呼吸道九聯(lián)檢sop

1、呼吸道九聯(lián)檢操作程序1、 呼吸道感染概述呼吸道感染是指病原體感染人體的鼻腔、咽喉、氣管和支氣管等呼吸系統(tǒng)。分為上呼吸道感染和下呼吸道感染，上呼吸道感染常見的是急性上呼吸道感染(acute upper respir tract infection )，指鼻腔、咽或喉部急性炎癥的概稱，是呼吸道最常見的一種傳染病。常見病因為病毒，少數(shù)由細(xì)菌引起?；颊卟环帜挲g、性別、職業(yè)和地區(qū)。不僅具有較強(qiáng)的傳染性，而且可引起嚴(yán)重并發(fā)癥。下呼吸道感染是最常見的感染性疾患，包括急性氣管支氣管炎、慢性支氣管炎、肺炎、支氣管擴(kuò)張等，由病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體、軍團(tuán)菌等微生物引起，其防治應(yīng)遵循預(yù)防為主、準(zhǔn)確診斷、及時治療的

2、原則，治療時必須明確引起感染的病原體以選擇有效的抗生素。2、 免疫熒光法介紹免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique )又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941 年首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)(fluorescent antibody technique )。 用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；

3、用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定

4、的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。但近年來發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，已經(jīng)很好改善了這些缺點(diǎn)，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，應(yīng)用在臨床檢驗中。1 原理免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原- 抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。其根據(jù)反應(yīng)體系的不同可分為：直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢

5、。間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原抗體抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后定量方法的不同可分為：熒光抗體技術(shù)（熒光顯微鏡技術(shù) ） ：抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。免疫熒光測定技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法。2 . 熒光物質(zhì)許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生

6、明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。所用熒光物質(zhì)介紹：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate ， FITC）：為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4， 最大吸收光波長為490 495nm，最大發(fā)射光波長520 530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。3、 呼吸道九聯(lián)檢產(chǎn)品介紹九項呼吸道感染病原體IgM 抗體檢測試劑盒，采用間

7、接免疫熒光法（IFA），同時檢測人血清中呼吸道感染主要病原體的IgM 抗體，可檢的病原體包括：嗜肺軍團(tuán)菌血清1 型、肺炎支原體、Q熱立克次體、肺炎衣原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、 2 和 3 型。用于呼吸道感染疾病的輔助診斷。1. 檢測原理間接免疫熒光法（IFA）（圖1）是基于待測樣本中的抗體與吸附在載玻片上的抗原發(fā)生的反應(yīng)。樣本中存在的特異性抗體和抗原反應(yīng)，未與抗原結(jié)合的免疫球蛋白在洗滌步驟中除去。在下一步驟中，抗原-抗體復(fù)合物與熒光素標(biāo)記的抗人球蛋白反應(yīng)，用免疫熒光顯微鏡觀察結(jié)果。圖1圖 1：九項呼吸道感染病原體IgM 抗體檢測試劑盒檢測原理2.

8、試劑盒組成及用途組分成分和用途載玻片檢測的物理載體，覆有聚四氟乙烯并包被有針對檢測 物的特異性抗原，包裝袋內(nèi)有一袋硅膠以防潮。質(zhì)控品用于證明試劑盒及試驗的有效性，含有人血清及防腐 劑。吸附劑羊抗人IgG 用來吸附人IgG避免干擾IgM 檢測，含有防腐劑。FITC結(jié)合物熒光素標(biāo)記的抗人免疫球蛋白結(jié)合物，含有染色液、 防腐劑和蛋白穩(wěn)定劑。和抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)，并顯 色。封閉介質(zhì)甘油緩沖液，便于觀察。磷酸鹽緩沖液 (PBS)用于洗滌步驟，從反應(yīng)介質(zhì)中除去未結(jié)合的免疫球蛋 白和結(jié)合物。3. 操作步驟3.1 實驗前準(zhǔn)備1)實驗所需物品準(zhǔn)備：1000ml量筒、 1000ml燒杯、離心管、微量移液器、溫育濕

9、盒、洗瓶、水平搖床、恒溫箱、蓋玻片、熒光顯微鏡。2) PBS洗液的準(zhǔn)備：將1 瓶 PBS粉末倒入燒杯中，加入1L蒸餾水中，搖勻直至完全溶解，配好后儲存在2-8o C備用。3)使用前，將所有試劑平衡至室溫，將恒溫箱調(diào)至37。3.2 實驗步驟1) 樣本的稀釋：按 1:1 比例稀釋血清標(biāo)本，即 15 L血清加入15 L PBS中。陰陽性對照不需要稀釋。2)用吸附劑處理稀釋后的血清：將30 L 稀釋后的血清加入150 L吸附劑中，徹底混勻。陰陽性對照不需吸附劑處理。處理后的血清要離心 10-15 分鐘除去沉淀，以防干擾檢測。3）在載玻片的每孔中加15 L 吸附劑處理過的血清。在一個載玻片的每孔中加入1

10、5 L 不稀釋的陽性對照，在另一個載玻片的每孔中加入 15 L 不稀釋的陰性對照。4）將載玻片放入濕盒中，37溫育90 分鐘。5）用PBS洗液的緩慢水流沖洗載玻片（避免直接沖入孔內(nèi)）后，浸泡在 PBS中并放置在水平搖床上輕輕搖動10分鐘。將載玻片用蒸餾水緩慢水流沖洗（避免直接沖入孔內(nèi)）。6）載玻片自然晾干。7）每孔加入15 L FITC 結(jié)合物溶液（不需稀釋）。8）將載玻片放入濕盒，37溫育30 分鐘。9）重復(fù)6 和 7 的洗滌步驟。10）加幾小滴封閉介質(zhì)，小心蓋上蓋玻片。11）盡快用熒光顯微鏡在400 倍放大率下觀察結(jié)果。如果不能立即觀察，可將其避光放置于2-8o C不超過 24小時。4結(jié)果

11、判斷4.1 有效性判斷每一次試驗都應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照，以確認(rèn)試驗和試劑盒的有效性。觀察到的熒光模式應(yīng)為：陽性對照：腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒對陽性質(zhì)控的1-15%細(xì)胞出現(xiàn)蘋果綠細(xì)胞核、 胞漿或胞膜熒光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同時觀察到著色的合胞）；軍團(tuán)菌、衣原體或立克次體中所有的細(xì)菌呈現(xiàn)出蘋果綠熒光；支原體對陽性質(zhì)控在細(xì)胞外圍呈現(xiàn)蘋果綠色熒光。陰性對照：軍團(tuán)菌、肺炎衣原體和立克次體無熒光，支原體、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病 毒的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。4.2 樣本結(jié)果判斷陽性結(jié)果：可以觀察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒對陽性血清的1

12、-15%細(xì)胞的細(xì)胞核、胞漿或胞膜出現(xiàn)蘋果綠色熒光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同時觀察到著色的合胞）；軍團(tuán)菌、衣原體或立克次體中所有的細(xì)菌呈現(xiàn)出蘋果綠色熒光；支原體對陽性血清在細(xì)胞外圍呈現(xiàn)蘋果綠色熒光。陰性結(jié)果：可觀察到軍團(tuán)菌、肺炎衣原體和立克次體無熒光，支原體、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。4.3 檢驗結(jié)果的解釋1）每一批產(chǎn)品在放行前都要經(jīng)過嚴(yán)格的內(nèi)部質(zhì)量控制（ Q.C.） 檢驗 。質(zhì)控品科溯源到經(jīng)過內(nèi)部確認(rèn)的參考血清盤。2） 如果所有細(xì)胞或第十孔出現(xiàn)熒光表明存在抗核和抗細(xì)胞抗體， 不能判斷為陽性， 應(yīng)用其他方法進(jìn)行檢驗。 當(dāng)質(zhì)控孔中吳熒光時一定要

13、查明原因 。3） 由于非軍團(tuán)菌感染的病人中經(jīng)常出現(xiàn)交叉抗體， 軍團(tuán)菌陽性的結(jié)果需結(jié)合臨床癥狀綜合評價。 建議做較高稀釋度的檢測來提高陽性預(yù)測值。4） 與說明書中所列結(jié)果不同不能判為陽性。5） 在初次感染和再次感染的過程中。 IgG和 IgM 抗體有不同的表現(xiàn)方式 ： 初次感染時， 幾乎在所有的情況下IgM 和 IgG 均出現(xiàn) （ IgM 早于IgG 出現(xiàn) ）； 而再次感染時， 可能會出現(xiàn)IgM。 在許多疾病中病人的一生都可能存在高低度的IgG， 而 IgM 一般情況下在感染后2-3 個月存在血清中 ， 因此 IgM 是近期感染的有效標(biāo)志物。6） 九種病原體IgM抗體陰性及陽性結(jié)果的熒光染色圖譜

14、：陽 性結(jié)果熒光圖譜：5. 在使用本產(chǎn)品中所需注意事項如下：1）本產(chǎn)2）在使用前，建議用戶仔細(xì)閱讀和理解說明書，嚴(yán)格按照程序進(jìn)行操作才能獲得可靠的檢測結(jié)果。特別是樣本和試劑的正確吸取以及仔細(xì)的洗板、溫育的時間控制對獲得準(zhǔn)確結(jié)果都很重要。另外使用前，應(yīng)將所有試劑平衡至室溫，載玻片要平衡至室溫后再打開。3）每一次試驗都應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照，以確認(rèn)試驗和試劑盒的有效性。觀察到的熒光模式應(yīng)與說明書要求相符合，否則檢驗無效。4）洗滌時注意不要直接對著孔直接沖洗，以免沖洗掉已經(jīng)固化反的應(yīng)復(fù)合物。5）單一樣本抗體檢測結(jié)果不能幫助作出近期感染的診斷。應(yīng)采集雙份樣本（急性期和康復(fù)期）同時檢測來觀察血清轉(zhuǎn)化或抗體

15、水平的明顯升高。6）僅使用試劑盒內(nèi)的組分，不要混用不同試劑盒或不同廠家的試劑組分。只有PBS、吸附劑、封閉介質(zhì)和載玻片可與其他批次VIRCELLI FA試劑盒通用，其它組分同批次可以混用。使用時，最好在無菌條件下操作試劑以防微生物污染。僅使用試驗所需量的吸附劑、PBS、質(zhì)控血清和結(jié)合物，剩余的試劑不要倒回瓶中。PBS溶解后儲存在2 8 o C一般為4個月，使用前需檢查，如出現(xiàn)渾濁請勿使用。7）每步操作必須使用干凈吸頭，僅使用干凈的耗材，最好是一次性使用的耗材。8）包裝如有損壞請勿使用。9）切勿用嘴吸移液管加樣。10）本試劑盒中的吸附劑、結(jié)合物和質(zhì)控血清含有動物源性物質(zhì)，質(zhì)控血清還含有人源性物質(zhì)

16、。盡管本試劑盒中的人血清質(zhì)控品已經(jīng)測試為HBsAg、 HCV抗體和HIV抗體陰性, 質(zhì)控血清和病人樣本仍應(yīng)作為潛在感染性物質(zhì)進(jìn)行處理?？變?nèi)包被的經(jīng)滅活的嗜肺軍團(tuán)菌血清1 型、 肺炎支原體、Q熱立克次體、肺炎衣原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1 、 2 和 3 型， 也仍應(yīng)視為具有潛在感染性并小心處置。目前沒有方法可以確保這些或其他感染性物質(zhì)不存在，因此所有的材料應(yīng)視為具有潛在感染性進(jìn)行處置，應(yīng)遵守當(dāng)?shù)仃P(guān)于臨床廢棄物處理的法規(guī)。11） 結(jié)合物、 吸附劑、 封閉介質(zhì)和質(zhì)控品含有疊氮鈉（濃度0.1%） ，避免接觸酸和重金屬。12）封閉介質(zhì)含有甘油，請勿接觸酸和暴露

17、在高溫下。13）伊文斯藍(lán)（濃度0.1%）是一種致癌物。請勿接觸皮膚和眼睛。萬一接觸到該溶液，用水徹底沖洗并到醫(yī)院檢查。14）僅按本說明書進(jìn)行操作，不遵守規(guī)定的溫育時間和溫度會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。15）載玻片上病人樣本交叉污染會導(dǎo)致錯誤結(jié)果，要小心操作防止發(fā)生。16）顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)、光源條件和類型會影響熒光質(zhì)量。17）不要將試劑不必要地放置在室溫下過長的時間。18） 每個載玻片只能使用一次。不要分割，也不要再使用沒有用過的孔。19）試劑盒里的玻璃組分破碎時可能傷及身體，小心處理。20）吸附劑加入樣本后要注意觀察是否有明顯的沉淀出現(xiàn)。三、 但愿有一天你會記起，我曾默默地，毫無希望地愛過你。我這扇門曾為

18、你打開，只為你一人打開，現(xiàn)在，我要把它關(guān)上了。四、你看我的時候我裝做在看別處，你在看別處的時候我在看你。五、陸上的人喜歡尋根究底，虛度很多的光陰。冬天擔(dān)憂夏天的遲來，夏天擔(dān)心冬天的將至。所以你們不停到處去追求一個遙不可及，四季如夏的地方，我并不羨慕。六、沒想到的是，一別竟是一輩子了。七、朋友們都羨慕我，其實羨慕他們的人是我。愛你，很久了，等你，也很久了，現(xiàn)在，我要離開你了，比很久很久還要久八、 Do something today that your future self will thank you for. 從現(xiàn)在開始，做一些讓未來的你感謝現(xiàn)在的自己的事。九、有個懂你的人，是最大的幸福。

19、這個人，不一定十全十美，但他能讀懂你，能走進(jìn)你的心靈深處，能看懂你心里的一切。最懂你的人，總是會一直的在你身邊，默默守護(hù)你，不讓你受一點(diǎn)點(diǎn)的委屈。真正愛你的人不會說許多愛你的話，卻會做許多愛你的事。十、很久很久，沒有對方的消息，也不再想起這個人，也是不想再想起。十一、我不怕我會忘記他，他在我心底開出了花。十二、我還在原地等你，你卻已經(jīng)忘記曾來過這里。十三、那都是很好很好的，我卻偏偏不喜歡。十四、向來緣淺，奈何情深？十五、習(xí)慣難受，習(xí)慣思念，習(xí)慣等你，可是卻一直沒有習(xí)慣看不到你十六、愛一個人最好的方式，是經(jīng)營好自己，給對方一個優(yōu)質(zhì)的愛人。不是拼命對一個人好，那人就會拼命愛你。俗世的感情難免有現(xiàn)實的一面：你有價值，你的付出才有人重視。 蘇芩十七、雨水落下來是因為天空無法承受它的重量，眼淚掉下來是因為心再也無法承受那樣的傷痛。你走棋，那叫選擇；老天走棋，那叫挑戰(zhàn)