細胞培養(yǎng)及材料細胞毒性檢測

1、前言細胞培養(yǎng)的基本概念細胞培養(yǎng)的基本條件細胞培養(yǎng)的基本方法細胞培養(yǎng)的污染和檢測細胞凍存和復(fù)蘇細胞管理及保藏細胞毒性檢測 Wilhelm Roux (1850-1924 ) 1885年年Roux最早嘗試使組最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，并首次采用組織培養(yǎng)這個術(shù)語。并首次采用組織培養(yǎng)這個術(shù)語。1.1.前言前言Alexis CarrelFranceRockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USAb. 1873d. 1944 1907年年Harr

2、ison 和和1912年年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動物細種方法，用于研究離體動物細胞的培養(yǎng)。胞的培養(yǎng)。 他建立的雞胚胎成纖維細胞他建立的雞胚胎成纖維細胞持續(xù)了持續(xù)了34年之久年之久(1912-1946) 器官培養(yǎng) (Organ culture)：將活體中整個器官或一部分器官取出，置于體外生存、生長并同時保持其一定的結(jié)構(gòu)和功能特征。組織培養(yǎng) (Tissue culture)：把活體的一小片組織（O.51立方毫米）置于底物上孵育，細胞自其周圍移出并生長。細胞培養(yǎng)(cell culture)：把提取的組織用機械或消化的方法分散成單個細胞懸液，后進行培養(yǎng)

3、，增殖。腫瘤腫瘤胚胎胚胎成體成體粗切粗切消化消化細切細切修切修切細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng) 組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)活細胞活細胞便于觀察檢測便于觀察檢測條件可控條件可控均一性均一性便于人工篩選便于人工篩選失去原有組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)，趨向單一性失去原有組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)，趨向單一性分化減弱分化減弱可能獲得不死性可能獲得不死性貼壁型：動物的正常細胞貼壁型：動物的正常細胞懸浮型：血液淋巴細胞、腫瘤細胞、植物細胞懸浮型：血液淋巴細胞、腫瘤細胞、植物細胞固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)來源：由來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源中胚層間充質(zhì)組織起源的組織的組織 如：真正的成纖維細胞如：真正的成纖維細胞 心肌，平滑肌，成骨細胞，內(nèi)皮細

4、胞心肌，平滑肌，成骨細胞，內(nèi)皮細胞形態(tài)：形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細胞似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)的形態(tài) 胞體梭形胞體梭形或不規(guī)則三角形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出胞質(zhì)向外伸出23個個長短不等的突起長短不等的突起 中有卵圓形核中有卵圓形核 生長特點：生長特點： 排列成排列成放射狀放射狀，漩渦狀，漩渦狀 并不緊靠連成片并不緊靠連成片， 細胞細胞細胞接觸易斷開而細胞接觸易斷開而單獨行動單獨行動 原代細胞：從機體取出后立即培養(yǎng)原代細胞：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞的細胞原代培養(yǎng)：將從體內(nèi)取出的細胞進原代培養(yǎng)：將從體內(nèi)取出的細胞進行培養(yǎng)行培養(yǎng)傳代培養(yǎng)：從原代培養(yǎng)細胞繼續(xù)轉(zhuǎn)傳代培養(yǎng)：從原代培養(yǎng)細胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)接培養(yǎng)傳代

5、細胞：在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代細胞：在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞傳代培養(yǎng)的細胞無菌無菌無毒、生物相容性無毒、生物相容性清潔的環(huán)境清潔的環(huán)境品質(zhì)良好的細胞來源，培養(yǎng)基配制使用高純度藥品品質(zhì)良好的細胞來源，培養(yǎng)基配制使用高純度藥品和去離子水和去離子水有標(biāo)準化的工作方法有標(biāo)準化的工作方法 培養(yǎng)用的液體極多，應(yīng)由專人負責(zé)，配制濃度準確，培養(yǎng)用的液體極多，應(yīng)由專人負責(zé)，配制濃度準確，所有配好的溶液瓶上都要標(biāo)明名稱、濃度、消毒與所有配好的溶液瓶上都要標(biāo)明名稱、濃度、消毒與否和制備日期等否和制備日期等一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點，避免雜亂無章，一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點，避免雜亂無章，其中尤其重

6、要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴格其中尤其重要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴格分開，已消毒品與未消毒品應(yīng)分別存放分開，已消毒品與未消毒品應(yīng)分別存放無菌條件無菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工超凈工作臺作臺，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素器，抗生素細胞生長條件細胞生長條件：培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，：培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清培養(yǎng)基，血清細胞檢測條件細胞檢測條件：倒置顯微鏡倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，微孔板，酶標(biāo)儀，微孔板震蕩器，高速

7、離心機，移液器震蕩器，高速離心機，移液器細胞保存條件細胞保存條件：液氮罐，超低溫冰箱：液氮罐，超低溫冰箱超凈工作臺高壓蒸汽滅菌器過濾除菌裝置倒置顯微鏡水純化裝置恒溫培養(yǎng)箱電熱干燥箱離心機、天平、水浴、搖床液氮罐冰箱：4、-20 、-80 移液器移液器移液管移液管吸管吸管培養(yǎng)瓶：培養(yǎng)瓶： 25cm25cm2 2、75cm75cm2 2、150cm150cm2 2培養(yǎng)皿：培養(yǎng)皿： 3030、6060、120120毫米毫米多孔培養(yǎng)板：多孔培養(yǎng)板： 4 4、6 6、2424、9696孔孔離心管離心管凍存管凍存管基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8095血清 520青、鏈霉素 各100Uml天然培養(yǎng)基： 血清 血漿 組織提取

8、液（如雞胚和牛胚浸液） 合成培養(yǎng)基： 根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。包括四大類物質(zhì)：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物目前常用培養(yǎng)基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM、人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 馬血清等優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準 透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、 病毒污染。血清的滅活（消除補體活性） 56 ，30 分鐘。血清的消毒：過濾除菌其他細胞培養(yǎng)用液n水：新鮮的三蒸水或去離子水n平衡鹽溶液 主要由無機鹽和葡萄糖配制而成 作用：維持滲透壓

9、、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度 常用的緩沖液： 生理鹽水 PBS Hanks液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）n通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。n配制 具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬U/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬U/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬U。 n使用時溶入培養(yǎng)液中，使青、鏈霉素的濃度最終為100U/ml。n慶大霉素：使用終濃度為100U/ml，廣譜、穩(wěn)定。主要作用： 水解與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，使貼壁細胞從瓶壁上脫落并使細胞分離。常用濃度：0.25% 用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液或D-Hank

10、s配制，用濾器過濾除菌。消化時間： 用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用。 物物 品品濕濕 熱熱干干 熱熱過過 濾濾紫紫 外外化學(xué)化學(xué)氣體氣體消毒劑消毒劑電離電離輻射輻射培養(yǎng)室培養(yǎng)室工作臺工作臺玻璃玻璃制品制品金屬金屬器械器械塑料塑料制品制品橡膠橡膠制品制品培養(yǎng)培養(yǎng)用液用液布類布類棉類棉類 貼附生長型細胞 必須貼附于底物才能生長的細胞。從形態(tài)上大體分為上皮細胞型及成纖維細胞型，還有一些難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的細胞。粘著、粘附粘著、粘附（attachment）鋪展鋪展（spreading)1）取材）取材 切割切割組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法2）直接購買）直接購買 培養(yǎng)培養(yǎng)（原代培養(yǎng)）

11、 體外培養(yǎng)的原代細胞或細胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細胞株或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續(xù)。 培養(yǎng)的細胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。棄去舊培養(yǎng)液棄去舊培養(yǎng)液 清洗清洗 加入消化液加入消化液 吸棄消化液吸棄消化液 加入培養(yǎng)液加入培養(yǎng)液 吹打分散細胞吹打分散細胞 分裝稀釋細胞分裝稀釋細胞 補加培養(yǎng)液補加培養(yǎng)液 繼續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)接種數(shù)量為51048105個/ml。傳代密度太低，細胞容易死亡，表現(xiàn)出細胞在達到增長前有較長的滯留期。培養(yǎng)液由于pH下

12、降而呈現(xiàn)黃色，表明細胞已經(jīng)達到最大密度需要換液或進行傳代培養(yǎng)。如果是單層貼壁的細胞，等長滿培養(yǎng)瓶表面，即可進行傳代。游離期游離期 懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細胞變?yōu)閳A球形。吸附期吸附期 貼附底物，一般24小時內(nèi)貼壁。潛伏期潛伏期 此時細胞有生長活動，基本無增殖。 細胞株潛伏期一般為624小時。對數(shù)生長期對數(shù)生長期 細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。停止期（平臺期）停止期（平臺期） 細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂。 機制：接觸抑制、密度依賴性肉眼觀察：培養(yǎng)液的顏色和透明度肉眼觀察：培養(yǎng)液的顏色和透明度顯微鏡觀察顯微鏡觀察生長良好的細胞：細胞透明度大，折光性強，生長良好的細

13、胞：細胞透明度大，折光性強，輪廓不清輪廓不清生長狀態(tài)不良的細胞：細胞輪廓增強，細胞折生長狀態(tài)不良的細胞：細胞輪廓增強，細胞折光性變?nèi)?；胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒光性變?nèi)?；胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)；細胞之間空隙增大；細胞形態(tài)不規(guī)則，狀物質(zhì)；細胞之間空隙增大；細胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細胞的特點，產(chǎn)生圓縮脫落；有甚至失去原有細胞的特點，產(chǎn)生圓縮脫落；有時細胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物時細胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物每毫升細胞數(shù)每毫升細胞數(shù)血細胞計數(shù)板血細胞計數(shù)板細胞生長曲線細胞生長曲線貼壁率貼壁率有絲分裂指數(shù)有絲分裂指數(shù)(MI)(MI)：分裂相數(shù)量占全部細胞數(shù)：分裂相數(shù)量占全部細胞數(shù)量的

14、百分比量的百分比細胞群體倍增時間細胞群體倍增時間四唑鹽四唑鹽(MTT)(MTT)比色法比色法標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷( (3 3H-TdR)H-TdR)摻入量摻入量細胞活力：總細胞中活細胞所占的百分比細胞活力：總細胞中活細胞所占的百分比臺盼藍法臺盼藍法四唑鹽四唑鹽(MTT)(MTT)比色法比色法熒光素雙乙酸酯法熒光素雙乙酸酯法(FDA)(FDA)四唑鹽（四唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法MTT比色法的原理： 活細胞中琥珀脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物甲臢（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。 二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物

15、，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm處產(chǎn)生吸收值，用酶標(biāo)儀測定A值。細胞大小：顯微測微計法細胞大?。猴@微測微計法細胞重量：稱重法細胞重量：稱重法鮮重鮮重干重干重細胞固定細胞固定蘇木精蘇木精- -伊紅染色伊紅染色GiemsaGiemsa染色染色FeulgenFeulgen染色染色考馬斯藍染色考馬斯藍染色免疫法免疫法細胞核染色：細胞核染色：HoechstHoechst、DAPIDAPI混濁、混濁、pHpH異常改變、細胞外形異常改變、細胞外形模糊、漂浮的集落模糊、漂浮的集落細胞出現(xiàn)增殖緩慢或死亡細胞出現(xiàn)增殖緩慢或死亡化學(xué)物質(zhì)的污染化學(xué)物質(zhì)的污染非同種細胞污染非同種

16、細胞污染微生物污染：細菌、真菌、支微生物污染：細菌、真菌、支原體、病毒原體、病毒培養(yǎng)液變黃，出現(xiàn)渾濁培養(yǎng)液變黃，出現(xiàn)渾濁鏡下可見圓球狀顆粒漂浮鏡下可見圓球狀顆粒漂浮預(yù)防和處理：青霉素、鏈霉素預(yù)防和處理：青霉素、鏈霉素培養(yǎng)液一般不渾濁培養(yǎng)液一般不渾濁白色或黃色小點漂浮于培養(yǎng)基表面白色或黃色小點漂浮于培養(yǎng)基表面光鏡觀察到菌絲光鏡觀察到菌絲預(yù)防和處理：抗真菌劑預(yù)防和處理：抗真菌劑可透過濾膜無細胞壁細胞營養(yǎng)液細胞營養(yǎng)液仍清亮但仍清亮但變黃，細胞生長變緩變黃，細胞生長變緩，部分細胞發(fā)生部分細胞發(fā)生脫落脫落，細胞間隙可見鋪滿，細胞間隙可見鋪滿細沙樣小點細沙樣小點。預(yù)防預(yù)防重新培養(yǎng)重新培養(yǎng)鑒別鑒別清除：抗生

17、素、加溫、支原體特異性血清、共培養(yǎng)清除：抗生素、加溫、支原體特異性血清、共培養(yǎng)法、重新克隆法、動物體內(nèi)接種除菌法法、重新克隆法、動物體內(nèi)接種除菌法防止交叉污染防止交叉污染慢凍快融慢凍快融低溫保護劑：低溫保護劑：10%10%的甘的甘油或二甲亞砜油或二甲亞砜DMSODMSO 細胞深低溫保存的基本原理： -80以下時，細胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長期保存。 當(dāng)細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫當(dāng)細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步

18、脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶會造成細胞膜、細胞大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。 對已建成的各種細胞系或細胞株習(xí)慣上都給以名稱；細胞的對已建成的各種細胞系或細胞株習(xí)慣上都給以名稱；細胞的命名無嚴格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用有一定意義縮寫字母或代號命名無嚴格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用有一定意義縮寫字母或代號表示。但不論什么形式，均不宜太長，以便記憶和了解。表示。但不論什么形式，

19、均不宜太長，以便記憶和了解。HeLaHeLa：為供體患者的姓名：為供體患者的姓名(Henrietta Lacks(Henrietta Lacks，來源于宮頸癌，來源于宮頸癌) )CHOCHO：中國倉鼠卵巢細胞：中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary)(Chinese Hamster Ovary)NIH/3T3NIH/3T3：美國國立衛(wèi)生研究所：美國國立衛(wèi)生研究所(National Institute of (National Institute of Health)Health)建立建立, , 每每3 3天傳代一次，每次接種天傳代一次，每次接種3 310106 6細胞毫升。細胞毫升。主細胞庫主細胞庫生產(chǎn)用細胞庫生產(chǎn)用細胞庫原始細胞庫主細胞庫生產(chǎn)細胞庫ATCC (American Type Culture ATCC (American Type Culture Collection) Collection) ECACC (European Collection of Cell ECACC (European Coll