組織化學(xué)技術(shù)教程2

1、第三章第三章 組織化學(xué)的基本技術(shù)組織化學(xué)的基本技術(shù)組織化學(xué)發(fā)展到今天，它的技術(shù)多而復(fù)雜，但基本技術(shù)是容易掌握的。從樣品的取材、固定劑的選擇、切片的制備、孵育反應(yīng)、各種溶液的配制以及光鏡組織化學(xué)技術(shù)和電鏡組織化學(xué)技術(shù)等，每項(xiàng)技術(shù)都有明確的要求和規(guī)范的操作程序。進(jìn)行沒項(xiàng)工作，應(yīng)事先做好準(zhǔn)備，按技術(shù)程序進(jìn)行，可做一定的預(yù)備實(shí)驗(yàn)，效果穩(wěn)定后，再開始實(shí)驗(yàn)研究，這樣才能達(dá)到預(yù)期的科研效果。一、一、 樣品的取材樣品的取材樣品制備的第一步就是取材，取材的好壞關(guān)系樣品制備的第一步就是取材，取材的好壞關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。所以必須做好準(zhǔn)備工作。如取材的到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。所以必須做好準(zhǔn)備工作。如取材的器材；動(dòng)物標(biāo)本準(zhǔn)備，一

2、般輕微麻醉，迅速取材為器材；動(dòng)物標(biāo)本準(zhǔn)備，一般輕微麻醉，迅速取材為好。現(xiàn)將取材的原則和具體要求分述如下：好?，F(xiàn)將取材的原則和具體要求分述如下：刀剪銳利、潔凈?？焖?、準(zhǔn)確、盡量保持生活狀態(tài)，力爭(zhēng)1分鐘之內(nèi)放入固定液，最遲不能超過3分鐘。要清楚取材的部位和內(nèi)部，對(duì)病理組織還應(yīng)做到以下幾點(diǎn)：材部位必須是主要病變區(qū)。必須取病灶與正常組織的交界區(qū)必要時(shí)取遠(yuǎn)離病灶的正常組織做對(duì)照。 一刀切取，切取應(yīng)在蠟版或?yàn)V紙上進(jìn)行， 避免拉鋸、牽拉或擠壓等動(dòng)作。 低溫操作，防止自溶現(xiàn)象，通常以0-4 的低溫條件下操作為佳。 定位準(zhǔn)確，取材時(shí)必須注意樣品的定向和 定位，即頭、尾、左、右以及上、下方向。 切好的樣品貼放在濾

3、紙片上，標(biāo)記好定向標(biāo) 志，防入預(yù)冷固定液內(nèi)，或冰凍切片或短時(shí) 間冷凍保存。 樣品大小適當(dāng)，光鏡樣品一般在1.0cm以內(nèi)， 免疫組織化學(xué)樣品大約在 : 2cm1.5cm0.3cm厚度控制在0.3cm。 電鏡樣品規(guī)格要求切成0.5-1.0cm3 3小塊。二、二、 固定固定 1 1固定的目的要求固定的目的要求 固定是將組織盡可能保持原有生活狀態(tài)以固定是將組織盡可能保持原有生活狀態(tài)以 適用于某些研究程序的一種方法。固定有適用于某些研究程序的一種方法。固定有 如下幾方面的目的。如下幾方面的目的。 不僅保持組織生前的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還要保持不僅保持組織生前的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還要保持 結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分和活性。結(jié)構(gòu)的化學(xué)成

4、分和活性。 促使組織凝固、硬化，保持一定的形狀、促使組織凝固、硬化，保持一定的形狀、 體積。體積。 增加媒染作用，便于染色；增加折光率，增加媒染作用，便于染色；增加折光率， 便于觀察。便于觀察。 殺死活細(xì)胞或活組織，以進(jìn)行組織化學(xué)反 應(yīng)。由于固定的上述目的要求，許多良好 的組織學(xué)固定液，卻不能用于組織化學(xué)標(biāo) 本，特別是酶組織化學(xué)標(biāo)本和免疫組織化 學(xué)標(biāo)本。2 2固定劑的選擇固定劑的選擇 用于組織化學(xué)的固定劑有很多種，一 般可分為單純固定劑和混合固定劑兩大類。 所有的組織化學(xué)標(biāo)本固定必須根據(jù)其性質(zhì)及 所進(jìn)行的組織化學(xué)反應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌?常用組織化學(xué)固定劑舉例如下： 醛類固定劑：甲醛、戊二醛；中

5、性醛類固定劑：甲醛、戊二醛；中性 福爾馬林，多聚甲醛等。福爾馬林，多聚甲醛等。 非醛類：丙酮、酒精、非醛類：丙酮、酒精、ZenkerZenkerss液液 和和CarnoyCarnoy氏液等等。氏液等等。 應(yīng)用固定劑時(shí)應(yīng)查閱有關(guān)的文獻(xiàn)資 料，對(duì)前人未做的方法應(yīng)慎用。固 定劑穿透組織的速率有很大特異性， 不同的固定液其穿透組織速率可有明 顯的不同（穿透因子不同）： t = kde t=時(shí)間；d=組織深度； k、e為穿透因子（常數(shù)）3 3 固定的方法固定的方法 原位固定法 原位固定法是在保持動(dòng)物對(duì)其器官組織血液供應(yīng)的條件下，邊解剖邊向所取樣本的部位滴加預(yù)冷的固定液的一種方法。這種方法有益于組織細(xì)胞酶

6、活性和結(jié)構(gòu)的保存，不足之處是對(duì)動(dòng)物刺激時(shí)間較長(zhǎng)，因此應(yīng)快速取樣，斷頭處死動(dòng)物。 浸透固定法 浸透固定法是將組織塊浸泡在固定液內(nèi)而固定的一種方法。在組織化學(xué)樣品的處理上，對(duì)浸透的時(shí)間、溫度有一定的要求，特別是免疫組織化學(xué)樣品的要求更嚴(yán)一些。 灌流故定法灌流故定法 灌流故定法是通過血管的途徑，將固定灌流故定法是通過血管的途徑，將固定液灌注到所要固定的器官組織內(nèi)，將生活的液灌注到所要固定的器官組織內(nèi)，將生活的細(xì)胞在原位及時(shí)的固定后，在摘取樣品的方細(xì)胞在原位及時(shí)的固定后，在摘取樣品的方法。這種方法的特點(diǎn)是：快速、固定充分，法。這種方法的特點(diǎn)是：快速、固定充分，但是對(duì)固定液的溫度、壓力及取材時(shí)間有嚴(yán)但是

7、對(duì)固定液的溫度、壓力及取材時(shí)間有嚴(yán)格的要求。格的要求。 培養(yǎng)細(xì)胞和外周血細(xì)胞固定法培養(yǎng)細(xì)胞和外周血細(xì)胞固定法 培養(yǎng)細(xì)胞核外周血細(xì)胞的固定方法比較培養(yǎng)細(xì)胞核外周血細(xì)胞的固定方法比較特殊，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞通常取蓋片入特殊，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞通常取蓋片入37的的 Hanks液中，漂洗兩次液中，漂洗兩次(每次每次35min)，洗除，洗除血清后，再置于甲醛緩沖固定液內(nèi)血清后，再置于甲醛緩沖固定液內(nèi)1030min。.如果進(jìn)行電鏡觀察就以如果進(jìn)行電鏡觀察就以2%戊二醛戊二醛固定或采取雙重固定法。固定或采取雙重固定法。外周血通常采用涂片，以甲醛緩沖固定液固定。電鏡酶組化則須離心沉淀后，用戊二醛固定（具體法見第4，5，6章）

8、。4 固定后的處理固定后的處理漂洗漂洗 已固定的組織樣品，在切片之前必須進(jìn)行漂洗，其主要目的是洗去組織中存余的固定液。這樣做有助于酶活性的提高，可避免樣品下一步和其它液相的液體接觸，引起組織的結(jié)構(gòu)改變和酶活性的降低，漂洗要求最適的PH值、滲透壓、溫度和時(shí)間來進(jìn)行,否則會(huì)影響試驗(yàn)的結(jié)果。三三 組織切片技術(shù)組織切片技術(shù)一般的組織化學(xué)染色切片厚度要求在57m左右，神經(jīng)組織切片的厚度要求比較特殊，一般在20100m之間，以便觀察神經(jīng)纖維的走行。對(duì)于不同的組化反應(yīng)在切片制作上有不同的要求。目前的切片技術(shù)主要有：冰凍切片、石蠟切片、超薄切片（電鏡學(xué)）。 1冰凍切片冰凍切片冰凍切片是酶組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)

9、最常用的方法。它的突出特點(diǎn)：能比較好地保存組織的酶活性，較完好地保存組織抗原的免疫活性。 驟冷（驟冷（Quenching）1）驟冷的目的最主要的目的是防止標(biāo)本內(nèi)的水結(jié)成冰晶破壞標(biāo)本結(jié)構(gòu)。殺死組織（細(xì)胞）?？旖葜破?。2）驟冷的方法 一般可以用四種方法驟冷，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件選擇。 Chayen氏驟冷法氏驟冷法（目前常用的驟冷法之一）（目前常用的驟冷法之一） 液氮法液氮法 (也是常用的驟冷方法之一也是常用的驟冷方法之一) 凍干燥法（抽干組織中的水分）凍干燥法（抽干組織中的水分） 冷凍替代法（置換組織中的水分）冷凍替代法（置換組織中的水分） 切片切片驟冷后的組織塊切片機(jī)上切片，目前的切片機(jī)有兩類：1）

10、開放式冰凍切片機(jī)（半導(dǎo)體制冷切片機(jī)、甲醇制冷切片機(jī)及老式CO2、氯乙烷等切片機(jī)）。開放式冰凍切片機(jī)由于暴露于空氣中，溫度不易控制，技術(shù)難度大，現(xiàn)多已淘汰。2）恒溫冰凍切片機(jī)（Cryastat）常用恒溫冰凍切片機(jī)切片后如不染色，必須冷 風(fēng)吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)或短暫預(yù)固定 后，冰箱貯存。2 石蠟切片石蠟切片常規(guī)石蠟切片、常規(guī)石蠟切片、HE染色染色程序：程序：取材固定脫水：升梯度酒精脫水50%70%80%90%95%100% 34h 1.5h透明：用二甲苯、觀察組織塊至透明為止（0.51h，共兩次）浸蠟：一般用兩個(gè)蠟缸。石蠟（601h；石蠟（60）2h。包埋：鐵板架包埋或其他容器，有時(shí)要求快速冷卻

11、。切片和貼片：在切片機(jī)上切片，置水槽中展片、撈片和貼片。染色HE染色步驟：1）二甲苯510分鐘，脫去切片中的石蠟。2）降濃度梯度酒精脫水（100%95%90%80%70%）。每級(jí)脫水23分鐘以除二甲苯。3）蒸餾水洗，去乙醇1030分鐘。4）蘇木精，染細(xì)胞核，23分鐘。5）0.5%鹽酸酒精分化數(shù)秒。6）流水沖洗，3040分鐘。7）入伊紅23分鐘，細(xì)胞染成粉紅色。8）水洗，去浮色，數(shù)秒。9）升梯度酒精脫水（70%80%90%95%100%），每級(jí)35分鐘。10）二甲苯10分鐘，使標(biāo)本透明。11）封固。 酶組化和免疫組化與常規(guī)石蠟切片略有不同：酶組化和免疫組化與常規(guī)石蠟切片略有不同： 脫水脫水透明應(yīng)

12、在透明應(yīng)在4下進(jìn)行，以盡量減少酶和抗原的損失。下進(jìn)行，以盡量減少酶和抗原的損失。 組織組織塊：塊：2cm1.5cm0.3cm。以充分脫水、透明、浸蠟。以充分脫水、透明、浸蠟 浸浸蠟、包埋：蠟、包埋：60，軟蠟為佳，軟蠟為佳。 四、孵育反應(yīng)四、孵育反應(yīng) 1 1 配制孵育液的要求配制孵育液的要求 清洗器具，過酸沖洗。 現(xiàn)用現(xiàn)配，保持新鮮。 嚴(yán)格配比，保持平衡。 防止污染，過濾為佳。 優(yōu)選試劑，注意純度。 2 2 孵育的溫度和時(shí)間孵育的溫度和時(shí)間 溫度對(duì)酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)影響很大，一般孵育的溫度有37（溫箱）；1520（室溫；04可延長(zhǎng)時(shí)間，一般為幾個(gè)小時(shí)乃至過夜。最佳條件要根據(jù)所用樣品的種類以及固定的不同條件而定，因此應(yīng)借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)安排預(yù)實(shí)驗(yàn)。3 3孵育的方法孵育的方法 常用的孵育方法有兩種，即貼片孵常用的孵育方法有兩種，即貼片孵育法和漂浮孵育