主流可變剪切軟件識(shí)別原理

1、總結(jié)隨著多物種的基因組測(cè)序結(jié)果公布，人們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)編碼基因的數(shù)量并沒(méi)有隨著生物復(fù)雜性的增加而增加，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了可變剪切的機(jī)制?？勺兗羟惺侵竚RNA前體中的外顯子以不同的組合方式進(jìn)行剪切和拼接，從而產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)及功能的mRNA口蛋白質(zhì)。這種由同一基因產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的mRN相蛋白質(zhì)稱作可變剪切。目前已發(fā)現(xiàn)的可變剪切共有五種類型：1 .外顯子跳讀（圖1A）即在進(jìn)行序列剪切時(shí)會(huì)跳過(guò)一個(gè)外顯子。2 .互斥外顯子（圖1B）即進(jìn)行序列剪切時(shí)存在兩個(gè)外顯子，二者選一進(jìn)行剪切。3 .內(nèi)含子保留（圖1C）即剪切時(shí)不剪切內(nèi)含子。4 .可變5'供體（圖1D）即剪切上游長(zhǎng)度不定的外顯子。5 .可變3'受體（

2、圖1E）即剪切下游長(zhǎng)度不定的外顯子。圖1可變剪切類型單末端和雙末端測(cè)序結(jié)果均可用于檢測(cè)可變剪切事件，但二者的原理不盡相同。單末端測(cè)序是將測(cè)序得到的reads比對(duì)到參考基因組中，如果特定的外顯子沒(méi)有對(duì)比到參考基因組，則標(biāo)記為在轉(zhuǎn)錄本中可能為選擇性剪切事件。而雙末端測(cè)序產(chǎn)生的是成對(duì)的reads,將成對(duì)的reads匹配到參考基因組上，然后對(duì)每對(duì)reads之間的實(shí)際距離與理論距離進(jìn)行計(jì)算，推測(cè)轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)。以下為幾種較為常用的可變剪切識(shí)別工具，接下來(lái)將對(duì)以下幾種不同可變剪切機(jī)制識(shí)別軟件的功能特點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)單的介紹：AStalavisa原理：與其它軟件都是相同的標(biāo)記代碼不同，AStalavisa計(jì)數(shù)系統(tǒng)將每

3、一個(gè)未映射成功的reads相對(duì)應(yīng)的位置標(biāo)記唯一的代碼。首先將reads與轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行映射，并將未在重疊轉(zhuǎn)錄本覆蓋的reads作為拼接結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，然后根據(jù)基因組坐標(biāo)系，將剪切位點(diǎn)的變化生成AS代碼描述相應(yīng)的可變剪切事件。AStalavisa會(huì)將相同類型的可變剪切歸類到相同的分類結(jié)構(gòu)組中，無(wú)論使用多少轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比對(duì)它都會(huì)過(guò)濾去除冗余的數(shù)據(jù)來(lái)確定唯一的可變剪切事件。AStalavisa功能主要集中于拼接結(jié)構(gòu)的變化，而非外顯子或內(nèi)含子的屬性選擇，它克服了復(fù)雜剪切事件預(yù)測(cè)的難題。AStalavisa適用于所有物種的基因組或自定義基因的一部分。AStalavisa是一種預(yù)測(cè)方法而非固定的數(shù)據(jù)，所以預(yù)測(cè)準(zhǔn)確

4、度依賴于不同的注釋文件，種特異性和編碼活動(dòng)制約性。3Downloadturtput(GIFfftmiafl:selededjCDondinat.esIraiiHcripUlUCflnpffwjscyne卻曾口庇巳EFI1-353CJB.2-D2OeJu*：33790853.33T囪啊B,337EiOE0EtPll-3&3Cie2-0L5rMS世33fT®070LlankPTGporiianiCounEInflra工mmSjUncUire1.12Cfrdt1.24口。聃2Show»code:l-,2-圖2AStalavisa示例結(jié)果DiffSplice：是RNA-se

5、q全基因組水平不同剪切機(jī)制的檢測(cè)軟件，尤其適用于比較不同細(xì)胞之間轉(zhuǎn)錄租的基因差異表達(dá)分析，同一細(xì)胞不同狀態(tài)下或不同發(fā)展階段之間的基因差異表達(dá)分析。DiffSplice采用從頭計(jì)算的方法，它不需要完整的轉(zhuǎn)錄注釋文件，而是使用ASMs局部化搜尋可變剪切位點(diǎn)，這種局部化能夠減少樣品間相應(yīng)的ASMs模塊比較復(fù)雜度。DiffSplice首先會(huì)融合所有樣品的RNA-seq序歹進(jìn)行圖譜拼接重組，預(yù)測(cè)所有類型的轉(zhuǎn)錄及可變剪切事件。軟件將外顯子使用節(jié)點(diǎn)代替，若兩個(gè)外顯子節(jié)點(diǎn)間有reads覆蓋則連接這兩個(gè)節(jié)點(diǎn)。然后會(huì)自動(dòng)識(shí)別基因組區(qū)域相應(yīng)的ASMs,每一條拼接序列都相當(dāng)于單入口單出口的子圖，不同的子圖會(huì)產(chǎn)生分歧，

6、這種分歧在不同子圖進(jìn)行比對(duì)時(shí)就會(huì)被識(shí)別為可變剪切位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄組圖譜拼接有兩種方法，一種是根據(jù)基因組比對(duì)進(jìn)行拼接，另一種是根據(jù)RNA-seq進(jìn)行從頭拼接。接下來(lái)會(huì)使用ESG（表達(dá)權(quán)重拼接圖譜）對(duì)ASMs進(jìn)行識(shí)別，其中每個(gè)ASMs被定義為單條子圖拼接圖譜，其中小的ASMs會(huì)嵌入更大的ASMs子圖譜中。黑MEXS“Xitgn/iUftzASM圖3DiffSplice原理DSGseq采用負(fù)二項(xiàng)式（NB）模型化閱讀外顯子，并且提出NB統(tǒng)計(jì)數(shù)值來(lái)檢測(cè)兩組樣品基因中的全部外顯子的不同剪切方式，這種方法是基于外顯子而開(kāi)發(fā)的新途徑。其他大部分的檢測(cè)可變剪切的軟件第一步都會(huì)將所有可變剪切類型進(jìn)行評(píng)估，然后進(jìn)行可變剪

7、切類型的比例計(jì)算，這種機(jī)制往往會(huì)檢測(cè)到許多額外的假陽(yáng)性的可變剪切。而DSGseqft接使用外顯子來(lái)檢測(cè)可變剪切類型，它不需要剪切類型組成的信息，也不需要剪切類型的表達(dá)量。當(dāng)兩組樣品進(jìn)行比對(duì)時(shí)，外顯子出現(xiàn)中部缺失的現(xiàn)象判定為內(nèi)含子保留，兩個(gè)外顯子之間增加單一位置外顯子為外顯子跳躍，兩個(gè)外顯子之間增加多個(gè)位置外顯子為外顯子互斥，外顯子5'或3'長(zhǎng)度不同為可變供體或可變受體。圖4DSGseq®理RNAexpress是一款界面友好、計(jì)算效率較高和計(jì)算方式靈活的新型注釋軟件，它不依賴其他主流的注釋文件，能夠有效的識(shí)別轉(zhuǎn)錄本與基因組及轉(zhuǎn)錄特征,相較于其他只關(guān)注識(shí)別可變剪切的軟件，

8、RNAexpres劭能更加強(qiáng)大，它能夠識(shí)別一些非編碼的長(zhǎng)短鏈RNA新的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、可變啟動(dòng)子、RNA編輯位點(diǎn)和編碼轉(zhuǎn)錄本的過(guò)程。RNAexpresW識(shí)別BAM格式文件，輸出GTF格式文件。該軟件簡(jiǎn)單易懂，允許用戶添加新的類模塊來(lái)建立新的識(shí)別算法。RNAexpress分析過(guò)程分為以下6個(gè)階段，每個(gè)階段都有獨(dú)立的輸出文件。1 .數(shù)據(jù)的輸入及轉(zhuǎn)化2 .樣品融合3 .選擇算法（可選擇外部GTF比對(duì)）>4 .進(jìn)行比對(duì)5 .序列調(diào)取6 .閱讀計(jì)數(shù)圖5RNAexpressM理流程iReckon：該軟件概率論算法合并了諸如新型可變剪切類型、內(nèi)含子保留、未剪切前體mRNA、多重映射reads等機(jī)制，能夠

9、同時(shí)評(píng)估和發(fā)現(xiàn)可變剪切類型。該軟件使用了正則最大希期望值算法來(lái)發(fā)現(xiàn)及量化低表達(dá)量的新型可變剪切類型。軟件的工作流程分為三個(gè)步驟，首先軟件會(huì)識(shí)別所有的可變剪切類型，然后根據(jù)識(shí)別的可變剪切類型重新排列reads,最后根據(jù)預(yù)測(cè)的可變剪切類型的豐度進(jìn)行重建。SplicingGraph是一款對(duì)鑒別真假可變剪切位點(diǎn)高度靈敏的軟件，它能夠在裝配好的基因通路中捕捉單一結(jié)構(gòu)，每個(gè)外顯子相當(dāng)于一個(gè)節(jié)點(diǎn)被內(nèi)含子連在一起，不同內(nèi)含子長(zhǎng)度顯示內(nèi)含子有時(shí)不會(huì)被剪切，內(nèi)含子之間有無(wú)節(jié)點(diǎn)或幾個(gè)節(jié)點(diǎn)顯示有內(nèi)含子跳躍或選擇性剪切事件，而這種緊密的結(jié)構(gòu)使可變剪切更加簡(jiǎn)易，該軟件還支持基因家族的可變剪切比對(duì)。SplicingGrap

10、h是基于Sircah的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化的軟件，它增強(qiáng)了Sircah基于ES微據(jù)的可變剪切偵測(cè)能力，擴(kuò)展了統(tǒng)計(jì)學(xué)、蛋白質(zhì)和RNA-seq的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)包。GeneModelforAT5G22640PredictedSpliceGraphforAT5G22640SpliceJunctionswithReadSupportRead75300前75310007533000i1ifAlt,3'NovelJuhctionllntronRetentiari21oQ11圖6SplicingGraph原理SplicingViewer：是一款可以對(duì)可變剪切進(jìn)行檢測(cè)、注釋和可視化的軟件。簡(jiǎn)而言之分為三個(gè)步驟（圖7

11、A）來(lái)深度測(cè)定RNA-seq數(shù)據(jù)的可變剪切。首先，依據(jù)注釋基因組使用read校準(zhǔn)軟件（MAQ,BWA,Bowtie,SOA2校正短reads,SAMtools將映射成功的結(jié)果輸出為SAM/BAM格式文件（圖7B）,繼續(xù)使用GATK對(duì)已經(jīng)公布的基因進(jìn)行深度覆蓋（圖7C）,未被映射到的reads會(huì)被用于接下來(lái)的剪切點(diǎn)校準(zhǔn)。然后，將已知基因模型及注釋基因通過(guò)剪切位點(diǎn)原則（GT-AG,GC-AG,AT-AC一起用于判定檢測(cè)可能存在的剪切點(diǎn)（圖7D）。然后，那些未被映射的reads會(huì)被用于剪切位點(diǎn)的檢測(cè)（圖7E）,判定標(biāo)準(zhǔn)為至少有兩條reads覆蓋到非重復(fù)匹配位點(diǎn)。最后，所有的鑒定拼接位點(diǎn)與拼接位點(diǎn)信息

12、注釋可變剪切類型（圖7F）。FASputafnsDCand糜gjunclkmsEJUr-aEbCfiamapping圖7SplicingViewer原理Tophat:該軟件利用Bowtie將所有reads映射到參考基因組，未匹配的reads在接下來(lái)的步驟繼續(xù)映射。然后利用MAQ重新將匹配的reads比對(duì)到參考基因組，獲得reads富集的基因組區(qū)域，稱為島序列即潛在的外顯子。軟件繼續(xù)將島序列兩端延長(zhǎng)一定的側(cè)翼序列來(lái)預(yù)測(cè)可變5'供體和可變3'受體，繼續(xù)將臨近的島序列兩兩組合識(shí)別GT-AGg構(gòu)尋找內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。軟件通過(guò)IUM種子延長(zhǎng)方法尋找覆蓋潛在的剪切位點(diǎn)，種子序列確定為供體上游小段序列和下游受體小段序列，軟件繼續(xù)尋找覆蓋到種子位點(diǎn)的序列進(jìn)一步確定種子區(qū)域側(cè)翼的外顯子區(qū)域是否完全匹配，并同時(shí)檢測(cè)剪切的內(nèi)含子是否滿足長(zhǎng)度。最后返回所有滿足條件的剪切位點(diǎn)和組合方式。圖8TopHat原