除此之外還可用固體核磁

16、共振或液體核磁共振技術(shù)研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能10。它最大的優(yōu)點(diǎn)是分辨率高，同時可以獲得大量的分子結(jié)構(gòu)信息，最重要的是它可以獲得生物大分子在時間上的動態(tài)信息。但它也有自己的缺點(diǎn)，隨著所研究的生物分子量的增大，其共振峰數(shù)目增多，分子運(yùn)動相關(guān)時間變長，橫向弛豫時間變短，因?yàn)榫€寬與橫向弛豫時間的倒數(shù)成正比，所以隨著分子量的增加，其譜峰增寬，這給譜峰認(rèn)證帶來很大的困難。但是核磁共振波譜技術(shù)在結(jié)構(gòu)生學(xué)中依舊占據(jù)著很高的位置，其優(yōu)勢不可替代。6結(jié)論與展望自人類完成人類基因組計(jì)劃之后，生命科學(xué)步入了后基因組時代，即解析基因的功能。然而基因的功能表現(xiàn)為大分子的行為，而大分子的行為與其結(jié)構(gòu)有著密不可分的關(guān)系，因此

17、可以說大分子的行為是其結(jié)構(gòu)在空間上的變化。要解析這些分子結(jié)構(gòu)和行為，就表現(xiàn)為對儀器和技術(shù)的運(yùn)用，而現(xiàn)代儀器分析技術(shù)為此提供了良好的分析平臺。但現(xiàn)代的科學(xué)不再是單一的分析科學(xué)，而是綜合解析的科學(xué)，所以對結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究不僅需要單一技術(shù)的突破，還需要多種分析技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用，所以可以說結(jié)構(gòu)生物學(xué)是生物分子結(jié)構(gòu)與現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的產(chǎn)物。參考文獻(xiàn)1吳建光.近代傅立葉變換紅外光譜技術(shù)及應(yīng)用(上冊)M.北京：科學(xué)出版社,1994,12:171-1772王琪,胡鑫堯.三維光譜學(xué)-二維紅外光譜和時間分辨光譜(J).光譜學(xué)與光譜分析,2000,20(2):175-1793AnneNabetetal.AppliedSpectroscopy,199