酸性磷酸酶的ppt課件

1、 酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的分別純化和動(dòng)力學(xué)分析分別純化和動(dòng)力學(xué)分析李李 平平 法法臨床生物化學(xué)教研室臨床生物化學(xué)教研室概概 述述n酶在物質(zhì)代謝及調(diào)理中的重要意義；酶在物質(zhì)代謝及調(diào)理中的重要意義；n常用的酶蛋白分別純化方法；常用的酶蛋白分別純化方法；n酶類檢測(cè)在臨床生化檢驗(yàn)中的意義；酶類檢測(cè)在臨床生化檢驗(yàn)中的意義；n酸性磷酸酶作用特性及動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。酸性磷酸酶作用特性及動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。目目 的的 要要 求求1. 穩(wěn)定診斷酶學(xué)有關(guān)的實(shí)際與實(shí)驗(yàn)知識(shí)；穩(wěn)定診斷酶學(xué)有關(guān)的實(shí)際與實(shí)驗(yàn)知識(shí)；2. 掌握酶的分別純化方法；掌握酶的分別純化方法；3. 掌握酸性磷酸酶掌握酸性磷酸酶aicd phosphatase ACP

2、活性測(cè)定的原理、方法和影響要素；活性測(cè)定的原理、方法和影響要素；4. 熟習(xí)酶活性測(cè)定的條件選擇和方法建立。熟習(xí)酶活性測(cè)定的條件選擇和方法建立。試劑與器材試劑與器材一、一、ACP的分別純化試劑：見(jiàn)實(shí)驗(yàn)的分別純化試劑：見(jiàn)實(shí)驗(yàn)教材教材P31；二、二、ACP動(dòng)力學(xué)分析試劑：見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)力學(xué)分析試劑：見(jiàn)實(shí)驗(yàn)教材教材P35；三、器材：普通離心機(jī)，三、器材：普通離心機(jī)，721分光光分光光度計(jì)，恒溫水浴箱，研缽等。度計(jì)，恒溫水浴箱，研缽等。實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容一、一、 ACP的分別純化的分別純化二、二、 ACP的比活性分析的比活性分析三、三、 ACP的動(dòng)力學(xué)分析的動(dòng)力學(xué)分析 1. 時(shí)間進(jìn)程時(shí)間進(jìn)程t-V 曲線曲

3、線 2. 酶濃度酶濃度-速度速度E-V曲線曲線 3. pH-酶活性酶活性 pH-V曲線曲線 4.底物濃度底物濃度-速度速度S-V曲線曲線 5.抑制劑抑制劑-速度速度I-V曲線曲線一、一、 ACP的分別純化的分別純化 1.概略：概略： ACP分布廣泛分布廣泛 分子量分子量100kD 最適最適pH5.0 熱穩(wěn)定性較好熱穩(wěn)定性較好 溶解度較高溶解度較高 臨床運(yùn)用廣臨床運(yùn)用廣2. ACP的分別純化方法的分別純化方法 根據(jù)根據(jù)ACP的理化性質(zhì)，可以用層析、的理化性質(zhì)，可以用層析、電泳、透析等多種方法分別純化。電泳、透析等多種方法分別純化。 本實(shí)驗(yàn)采用分級(jí)離心本實(shí)驗(yàn)采用分級(jí)離心+分段鹽析法：分段鹽析法：

4、ACP與其它成分細(xì)胞膜、雜蛋白與其它成分細(xì)胞膜、雜蛋白密度不同，以次逐漸離心分別；密度不同，以次逐漸離心分別； ACP能溶解于水和低飽和度的硫酸銨能溶解于水和低飽和度的硫酸銨溶液，在溶液，在70C仍堅(jiān)持穩(wěn)定，以此進(jìn)展雜仍堅(jiān)持穩(wěn)定，以此進(jìn)展雜蛋白的變性沉淀和分段鹽析。蛋白的變性沉淀和分段鹽析。3.ACP分別純化的步驟流程分別純化的步驟流程 小麥胚芽小麥胚芽100g+200ml冷蒸餾冷蒸餾水水 濾濾 液液研碎，研碎，4層紗布過(guò)濾層紗布過(guò)濾3500rpm，10min離心離心 上清液上清液 I4000rpm，10min離心離心1mol/L MnCl2 2ml/100ml上清液上清液 I 上清液上清液

5、II激活并穩(wěn)定激活并穩(wěn)定ACP， 沉淀雜蛋白沉淀雜蛋白緩慢攪拌緩慢攪拌4000rpm，8min離心離心 上清液上清液5000rpm，10min離心離心飽和硫酸銨飽和硫酸銨 54ml/100ml上清液上清液 II 上清液上清液 II溶解溶解ACP， 沉沉淀雜蛋白淀雜蛋白4000rpm，8min離心離心 上清液上清液 III70C水浴水浴2min冷水浴冷水浴3min飽和硫酸銨飽和硫酸銨 51ml/100ml上清液上清液 II 沉淀酶粗沉淀酶粗提物提物 沉淀沉淀ACP緩慢攪拌緩慢攪拌緩慢攪拌緩慢攪拌4000rpm，10min離心離心約約1/3上清液上清液 III蒸餾水，蒸餾水，溶解，洗滌溶解，洗滌溶

6、解溶解ACP， 沉淀雜蛋白沉淀雜蛋白4000rpm，10min離心離心 上清液上清液 IV 沉淀酶粗沉淀酶粗提物提物 沉淀沉淀ACPEDTA9ml，飽和硫酸銨，飽和硫酸銨10ml /100ml上清液上清液 IV，2倍體積預(yù)冷甲醇倍體積預(yù)冷甲醇 沉沉 淀酶純淀酶純化物化物4000rpm，10min離心離心蒸餾水溶解，洗滌蒸餾水溶解，洗滌 上清液上清液 V 酶酶液液緩慢攪拌緩慢攪拌 1.各上清液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定各上清液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定 原理：染料結(jié)合比色法原理：染料結(jié)合比色法CBBG-250， max=595nm； 步驟：規(guī)范曲線制造步驟：規(guī)范曲線制造 各上清液中總蛋白測(cè)定做平行管，各上清液中總蛋

7、白測(cè)定做平行管，進(jìn)進(jìn) 行反復(fù)實(shí)驗(yàn)，減少隨機(jī)誤差。行反復(fù)實(shí)驗(yàn)，減少隨機(jī)誤差。二、二、 ACP的比活性分析的比活性分析 2.各上清液中各上清液中ACP活性測(cè)定活性測(cè)定 酚酚-4-AAP顯色法顯色法:以磷酸苯二鈉為底以磷酸苯二鈉為底物，由物，由ACP催化生成苯酚，在堿性條件催化生成苯酚，在堿性條件下苯酚與下苯酚與4-AAP縮合最終生成紅色醌類化縮合最終生成紅色醌類化合物，合物， max = 510 nm； 留意：顯色過(guò)程中兩種緩沖液：留意：顯色過(guò)程中兩種緩沖液： 檸檬酸緩沖液：檸檬酸緩沖液：pH5.0，提供，提供ACP反響反響條件條件 碳酸鹽緩沖液：碳酸鹽緩沖液：pH10.0，提供成色反響，提供成色

8、反響條件條件 3.各上清液中各上清液中ACP比活性分析比活性分析 ACP活性單位定義：每分鐘每毫升酶活性單位定義：每分鐘每毫升酶液產(chǎn)生液產(chǎn)生1nmol酚即酚即nmol/minml為為1個(gè)活性個(gè)活性單位；單位；純化倍數(shù)純化倍數(shù)=各上清液中各上清液中ACP的比活性的比活性上清液上清液I 中中ACP的比活性的比活性比活性比活性=酶活性酶活性 U/ml蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量mg/ml酶的回收率酶的回收率=各上清液中各上清液中ACP的活性的活性 總體積總體積上清液上清液I中中ACP的活性的活性總體積總體積還可以計(jì)算蛋白回收率，反映純化效果，代表方法的特異性。還可以計(jì)算蛋白回收率，反映純化效果，代表方法的特

9、異性。三、三、 ACP的動(dòng)力學(xué)分析的動(dòng)力學(xué)分析 1. 時(shí)間進(jìn)程時(shí)間進(jìn)程t-A 曲線曲線AACP的的 t-A 曲線曲線時(shí)間t酚生成量2. 酶濃度酶濃度-速度速度E-A曲線曲線 酶蛋白含量E反響速度VACP 的的 E-V 曲線曲線 3. pH-酶活性酶活性 pH-V曲線曲線pH反響速度V最適pHACP的的pH-酶活性曲線酶活性曲線1.影響方式：影響方式： 當(dāng)當(dāng)S較低時(shí)，較低時(shí)，V隨隨S的的 添加呈正比例添加添加呈正比例添加 當(dāng)當(dāng)S較高時(shí)，較高時(shí)，V隨隨S的的 添加減慢添加減慢 當(dāng)當(dāng)S增大到某一值時(shí)，增大到某一值時(shí)，V 到達(dá)最大反響速度到達(dá)最大反響速度Vmax2.影響曲線：影響曲線：VSVmax矩形

10、雙曲線矩形雙曲線Km4.底物濃度底物濃度-速度速度S-V曲線曲線曲線方程曲線方程米米-曼氏方程曼氏方程1米米-曼氏方程：曼氏方程： V=VmaxSKm + SV： 某一時(shí)辰的反響速度某一時(shí)辰的反響速度S：某一時(shí)辰的底物濃度：某一時(shí)辰的底物濃度Vmax： 反響系統(tǒng)可以到達(dá)的最大反響速度反響系統(tǒng)可以到達(dá)的最大反響速度Km：米氏常數(shù)：米氏常數(shù) Km和和Vmax的測(cè)定：的測(cè)定： 雙倒數(shù)作圖法：將米氏方程兩邊取倒數(shù)得雙倒數(shù)作圖法：將米氏方程兩邊取倒數(shù)得 1 1 1V Vmax S Vmax=+1V 1S縱截距=KmKmVmax斜率=Vmax1橫截距=1Km-1.抑制劑的概念：抑制劑的概念： 抑制劑抑制劑inhibitor：能使酶的催化活性下降而：能使酶的催化活性下降而 不引起酶蛋白變性的物質(zhì)不引起酶蛋白變性的物質(zhì)2.抑制造用的分類：抑制造用的分類：抑制造用抑制造用不可逆性抑制不可逆性抑制可逆性抑制可逆性抑制競(jìng)爭(zhēng)性抑制競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制 5.抑制劑抑制劑-速度速度I-A曲線曲線 競(jìng)爭(zhēng)性抑制的動(dòng)力學(xué)變化競(jìng)爭(zhēng)性抑制的動(dòng)力學(xué)變化米米-曼氏方程變化為：曼氏方程變化為： V=VmaxSKm1+I/Ki + S此時(shí)， Km增大， Vmax不變1/