蛋白濃度的測定 ppt課件

1、張亞東 譚理 經(jīng)過實驗使學生掌握蛋白質(zhì)濃度測定的三種方法的原理、實驗步驟 了解改良lowry法、Coomassie亮藍法、紫外分光光度法測定蛋白濃度的區(qū)別、優(yōu)缺陷以及適用范圍。 改良Lowry法 在堿性條件下蛋白質(zhì)的肽鍵與Cu2+螯合，構(gòu)成蛋白質(zhì)-銅復合物。雙縮脲反響 蛋白質(zhì)分子中帶有酚基的酪氨酸極易使酚試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸復原，生成鉬藍-鎢藍藍色化合物，藍色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。利用藍色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比的關(guān)系可繪制規(guī)范曲線，測定樣品中蛋白質(zhì)含量。復原反響改良改良lowry法的原理圖法的原理圖650nm Coomassie亮藍法 Coomassie亮藍G250能與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域結(jié)合

2、，這種結(jié)合具有高度敏感性，G250與蛋白質(zhì)構(gòu)成的復合物成藍色，在595nm處有最大吸收峰，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系，經(jīng)過建立規(guī)范曲線可測定未知蛋白濃度。 紫外分光光度法 有些蛋白質(zhì)組成中常含有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm處有最大吸收峰，故可根據(jù)280nm處的吸光度的大小來測定這類蛋白質(zhì)的含量。 在生物樣品中還能夠會含有核酸等成分，在280nm處也有吸收，它的最大吸收峰在260nm可經(jīng)過閱歷公式排除核酸的影響 蛋白質(zhì)濃度1.45A2800.74A260 波長 260 280 改良改良Lowry法法編 號123456測定管蛋白含量ug/ml17.535701051400

3、未知標準溶液、樣品ml1.01.01.01.01.0-1.0生理鹽水ml-1.0-試劑Aml0.90.90.90.90.90.90.9 混勻后置于50度水浴中保溫10分鐘，冷卻 室溫放置10分鐘 立刻混勻，置于50度水浴中保溫10分鐘，冷卻后在650nm處比色試劑Bml0.10.10.10.10.10.10.1試劑Cml3.03.03.03.03.03.03.0改良改良Lowry法蛋白質(zhì)濃度測定法蛋白質(zhì)濃度測定制備規(guī)范曲線，根據(jù)測定管的OD650nm值計算未知蛋白質(zhì)濃度 Coomassie亮藍法亮藍法管 號 123456測定管蛋白質(zhì)含量ug/ml50025012562.531.250未知標準溶

4、液ml0.10.10.10.10.1生理鹽水ml0.1樣品ml0.1染液ml5555555制備規(guī)范曲線，根據(jù)測定管的OD595nm值計算未知蛋白質(zhì)濃度 紫外分光光度法紫外分光光度法 取待測樣品稀釋液，以蒸餾水為對照，在紫取待測樣品稀釋液，以蒸餾水為對照，在紫外分光光度計上分別測定外分光光度計上分別測定OD280nm和和OD260nm的吸光度值，根據(jù)閱歷公式計算蛋的吸光度值，根據(jù)閱歷公式計算蛋白濃度白濃度 蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度1.45A2800.74A260 比色法是常用的測定濃度的方法，其關(guān)鍵點在于規(guī)范曲線的制備一定要準確。規(guī)范樣品的配置濃度能否準確直接影響實驗的結(jié)果，因此要正確掌握加樣槍、移液