實(shí)驗(yàn)八感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化1

1、實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八 感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?1、了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。 2、學(xué)習(xí)用氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法。 3、學(xué)習(xí)外源DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細(xì)胞的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株(R，M)，這些變異株可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。 受體細(xì)胞經(jīng)過一些化學(xué)試劑如CaCl2、 RbCl等處理后，細(xì)胞膜的通透性會發(fā)生暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞

2、。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。 三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料 E. coli DH5菌株： R-，M-，Amp- 實(shí)驗(yàn)七的連接產(chǎn)物（pET32 和 PCR產(chǎn)物）和pET32-CaM5四、試劑四、試劑 1、含Amp的LB固體、液體培養(yǎng)基 2、0.05 mol/L CaCl2溶液五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟 1、受體菌的培養(yǎng)受體菌的培養(yǎng) 從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5單菌落，接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中，37下振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37振

3、蕩培養(yǎng)2-3h至OD600 =0.5左右。 2、感受態(tài)細(xì)胞的制備、感受態(tài)細(xì)胞的制備 （ CaCl2 法）法）吸取1.5mL培養(yǎng)液到一滅菌的離心管中，將離心管插入冰中放置10min，然后于4下10 000 rpm離心10min。棄去上清，用1mL預(yù)冷的0.05mol/L CaCl2 溶液輕輕懸浮細(xì)胞，將離心管插入冰中放置30min，4下10 000rpm離心10min。棄去上清，加入100 l預(yù)冷的0.05mol/L CaCl2 溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰中放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞。3、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 向制備的感受態(tài)細(xì)胞中加入10l連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，插入冰中，放置30min。(一位同學(xué)) 向制備的感受態(tài)細(xì)胞中加入1l質(zhì)粒，輕輕搖勻，插入冰中，放置30min。（另一位同學(xué)）含有混合物的離心管置入42水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速插入冰中，冷卻3-5min。向離心管中加入900 l LB液體培養(yǎng)基，混勻后37振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。4、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的涂布、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的涂布 將復(fù)壯后的全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化菌液和300l質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布于篩選培養(yǎng)基表面，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿（不要過干，以倒扣皿時菌液不向下流為準(zhǔn)），37過夜培養(yǎng)。 同時做一個對照同時做一個對照: