細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法

1、細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法形態(tài)學(xué)光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡未染色細(xì)胞凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡 一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。 常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)

2、時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。 Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為25mg/ml。 DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 1mg/ml。結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；b期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體3 透射電子顯微鏡觀察 結(jié)果評(píng)判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡期（pro-apoptosis nucl

3、ei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤(pán)繞，出現(xiàn)許多稱(chēng)為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V

4、作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染 因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。方法 1 懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.51106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應(yīng)5min后，加入400ul Bind

5、ing Buffer，立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)（一般不超過(guò)1h）， 同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對(duì)照。 2 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞。 3 爬片細(xì)胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果注意事項(xiàng)：1. 整個(gè)操作動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞。2. 操作時(shí)注意避光，反應(yīng)完畢后盡快在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。三、線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè) 線粒體在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生

6、在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn) 線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽(yáng)離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodideDiOC6（3）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。 方法：將正常培養(yǎng)的細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加入使用終濃度為Rhodami

7、ne 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37C平衡30min，流式細(xì)胞儀計(jì)檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。 注意事項(xiàng) 1 始終保持平衡染液中pH值的一致性，因?yàn)閜H值的變化將影響膜電位。 2 與染料達(dá)到平衡的細(xì)胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合，降低染料的濃度，引起假去極化。四、DNA片斷化檢測(cè) 細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50300kbp長(zhǎng)的DNA大片段, 或180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用

8、常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。1. 大分子染色體DNA片段的測(cè)定 細(xì)胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50300kbp長(zhǎng)的DNA大片段。所有超過(guò)一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過(guò)凝膠半徑時(shí)，即達(dá)到分辨力的極限。此時(shí)凝膠不再按分子量的大小來(lái)篩分DNA，DNA像通過(guò)彎管一樣，以其一端指向電場(chǎng)一極而通過(guò)凝膠，這

9、種遷移模式稱(chēng)之為爬行。因此，細(xì)胞凋亡早期產(chǎn)生的50300kbp長(zhǎng)的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿(mǎn)地解決這一問(wèn)題。這個(gè)方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場(chǎng)。每當(dāng)電場(chǎng)方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場(chǎng)軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動(dòng)。DNA分子量越大，這種重排所需要的時(shí)間就越長(zhǎng)。當(dāng)DNA分子變換方向的時(shí)間小于電脈沖周期時(shí)，DNA就可以按其分子量大小分開(kāi)。2 DNA Ladder 測(cè)定 2 DNA Ladder 測(cè)定 方法：收獲細(xì)胞（1X107）沉淀?細(xì)胞裂解液?13000rpm5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/m

10、l）56C， 2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無(wú)水乙醇沉淀DNA，4C過(guò)夜?14000rpm15min?最后將沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相。 3 凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞計(jì)分析 方法：收集細(xì)胞，70%冷乙醇（in PBS）4C固定過(guò)夜，PBS洗滌，1000rpm10min RNase A（0.5mg/ml）37C消化30min PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min，F(xiàn)ACScan分析DNA亞二倍體的形成及細(xì)胞周期的變化。 結(jié)果： 4. ApoA

11、lertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH) 優(yōu)點(diǎn)：敏感度高，適合于檢測(cè)少量樣本，小部分凋亡細(xì)胞。如臨床活組織檢測(cè)。五 TUNEL法 細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類(lèi)方法稱(chēng)為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TU

12、NEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。六、Caspase-3活性的檢測(cè) Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）

13、的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。 1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對(duì)底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。 方法： 收集細(xì)胞PBS洗滌抽提細(xì)胞裂解液蛋白定量SDS-PAGE電泳硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移5%脫脂奶粉封閉，室溫1.52h或4C過(guò)夜Caspase-3多抗或單

14、抗室溫反應(yīng)12h或4C過(guò)夜TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，510min/次HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)12h TBS-T洗3次， 510min/次?ECL顯影或NBT/BCIP顯色。1 2 熒光分光光度計(jì)分析 原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測(cè)定caspase-3的活性，從而反映Caspase-

15、3被活化的程度。方法：收獲細(xì)胞正常或凋亡細(xì)胞，PBS洗滌，制備細(xì)胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37C反應(yīng)1h，熒光分光光度計(jì)（Polarstar）分析熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長(zhǎng)380nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為430-460nm）。 結(jié)果： 3 流式細(xì)胞術(shù)分析 方法：收獲細(xì)胞正常或凋亡細(xì)胞?PBS洗滌，加Ac-DEVD-AMC 37C反應(yīng)1h UV流式細(xì)胞計(jì)分析caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度。 結(jié)果：七、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析 TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國(guó)際上首先報(bào)導(dǎo)的一個(gè)擁有自己知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人類(lèi)新基因，前期的功能研究表明

16、，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，伴隨著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，在凋亡小體中仍然可見(jiàn)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。材料試劑：

17、FITC標(biāo)記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，熒光細(xì)胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。 儀器：低溫水平離心機(jī), 37C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細(xì)胞計(jì)方法：1 懸浮細(xì)胞的染色：（1）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（0.51106），PBS洗2次，1000rpm10min。（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm10min。（3）加入PBS-T溶液，

18、37C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm10min。（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應(yīng)30min。（5）加入5ml FITC標(biāo)記的TFAR19單抗（終濃度為1：40），4C反應(yīng)30min（6）熒光細(xì)胞洗液洗2次，1000rpm 10min。結(jié)果觀察：將細(xì)胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。同時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)定量檢測(cè)TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果 2：貼壁細(xì)胞的原位染色 （1） 貼壁生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期細(xì)胞鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長(zhǎng)，待長(zhǎng)到 50%80%滿(mǎn)時(shí)，凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞。 （2） 將不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光

19、染色，染色步驟同上。 （3） 將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微 鏡觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。結(jié)果觀察 3：臨床病理切片的染色、檢測(cè)。 4：原代細(xì)胞的培養(yǎng)、檢測(cè)。 5：分析TFAR19蛋白在人體內(nèi)各組織器官的分布及定位（二）TFAR19蛋白的表達(dá)與臨床疾病1 ELISA法檢測(cè)正常人和疾病狀態(tài)下，以及疾病的不同時(shí)期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。材料和試劑：1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 203. 封閉液： 3%BSA（用洗滌液配制）4. 酶標(biāo)抗體的稀釋?zhuān)河梅忾]液稀釋5. OPD底物：Na2HPO4.12H2O 1.84g檸檬酸 0.51gBufferDDW 100ml6.