專題一基因工程基本操作程序

1、基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲取目的基因的獲取 2.表達載體的構(gòu)建表達載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞4.目的基因的的檢測與鑒定目的基因的的檢測與鑒定第一步第一步: :目的基因的獲取目的基因的獲取 常用的方法常用的方法 1 1 從基因文庫中獲取從基因文庫中獲取目的基因目的基因2 2 已知序列已知序列: :利用利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因 3 3 基因較小已知序列基因較小已知序列: :通過通過DNADNA合成儀用合成儀用化學方法直接人工合成化學方法直接人工合成目的基因目的基因未知序列的建立基因組文庫從中獲得目的基因未知序列的建立基因組文庫從中

2、獲得目的基因已知已知mRNAmRNA序列用反轉(zhuǎn)錄法建立序列用反轉(zhuǎn)錄法建立cDNAcDNA文庫獲得目的基因文庫獲得目的基因理論支持理論支持:DNA:DNA復制原理復制原理基因組含此種生物的一整套遺傳信息如如:cDNA:cDNA文庫文庫基基因因組組文文庫庫cDNAcDNA文庫文庫提取某生物提取某生物全部全部DNA用適當用適當限制酶切割限制酶切割許許 多多DNA片段片段與載體連接與載體連接導入受體菌群導入受體菌群該生物基該生物基因組文庫因組文庫與載體連接與載體連接導入受體菌導入受體菌群群mRNA逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶酶雜交雙鏈雜交雙鏈核酸酶核酸酶H單鏈單鏈DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNA(cDNA)該

3、生物該生物cDNA文庫文庫知識點一：知識點一：1.1.原核細胞的基因結(jié)構(gòu)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點聚合酶結(jié)合位點啟動子啟動子終止子終止子啟動子：啟動子：位于基因首端一段能與位于基因首端一段能與RNARNA聚合酶結(jié)合并能起聚合酶結(jié)合并能起始始mRNAmRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：終止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片斷，它能片斷，它能阻礙阻礙RNARNA聚合酶的移動，并使其從聚合酶的移動

4、，并使其從DNADNA模板鏈上脫離下來，模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。使轉(zhuǎn)錄終止。RNARNA聚合酶聚合酶: :能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì)的一種蛋白質(zhì).(.(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落) )不能轉(zhuǎn)錄為信使不能轉(zhuǎn)錄為信使RNARNA，不能，不能 編碼蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應的信使：能轉(zhuǎn)錄相應的信使RNARNA，能，能 編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細胞細胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)有調(diào)控遺傳信息表達的核有調(diào)控遺傳信息表達的核 苷酸序列，在該序列中，苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區(qū)上最重

5、要的是位于編碼區(qū)上 游的游的RNARNA聚合酶結(jié)合位點。聚合酶結(jié)合位點。非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點結(jié)合位點內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子含子啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子：內(nèi)含子： 外顯子：外顯子： 知識點一：知識點一：2.2.真核細胞的基因結(jié)構(gòu)真核細胞的基因結(jié)構(gòu)真核真

6、核細胞細胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的包括位于編碼區(qū)上游的RNARNA 聚合酶結(jié)合位點等。聚合酶結(jié)合位點等。比較比較見教材第見教材第10頁表格頁表格 野生稻是水稻的原始祖先，被專家野生稻是水稻的原始祖先，被專家稱為稱為“植物中的大熊貓植物中的大熊貓”，蘊藏著十分，蘊藏著十分豐富的優(yōu)良基因。世界上目前共有豐富的優(yōu)良基因。世界上目前共有20種種野生稻種，其中中國有野生稻種，其中中國有3種，即藥用野

7、生種，即藥用野生稻、普通野生稻和疣粒野生稻。中國野稻、普通野生稻和疣粒野生稻。中國野生稻在云南分布最廣，生態(tài)類型多。生稻在云南分布最廣，生態(tài)類型多。 調(diào)調(diào)查顯示作為我國野生稻資源最豐富的廣查顯示作為我國野生稻資源最豐富的廣東和海南，普通野生稻的個分東和海南，普通野生稻的個分布點已消失了。云南省農(nóng)科院生布點已消失了。云南省農(nóng)科院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所目前為該省分物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所目前為該省分布的布的3種野生稻建立了基因文庫種野生稻建立了基因文庫( (二二) )利用利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因( (二二) )利用利用PCRPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因 概念：概念

8、：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復制復制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 條件：條件：_、 _ _、_ (_ (做啟動子做啟動子) )、 _._.原理原理: :_ _方式：方式：以以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增為擴增循循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果： 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復制復制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物DNADNA聚合酶聚合酶指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增利用利用PC

9、RPCR技術(shù)擴增目的基因技術(shù)擴增目的基因過程過程：a a、DNADNA變性變性（90-990-95 5）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_B B、復性復性（5 55-65-60 0）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物物與與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，從酶的作用下，從 引物的引物的55端端33端延伸，合成與模板互補端延伸，合成與模板互補 的的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈DNA合成儀合成儀推推測測推推測測合合成

10、成1.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對應的內(nèi)容，正確的組合是應的內(nèi)容，正確的組合是2 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是、下列屬于獲取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫中提取反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫中提取從受體細胞中提取從受體細胞中提取 利用利用PCRPCR技術(shù)技術(shù) 利用利用DNADNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 人工合成人工合成A.A. B. B. C. C. D. D.質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA連接酶連接酶重組重組DNA1.1.用一定的用一定的_切割切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出

11、口，露出_。2.2.用用_切斷目切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。 核心核心3.3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNADNA分子（重組質(zhì)粒：實際上是不同來源的基因分子（重組質(zhì)粒：實際上是不同來源的基因重組的過程）重組的過程）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同第二步：基因表達載體的構(gòu)建第二步：基因表達載體的構(gòu)建 科學家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的

12、抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。 然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。 作為基因表達載體只需含有目的基因就可以完成任務嗎作為基因表達載體只需含有目的基因就可以完成任務嗎? ? 下列結(jié)構(gòu)中是基因表達下列結(jié)構(gòu)中是基因表達載體組成必需的是載體組成必需的是？ A A、目的基因目的基因 B B、啟動子啟動子 C C、終止子終止子 D D、標記基因標記基因 E E、抗生素基因抗生素基因

13、 F F、復制原點、復制原點第二步第二步: : 基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體的構(gòu)建核心核心 復制原點復制原點+ +目的基因目的基因+ +啟動子啟動子+ +終止子終止子+ +標記基因標記基因構(gòu)建目的：構(gòu)建目的：使目使目的基因在受體細的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給并且可以遺傳給下一代，同時使下一代，同時使目的基因能夠表目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。達和發(fā)揮作用。第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目的基因進入目的基因進入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細胞內(nèi)維持受體細胞內(nèi)維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達1 1、將目的基因

14、導入植物細胞的方法：、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ海?）農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化法法 農(nóng)桿菌特點：農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力子葉植物沒有感染能力原理：原理：Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的色體的DNA上。上。 目的基因插入目的基因插入TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA上上 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌 導入植物細胞導入植物細胞 整合到受體細胞的染色體上整合到受體細胞的染色體上 目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表

15、達3.轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)氲侥隳芊治龀鲛r(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)氲絾巫尤~植物的原因嗎單子葉植物的原因嗎? ?若想將一個抗病基若想將一個抗病基因?qū)胄←溨幸驅(qū)胄←溨? ,理論上你認為應該怎么做理論上你認為應該怎么做? ?（2）基因槍法基因槍法( (單子葉植物常用的方法單子葉植物常用的方法) ) （3）花粉管通道法：花粉管通道法：（我國科學家獨創(chuàng)，（我國科學家獨創(chuàng)， 如轉(zhuǎn)基因抗蟲棉）如轉(zhuǎn)基因抗蟲棉）2 2、將目的基因?qū)雱游锛毎?、將目的基因?qū)雱游锛毎椒ǎ猴@微注射法方法：顯微注射法程序：程序：目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯

16、微注射 受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動物2.微生物作受體細胞原因：微生物作受體細胞原因：3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?.轉(zhuǎn)化方法：轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌大腸桿菌繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少處理細胞細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合 _細胞吸收DNA分子。Ca2+感受態(tài)感受態(tài)感受態(tài)感受態(tài)1.常用菌：常用菌：第三步第三步: :將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞生物種類生物種類植物植物動物動物微生物微生物常用方法常用方法受體細胞受體細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法化法顯微注射顯微注射法法Ca2+處理法處理法體細胞體細胞受精卵受精卵原核細胞原

17、核細胞第四步第四步: :目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定 外 源外 源基因基因受體細胞受體細胞染色體染色體mRNAmRNA蛋白蛋白質(zhì)質(zhì)性狀性狀 檢測：導入？檢測：導入？ 檢測：轉(zhuǎn)錄？檢測：轉(zhuǎn)錄？ 檢測：翻譯？檢測：翻譯？ 鑒定：表現(xiàn)？鑒定：表現(xiàn)？ DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交抗原抗體雜交抗原抗體雜交抗蟲鑒定、抗蟲鑒定、抗病鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等活性鑒定等復復性性抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法方法: :抗原抗原-抗體雜交抗體雜交例：用棉鈴飼喂棉例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入中毒癥狀，說明未

18、攝入目的基因或攝入目的基目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達?？瓜x基因并得到表達。歸納: 基因工程的基本操作程序 獲取目的基因獲取目的基因u從基因文庫從基因文庫u利用利用PCRPCRu化學方法人工合成化學方法人工合成 構(gòu)建基因表達載體構(gòu)建基因表達載體u目的基因、啟動子、終止子、標記基因目的基因、啟動子、終止子、標記基因 將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞u農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法 目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定u檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯u鑒定

19、：鑒定：練一練練一練1 1：由同一種限制性內(nèi)切酶切割成的黏性末端是：由同一種限制性內(nèi)切酶切割成的黏性末端是TCG TCG AATTCGA AATTCGA AGCTTAA GCT AGCTTAA GCT CA CA AGCTTC AGCTTC AATTGA AATTGA GTTCCA AG ACT GTTCCA AG ACT A A、 B B、 C C、 D D、 E E、2.細菌的質(zhì)粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗細菌的質(zhì)粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B有利于對目的基因是否導入進行檢測C增加

20、質(zhì)粒分子的分子量D便于與外源基因連接3.3. 有關(guān)基因工程的敘述正確的是有關(guān)基因工程的敘述正確的是A限制酶只在獲得目的基因時才用B重組質(zhì)粒的形成是在細胞內(nèi)完成的C質(zhì)粒都可作為運載體 D蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料4.哪項不是基因表達載體的組成部分哪項不是基因表達載體的組成部分( ) A.啟動子 B.終止密碼 C.標記基因 D.目的基因5.下列哪項不是將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄏ铝心捻棽皇菍⒛康幕驅(qū)胫参锛毎姆椒? ) A基因槍法 B顯微注射法 C.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 D花粉管通道法 胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以胰島素是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取

21、，來只能依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg100Kg胰腺只能提取胰腺只能提取4-5g4-5g的胰島素，其產(chǎn)的胰島素，其產(chǎn)量之低和價格之高可想而知。量之低和價格之高可想而知。 假如讓你用基因工程的方法使大腸桿菌假如讓你用基因工程的方法使大腸桿菌生產(chǎn)出人的胰島素，想一想，如何設(shè)計？生產(chǎn)出人的胰島素，想一想，如何設(shè)計？ 嘗試設(shè)計嘗試設(shè)計 植物基因工程碩果累累植物基因工程碩果累累動物基因工程前景廣闊動物基因工程前景廣闊基因工程藥物異軍突起基因工程藥物異軍突起基因治療曙光初照基因治療曙光初照基因工程的應用基因工程的應用1.植物基因工程碩果累累植物基因工程碩果累累 1）抗蟲轉(zhuǎn)基因植物）抗蟲轉(zhuǎn)基因植物 2）抗病轉(zhuǎn)基因植物）抗病轉(zhuǎn)基因植物 3）抗逆轉(zhuǎn)基因植物）抗逆轉(zhuǎn)基因植物 4）改良植物品質(zhì)）改良植物品質(zhì)2.動物基因工程前景廣闊動物基因