2022益生菌對(duì)早產(chǎn)巴馬豬生后肺發(fā)育的影響（全文）

1、2022益生菌對(duì)早產(chǎn)巴馬豬生后肺發(fā)育的影響（全文）摘要目的探索益生菌干預(yù)在早產(chǎn)巴馬豬生后肺臟發(fā)育中的作用。方法動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，2020年4月至2021年10月利用已成功建立的30只早產(chǎn)巴馬豬模型，將仔豬分為早產(chǎn)組（妊娠104d出生）、足月組（妊娠113d出生）、早產(chǎn)益生菌干預(yù)組（妊娠104d出生后第3天開始給予口服益生菌）和足月益生菌干預(yù)組（妊娠113d出生后第3天開始給予口服益生菌），分別記錄早產(chǎn)組和足月組仔豬出生后即刻、生后4、9、21d以及早產(chǎn)益生菌干預(yù)組和足月益生菌干預(yù)組仔豬生后9d后的體重并收集肺組織、回腸組織和腸道內(nèi)容物。通過比較體重、輻射狀肺泡計(jì)數(shù)來評(píng)估仔豬發(fā)育情況，通過測(cè)量回腸絨

2、毛高度評(píng)估回腸發(fā)育情況，通過菌群16S核糖體RNA分析評(píng)估回腸內(nèi)容物的菌類構(gòu)成，組間比較采用,檢驗(yàn)。結(jié)果30只仔豬中雌性16只、雄性14只。早產(chǎn)組和足月組各12只，早產(chǎn)益生菌干預(yù)組和足月益生菌干預(yù)組各3只。早產(chǎn)組仔豬生后4、9、21d的體重均分別低于足月組生后4、9、21d（507±27）比（694±56）g、（620±35）比（1092±154）g、（1660±210）比（2960±418）g"=2.96、2.99、2.78,均P<0.05,早產(chǎn)組仔豬出生9d的輻射狀肺泡計(jì)數(shù)低于足月組9d的仔豬(4.00±

3、0.29)比(6.11±0.35)個(gè)，片4.64,<0.01o早產(chǎn)組和足月組仔豬在生后不同時(shí)間點(diǎn)有不同的高豐度回腸菌屬，生后4d時(shí)分別為大腸桿菌志賀菌屬26.63%和腸球菌屬30.48%;出生9d時(shí)分別為蘇黎世桿菌屬35.94%和乳桿菌屬27.33%;出生21d時(shí)分別為大腸桿菌志賀菌屬28.02%和乳桿菌屬46.29%。早產(chǎn)組9d仔豬的回腸絨毛高度小于足月組9d的彳子豬(297±21)比(411±32)pm,片3.01,P=0.007o早產(chǎn)益生菌干預(yù)組和足月益生菌干預(yù)組的仔豬體重、輻射狀肺泡計(jì)數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(692±36)比(767±

4、;67)g、(5.44±0.34)比(5.89±0.26)個(gè)，1=0.74、1.04,均P>0.05o早產(chǎn)益生菌干預(yù)組及足月益生菌干預(yù)組的回腸優(yōu)勢(shì)菌屬均為蘇黎世桿菌屬，早產(chǎn)益生菌干預(yù)組仔豬的回腸絨毛高度大于早產(chǎn)組9d的仔豬(371±13)比(297±21)pm,片3.04,P=0.006,與足月益生菌干預(yù)組仔豬和足月組9d仔豬的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(371土13)比(338±12)和(411±32)pm,1=1.90、1.15,均P>0.05。結(jié)論早產(chǎn)會(huì)影響肺發(fā)育中的肺泡化進(jìn)程。早產(chǎn)生后的益生菌干預(yù)可能通過改善腸道發(fā)育促進(jìn)肺

5、泡化進(jìn)程。世界范圍內(nèi)每年有1500萬早產(chǎn)兒出生，早產(chǎn)兒的肺臟一般處于囊泡期或小管期，當(dāng)早產(chǎn)兒出生后，其尚未發(fā)育完全的氣道被迫通氣，增加了支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonarydysplasia,BPD)、慢性肺疾病、哮喘等疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。早產(chǎn)一般會(huì)與青春期和成人期的肺功能異常相關(guān)聯(lián)。而對(duì)于BPD患兒的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性的氣道炎癥和氣道發(fā)育受阻可能在BPD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。但是這些理論內(nèi)在的機(jī)制卻尚不完全清楚，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行干預(yù)手段的開發(fā)也有限。近年來，"腸-肺軸”理論的興起為早產(chǎn)生后肺發(fā)育的干預(yù)提供了新的研究思路。一些研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生態(tài)失調(diào)可能參與了諸多呼吸道相關(guān)疾病

6、例如哮喘等的發(fā)病，提示通過干預(yù)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，可能對(duì)肺疾病發(fā)揮作用。為了探討腸道微生態(tài)與早產(chǎn)生后肺發(fā)育的相關(guān)性，本研究在前期建立的早產(chǎn)豬模型的基礎(chǔ)上，添加益生菌對(duì)早產(chǎn)豬進(jìn)行了干預(yù)，對(duì)腸道微生態(tài)在早產(chǎn)生后肺發(fā)育中的作用進(jìn)行了初步的探索。材料和方法一、材料采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，在2020年4月至2021年10月經(jīng)重慶市畜牧科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查書編號(hào)202101）,按照前期研究成功建立早產(chǎn)模型的方法【7】，選用30只新生巴馬仔豬（雌性16只、雄性14只），并經(jīng)人工飼養(yǎng)生產(chǎn)許可證編號(hào)SCXK（渝）2018-0002,使用許可證編號(hào)SYXK（渝）2018-0002,控制其病原微生物

7、和寄生蟲，檢測(cè)其血清、抗凝血、咽拭子、鼻腔拭子、直腸拭子等，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)符合中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)（T/CALAS33-2017）的無特異性病原體級(jí)豬微生物學(xué)監(jiān)測(cè)。二、方法1 .分組：以配種日期作為妊娠起始日，將仔豬分為早產(chǎn)組（妊娠104d出生）、足月組（妊娠113d出生）、早產(chǎn)益生菌干預(yù)組（妊娠104d出生后第3天開始給予口服益生菌師足月益生菌干預(yù)縝妊娠113d出生后第3天開始給予口服益生菌），其中口服的益生菌為復(fù)合益生菌粉劑（15mg中含19億活菌，其中嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌按照活菌數(shù)5：5：3：1混合）按照每只仔豬15mg/d進(jìn)行飼喂。2 .樣本采集：早產(chǎn)組和足

8、月組分別在出生后即刻、生后4、9、21d利用急性失血法各處死3只仔豬；早產(chǎn)益生菌干預(yù)組和足月益生菌干預(yù)組在生后9d處死；采用1%戊巴比妥（2.5|jl/g）腹腔內(nèi)注射麻醉仔豬，使用4%（體積分?jǐn)?shù)）多聚甲醛溶液灌洗左肺組織后將其放入裝有4%多聚甲醛溶液的容器中固定用于制作石蠟切片。暴露腹腔后，分離回腸腸段，取35cm長(zhǎng)的回腸腸段，將內(nèi)容物收集至2ml凍存管中，直接放入液氮中保存，剩余腸道組織浸入4%多聚甲醛溶液中固定用于制作石蠟切片。3 .輻射狀肺泡計(jì)數(shù)：利用組織石蠟包埋和HE染色完成輻射狀肺泡計(jì)數(shù)和回腸絨毛高度分析，比較早產(chǎn)組與足月組仔豬生后即刻、4組生后9d的輻射狀肺泡計(jì)數(shù)來評(píng)估早產(chǎn)對(duì)仔豬肺

9、泡化進(jìn)程的影響以及益生菌干預(yù)對(duì)早產(chǎn)仔豬生后肺泡化進(jìn)程的影響。4 .腸道微生物菌群和回腸絨毛高度分析：采用十六烷基三甲基漠化錢法對(duì)腸道內(nèi)容物的基因組DNA進(jìn)行提取，經(jīng)過建庫、高通量16s核糖體RNA測(cè)序、運(yùn)算分類單元聚類和物種注釋完成菌群分析，通過菌群分析評(píng)估回腸內(nèi)容物的菌類構(gòu)成測(cè)量和比較4組仔豬生后9d的回腸絨毛長(zhǎng)度評(píng)估早產(chǎn)生后及益生菌干預(yù)后回腸發(fā)育情況。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和GraphPadPrism6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以工士s表示，組間比較采用"僉驗(yàn)，以雙側(cè)0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、一般情況30只仔豬中早產(chǎn)組和足月組各1

10、2只，早產(chǎn)益生菌干預(yù)組和足月益生菌干預(yù)組各3只。二、各組仔豬的體重、輻射狀肺泡計(jì)數(shù)、回腸菌群組成和回腸絨毛高度的比較1.體重：早產(chǎn)組仔豬生后4、9、21d的體重均分別低于足月組生后4、9、21d（均P<0.05，表1）。早產(chǎn)益生菌干預(yù)組與足月益生菌干預(yù)組仔豬體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（692±36）比（767±67）g,1=0.74,P=0.535;足月益生菌干預(yù)組和足月組生后9d（1092±154）g的仔豬體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義”=1.94,P=0.125）。表1早產(chǎn)組和足月組仃落生后不同時(shí)間點(diǎn)的體重比較（聲£士，）組別出生后即刻生后4d生后9d生后21

11、d早產(chǎn)組493±62507±2762013516601210足月組61s±27694±561092±值I.S42.962.982.78P值0.140O.CMI0.0410.049注：精個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本U為3只2 .輻射狀肺泡計(jì)數(shù)：如表2所示，早產(chǎn)組仔豬出生后即刻及生后9d輻射狀肺泡計(jì)數(shù)均低于足月組仔豬（均<0.001）;早產(chǎn)益生菌干預(yù)組和足月益生菌干預(yù)組仔豬輻射狀肺泡計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5.40±0.34）比（5.90±0.26）個(gè)，仁1.04,0.313o表2早產(chǎn)組和足月組仔豬出生后不同時(shí)間點(diǎn)的

12、箱時(shí)狀肺泡計(jì)數(shù)分析結(jié)果的比較（個(gè)/±，）組別出生后即刻生后94早產(chǎn)的1.6±0.44.OtO.29足JI組4.1*036.1±035dft4.964.64P假<0.001<0.001注：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本H為3只3 .回腸菌群組成：早產(chǎn)組和足月組仔豬在回腸菌群構(gòu)成上存在較大差異（表3）,在出生后即刻，早產(chǎn)組和足月組的優(yōu)勢(shì)菌屬均為假單胞菌屬；出生4d時(shí)，早產(chǎn)組的優(yōu)勢(shì)菌屬為大腸桿菌志賀菌屬，足月組為腸球菌屬；出生9d時(shí)，早產(chǎn)組的優(yōu)勢(shì)菌屬為蘇黎世桿菌屬，足月組為乳桿菌屬；出生21d時(shí)，早產(chǎn)組的優(yōu)勢(shì)菌屬為大腸桿菌志賀菌屬，足月組為乳桿菌屬。早產(chǎn)益生菌干預(yù)組和足月益

13、生菌干預(yù)組的回腸優(yōu)勢(shì)菌屬為均為蘇黎世桿菌屬。表3出工后不同時(shí)網(wǎng)點(diǎn)各組仔豬的回腸曲群F度(俁)組男睛營(yíng)落羯大感任雨志賈南胤曲球商因不動(dòng)桿菌及需菌屬出生后即刻不產(chǎn)鮑2.591.432.7235.960.633.650.3422.911.0223126.44出生后即刎足月組1.751.82Z2359.77037L690.053.700.8513261431生后4d早產(chǎn)組23.830.0226.6311360.191355000.49023.73生后4d足月組1271.8123.603390.9030.480J70.9716.440.4520.42生后gd：產(chǎn)組35.947.180.930.0224.

14、061.1119.1000.70010.96生后9d足月組1.9127.3325.740.052.4524.023.6102.06012.83中產(chǎn)益生麗卜稠組66.040530.650.010.540.1718.9800.09012.99足月益生前干播組.85.670.280.0400.130.142.480001126生后21d早產(chǎn)射27.7322728.02L334.862.600.0203216.900.1115.84生后21d足月組1.1346.291X010X)33.998.601.1006.25020.60注廠為生后9d4 .回腸絨毛高度：早產(chǎn)組仔豬生后9d的回腸絨毛高度小于足月組

15、9d的仔豬(297±21)kt(411±32)pm,f=3.01,P=0.007o早產(chǎn)益生菌干預(yù)組仔豬的回腸絨毛高于早產(chǎn)組9d仔豬(371±13)比(297±21)pm"=3.04,P=0.006，與足月益生菌干預(yù)組(338±12)pm和足月組9d仔豬(411±32)pm差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(£=1.90、1.15,均P>0.05)。討論肺臟作為人類重要臟器之一，在出生后機(jī)體與外界的氣體交換及免疫應(yīng)答等方面起到了非常重要的作用。新生兒科醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步使早產(chǎn)兒的存活率大大提高，然而早產(chǎn)兒的肺臟一般處于囊泡期或

16、小管期，通過對(duì)早產(chǎn)兒肺功能研究結(jié)果的總結(jié),Jordan和McEvoy提出所有的極早產(chǎn)兒都存在肺功能異常。而Agusti和Hogg發(fā)現(xiàn)處于第1秒用力呼氣量低四分位區(qū)段的兒童在年老時(shí)會(huì)發(fā)展成低第1秒用力呼氣量的慢性阻塞性肺疾病。早產(chǎn)兒的肺泡化較差，肺發(fā)育不成熟，都是導(dǎo)致肺功能改變和BPD等疾病發(fā)生的重要原因。因此亟需對(duì)影響早產(chǎn)兒肺泡化的因素及干預(yù)措施的研究。本研究首先針對(duì)早產(chǎn)豬生后肺發(fā)育情況進(jìn)行評(píng)估，并利用臨床使用的益生菌對(duì)早產(chǎn)豬進(jìn)行了干預(yù)。早產(chǎn)豬的體重從生后4d開始低于同期的足月豬，而其肺泡化程度在出生即刻和出生后9d均低于同期的足月仔豬。這些結(jié)果提示早產(chǎn)仔豬在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育及肺泡化進(jìn)程方面都受到

17、嚴(yán)重影響，這與目前對(duì)早產(chǎn)生后機(jī)體及肺發(fā)育的認(rèn)知一致。早產(chǎn)益生菌干預(yù)組仔豬生后9d的體重及肺泡化程度均與同期足月組仔豬差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這個(gè)結(jié)果提示，益生菌干預(yù)對(duì)于早產(chǎn)仔豬生后受到影響的機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育及肺泡化進(jìn)程具有改善作用。為了探究益生菌作用的可能原因，對(duì)不同組仔豬的回腸菌群進(jìn)行了分析。早產(chǎn)組仔豬和足月組仔豬在出生及生后不同時(shí)間點(diǎn)的回腸菌群構(gòu)成上存在較大差異，而添加益生菌后，兩組的主要菌群都是蘇黎世桿菌屬。對(duì)于回腸生理結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)組生后9d的回腸絨毛高度低于足月組，早產(chǎn)益生菌干預(yù)組生后仔豬9d,其回腸絨毛高度與足月組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這部分結(jié)果提示早產(chǎn)生后回腸發(fā)育受阻，回腸菌群結(jié)構(gòu)異

18、常，使用益生菌可以促進(jìn)回腸絨毛發(fā)育，同時(shí)改變回腸的腸道菌群結(jié)構(gòu)。回腸作為小腸的重要組成部分，除了和其他小腸腸段（十二指腸、空腸）一起行使消化分解碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類的作用之外，主要負(fù)責(zé)維生素Bl2的吸收。除此之外，在回腸末端由淋巴小結(jié)聚集形成集合淋巴濾泡，被稱為Peyer板，在機(jī)體的適應(yīng)性免疫過程中起到重要作用。因此，益生菌可能通過營(yíng)養(yǎng)及免疫2個(gè)方面促進(jìn)了早產(chǎn)仔豬生后的肺泡化進(jìn)程，但該作用是直接還是間接以及其具體機(jī)制需要更加深入的研究。蘇黎世桿菌屬的細(xì)菌在2002年被發(fā)現(xiàn)，其功能尚不完全清楚，相關(guān)研究的結(jié)果提示該菌屬可能與炎癥反應(yīng)和腸道疾病相關(guān)。但對(duì)于豬來講，有研究發(fā)現(xiàn)該菌屬可以促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)，同時(shí)通過降低宿主對(duì)病原菌的敏感性參與免疫過程。因此，益生菌可能通過改變回腸菌群構(gòu)成促進(jìn)早產(chǎn)仔豬生后機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育。本研究存在一定的局限性，首先，樣本量較小，在未來研究中需要增加樣本量以檢驗(yàn)本研究