第四章高效液相色譜

1、高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于19671967年面世，年面世，導(dǎo)致高效液相色譜法導(dǎo)致高效液相色譜法(high-performance liquid (high-performance liquid chromatographychromatography，HPLC)HPLC)的產(chǎn)生。的產(chǎn)生。 薄殼型填料，柱效薄殼型填料，柱效僅每米僅每米10003000塔板數(shù)塔板數(shù)510m球型和無定球型和無定型微粒硅膠，每米型微粒硅膠，每米56萬理論塔板數(shù)萬理論塔板數(shù) 鍵合相色譜、離子色譜、疏水色譜、親和色譜、手性色鍵合相色譜、離子色譜、疏水色譜、親和色譜、手性色譜、脂質(zhì)體色譜

2、、生物膜色譜、整體柱色譜、微徑柱和譜、脂質(zhì)體色譜、生物膜色譜、整體柱色譜、微徑柱和毛細(xì)管柱色譜及液相色譜毛細(xì)管柱色譜及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等質(zhì)譜聯(lián)用等 http:/ 高效液相色譜法的特點(diǎn)高效液相色譜法的特點(diǎn)基本特點(diǎn)基本特點(diǎn) 1. 高效、高速、高靈敏度 2. 填料粒徑和流動(dòng)相性質(zhì)影響色譜柱效 3局限性 操作條件操作條件 1. 流動(dòng)相對(duì)分離選擇性的影響 2. 柱外效應(yīng) 3. 操作壓力 適用范圍廣適用范圍廣 提高柱效的途徑，也就是如何提高液相色提高柱效的途徑，也就是如何提高液相色譜的分離效率：譜的分離效率： 減減 小填料粒度；提高柱內(nèi)填料裝填的均小填料粒度；提高柱內(nèi)填料裝填的均勻性來以加快傳質(zhì)速率。勻

3、性來以加快傳質(zhì)速率。 對(duì)于液相色譜而言，除了上述的影響因素，還有柱外展寬的影響，所謂柱外展寬是指色譜柱外各種因素引起的峰擴(kuò)展。1. 吸附色譜(adsorption Chromatography)2. 分配色譜(partition Chromatography) 3. 離子對(duì)色譜法 （ion pair Chromatography）4. 離子交換色譜(ion-Exchange Chromatography)5. 離子色譜法 (ion Chromatography )6. 空間排阻色譜(size Exclusion Chromatography) 需要指出的是每種色譜方法通常存在一種起支配作用的主

4、要保留機(jī)理，但可能還存在次要的其他機(jī)理。 1、吸附色譜、吸附色譜（adsorption chromatography） 原理：原理：基于被測(cè)組分在固定相表面具有吸附作用，且各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產(chǎn)生保留和實(shí)現(xiàn)分離。 固定相：固定相： 固定相通常是活性硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑，所以吸附色譜也稱液固吸附色譜?；钚怨枘z最常用。流動(dòng)相：流動(dòng)相： 弱極性有機(jī)溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構(gòu)烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。 應(yīng)用：應(yīng)用： 吸附色譜用于結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離和族分離仍是最有效的方法，如農(nóng)藥異構(gòu)體分離、石油中烷、烯、芳烴的

5、分離。 缺點(diǎn)是容易產(chǎn)生不對(duì)稱峰和拖尾現(xiàn)象。研究最多、應(yīng)用最廣泛的高效液相色譜類型。研究最多、應(yīng)用最廣泛的高效液相色譜類型。 可分為液可分為液- -液色譜和化學(xué)鍵合相色譜。前者是早液色譜和化學(xué)鍵合相色譜。前者是早期主要分配色譜類型，以物理吸附涂漬固定液在多期主要分配色譜類型，以物理吸附涂漬固定液在多孔載體表面上為固定相；后者以鍵合相為固定相，孔載體表面上為固定相；后者以鍵合相為固定相，即化學(xué)鍵合固定相至載體或基質(zhì)表面。即化學(xué)鍵合固定相至載體或基質(zhì)表面。 化學(xué)鍵合相色譜巳成為占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的分配色譜化學(xué)鍵合相色譜巳成為占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的分配色譜類型。類型。 2、分配色譜、分配色譜原理：原理： 主要基于樣品分

6、子在流動(dòng)相和固定相間的溶解度不同（分配作用）而實(shí)現(xiàn)分離的液相色譜分離模式。 液-液分配色譜固定相的液體往往容易溶解到流動(dòng)相中去，所以重現(xiàn)性很差，不大為人們所采用。后來發(fā)展起來的鍵合固定相以化學(xué)鍵合的方法將功能分子結(jié)合到惰性載體上，固定相就不會(huì)溶解到流動(dòng)相中去了。 鍵合固定相非極性鍵合固定相：非極性鍵合固定相： 鍵合在載體表面的功能分子是烷基、苯基等非極性有機(jī)分子。如最常用的ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18柱就是最典型的代表，其極性很小。極性鍵合固定相：極性鍵合固定相： 鍵合在載體表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子。正相正相H

7、PLC（normal phase HPLC）：）： 是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動(dòng)相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動(dòng)相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。反相反相HPLC（reversed phase HPLC）：）： 由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱），代表性的流動(dòng)相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式。ODS（Octa Decyltrichloro Silane) 3. 離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜(Ion Pair Chromatography) 在色譜

8、體系中引入一種與樣品溶質(zhì)離子電荷相反的離子對(duì)試劑，通常稱為對(duì)離子或反離子(counterion)，它與溶質(zhì)離子形成離子對(duì)，從而改變?nèi)苜|(zhì)在兩相中的分配，使離子性溶質(zhì)的保留行為和分離選擇性發(fā)生顯著變化。 常用的離子對(duì)試劑有提供陰離子的C4 - C8烷基磺酸鹽、烷基硫酸鹽、羧酸鹽、萘磺酸鹽、高氯酸鹽等;提供陽離子的季銨鹽和烴基胺，如四丁基銨鹽、十六烷基三甲基銨鹽、三乙胺等。 將離子對(duì)試劑涂漬在液液色譜的硅膠載體上或溶于流動(dòng)相中，可構(gòu)成液液離子對(duì)分配色譜，主要用于強(qiáng)極性的有機(jī)酸、主要用于強(qiáng)極性的有機(jī)酸、有機(jī)堿的分離分析。有機(jī)堿的分離分析。 在反相色譜中，離子對(duì)試劑加入緩沖液和甲醇、乙腈等極性有機(jī)溶劑的

9、流動(dòng)相構(gòu)成反相離子對(duì)色譜。 4、離子交換色譜、離子交換色譜（ion exchange chromatography, IEC）原理：原理： 用離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。 以陰離子交換樹脂(R-OH)作固定相，分離陰離子(如Br-)為例。當(dāng)待測(cè)陰離子Br-隨流動(dòng)相(NaOH)進(jìn)入色譜柱時(shí)，發(fā)生如下交換反應(yīng)(洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng)的，的逆過程)： IEC使用表面有離子交換基團(tuán)的離子交換劑作為固定相。帶負(fù)電荷的交換基團(tuán)（如磺酸基和羧酸基）可以用于陽離子的分離，帶正電荷的交換基團(tuán)（如季胺鹽）可以用于陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而被相互分離。

10、 此法是利用此法是利用離子交換原理和液相色離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測(cè)定溶液中陽離子和譜技術(shù)的結(jié)合來測(cè)定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法陰離子的一種分離分析方法。凡在溶。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。較廣。 離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。離子交換色譜法在無機(jī)離子

11、的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對(duì)于那些不能采用紫外檢測(cè)器的被測(cè)離子，如采用電導(dǎo)檢測(cè)器，由于被測(cè)離子的電導(dǎo)信號(hào)被強(qiáng)電解質(zhì)流動(dòng)相的高背景電導(dǎo)信號(hào)掩沒而無法檢測(cè)。 為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測(cè)定多種無機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)。他們?cè)陔x子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相，從而用電導(dǎo)檢測(cè)器可直接檢測(cè)各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱為離子色譜。若樣品為陽離子，用無機(jī)酸作流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽離子交換劑的分離往后，隨流動(dòng)相進(jìn)入抑制柱，在抑

12、制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反應(yīng)： 5.離子色譜離子色譜(Ion Chromatography，IC) 由反應(yīng)可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動(dòng)相本底電導(dǎo)的影響。同時(shí)，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的26倍，提高了所測(cè)陽離子電導(dǎo)的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于陰離子樣品也有相似的作用機(jī)理。 在分離柱后加一個(gè)抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會(huì)加寬，降低了分離度。后來，F(xiàn)rits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如110-4510-4moldm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲

13、酸鹽的稀溶液作流動(dòng)相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。（1）分析速度快 可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析；（2）分離能力高 在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）儀器流路采用全塑件，玻璃柱，耐腐蝕6、空間排阻色譜、空間排阻色譜（又稱凝膠色譜和分子篩色譜） 以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑（x nmx00 nm）的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠。 機(jī)理：機(jī)理：當(dāng)試樣進(jìn)入凝膠色譜柱時(shí)，尺寸過大的分子完全不能滲透到膠孔

14、中去而受到排阻，沿膠粒之間的間隙直接流出色譜柱，產(chǎn)生一個(gè)色譜峰；尺寸過小的分子可完全滲透到膠孔中去，流動(dòng)速度慢，最后流出色譜柱，產(chǎn)生一個(gè)色譜峰；中等尺寸的分子 ，以其大小的不同，可滲透到某些孔穴而不能進(jìn)入另一些空穴，流出速度取決于分子尺寸的大小, 按分子尺寸由大到小的順序先后流出色譜柱，從而實(shí)現(xiàn)分離。 應(yīng)用：應(yīng)用：適合分離分子量大的化合物（100800,000)，只要相對(duì)分子量相差大于10%。一、液一、液液色譜法及離子對(duì)色譜法固定相液色譜法及離子對(duì)色譜法固定相1 1擔(dān)體擔(dān)體(1) (1) 全多孔型擔(dān)體：全多孔型擔(dān)體：a. HPLCa. HPLC早期使用的擔(dān)體與早期使用的擔(dān)體與GCGC類似，是顆

15、粒均勻的多孔球體，類似，是顆粒均勻的多孔球體，如有氧化鋁、氧化硅、硅藻土等制成的如有氧化鋁、氧化硅、硅藻土等制成的 100m100m全多孔全多孔型擔(dān)體。型擔(dān)體。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：填料的不規(guī)則性和較寬的粒度范圍會(huì)導(dǎo)致填料的不規(guī)則性和較寬的粒度范圍會(huì)導(dǎo)致填充不易均勻，柱效低；填料孔徑分布不一，并存在填充不易均勻，柱效低；填料孔徑分布不一，并存在“裂裂隙隙”在填料深孔中形成滯留液體（液坑），溶質(zhì)分子在深在填料深孔中形成滯留液體（液坑），溶質(zhì)分子在深孔中擴(kuò)散和傳質(zhì)慢，使色譜峰變寬，柱效下降。孔中擴(kuò)散和傳質(zhì)慢，使色譜峰變寬，柱效下降。b. 現(xiàn)在采用現(xiàn)在采用10 m全多孔全多孔 型擔(dān)體，它是由型擔(dān)體，它是由nm

16、級(jí)的硅膠微級(jí)的硅膠微粒堆積而成粒堆積而成為為5 m或稍大的全或稍大的全多孔小球。多孔小球。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：顆粒小而均勻，顆粒小而均勻，傳質(zhì)快（距離短），柱效高。傳質(zhì)快（距離短），柱效高。(2) (2) 表層多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）：表層多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）： 它是直徑為它是直徑為 30 30 40 m 40 m 的實(shí)心核的實(shí)心核 ( ( 玻璃微玻璃微珠珠 ) ) ，表層上附有一層厚度約為，表層上附有一層厚度約為 1 1 2m 2m 多孔表面多孔表面 ( ( 多孔硅膠多孔硅膠 ) ) 。2固定液 液液色譜流動(dòng)相和固定相都是液體，因此要求兩相要互不相容。在液-液色譜中常用的固定相也只有極性

17、不同的幾種，如，-氧二丙腈、聚已二醇-400和角鯊?fù)榈取?yōu)點(diǎn)：孔穴淺（固定相僅為表面的一薄層），傳質(zhì)速度快,易于填充均勻,柱效高。缺點(diǎn)：柱子容量低、需要配用高靈敏檢測(cè)器。 這種擔(dān)體目前應(yīng)用較為普遍。3 3化學(xué)鍵合固定相：化學(xué)鍵合固定相： 即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)合到擔(dān)體表面。根據(jù)在硅膠表面合到擔(dān)體表面。根據(jù)在硅膠表面 ( (具有具有SiSiOHOH基團(tuán)基團(tuán)) ) 的的化學(xué)反應(yīng)不同，鍵合固定相可分為：化學(xué)反應(yīng)不同，鍵合固定相可分為：u硅氧碳鍵型硅氧碳鍵型( Si( SiO OC ):C ):u硅氧硅碳鍵型硅氧硅碳鍵型(Si(SiO OSiS

18、iC):C):穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣。u硅碳鍵型硅碳鍵型(Si(SiC):C):u和硅氮鍵型（和硅氮鍵型（SiSiN): N): 化學(xué)鍵合固定相具有如下一些特點(diǎn)： . 表面沒有坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多； . 無固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命； . 可以鍵合不同官能團(tuán)，能靈活地改變選擇性，應(yīng)用于多種色譜類型及樣品的分析； . 有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測(cè)器和餾分的收集。二、液固吸附色譜法固定相二、液固吸附色譜法固定相 采用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等，采用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等，仍可分為全

19、多孔性和薄殼型兩種，其特點(diǎn)如前所述。仍可分為全多孔性和薄殼型兩種，其特點(diǎn)如前所述。三、離子交換色譜法固定相三、離子交換色譜法固定相薄膜型離子交換樹脂薄膜型離子交換樹脂: : 即以薄殼玻璃珠為擔(dān)體，在它的即以薄殼玻璃珠為擔(dān)體，在它的表面涂約表面涂約 1% 1% 的離子交換樹脂而成。的離子交換樹脂而成。2. 2. 離子交換鍵合固定相離子交換鍵合固定相: : 用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合在惰性擔(dān)體表面。在惰性擔(dān)體表面。四、排阻色譜法固定相四、排阻色譜法固定相1. 1. 軟質(zhì)凝膠：軟質(zhì)凝膠：如交聯(lián)葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，適用如交聯(lián)葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，適用于水為流動(dòng)相

20、，在常壓下使用。于水為流動(dòng)相，在常壓下使用。2. 2. 半硬質(zhì)凝膠：半硬質(zhì)凝膠：如苯乙烯二乙烯基苯交聯(lián)共聚凝膠如苯乙烯二乙烯基苯交聯(lián)共聚凝膠（交聯(lián)聚苯乙烯凝膠），是應(yīng)用最多的有機(jī)凝膠，適（交聯(lián)聚苯乙烯凝膠），是應(yīng)用最多的有機(jī)凝膠，適用于非極性有機(jī)溶劑。用于非極性有機(jī)溶劑。3. 3. 硬質(zhì)凝膠：硬質(zhì)凝膠：如多孔硅膠、多孔玻璃珠等，多孔硅膠是如多孔硅膠、多孔玻璃珠等，多孔硅膠是用得較多的無機(jī)凝膠。用得較多的無機(jī)凝膠。 化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它

21、對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：1.1.化學(xué)惰性，化學(xué)惰性，不與固定相和被分離組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，保證柱的穩(wěn)定性和分離的重現(xiàn)性。2.2.適用的物理性質(zhì)，適用的物理性質(zhì)，包括沸點(diǎn)較低，以便于分離組分和溶劑回收;低粘度，利于提高傳質(zhì)速率和分離速度、降低柱前壓;弱或無紫外吸收等，以降低UV檢測(cè)器本低響應(yīng)，提高檢測(cè)靈敏度;對(duì)樣品具有適當(dāng)溶解能力等。3.3.溶劑清洗和更換方便，溶劑清洗和更換方便，毒性小、純度高、價(jià)廉等，便于操作和安全。 選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意下列幾個(gè)因素：選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意下列幾個(gè)因素：流動(dòng)相純度：流動(dòng)相純度：防止微量

22、雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。器噪聲增加。 (2) (2) 避免流動(dòng)相與固定相避免流動(dòng)相與固定相和被分離組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)和被分離組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而使，而使柱效下降或損壞柱子：柱效下降或損壞柱子：如在液如在液- -液色譜中，流動(dòng)相應(yīng)與固液色譜中，流動(dòng)相應(yīng)與固定液互不相容，否則，會(huì)使固定液溶解流失；酸性溶劑破定液互不相容，否則，會(huì)使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。壞氧化鋁固定相等。保證柱的穩(wěn)定性和分離的重現(xiàn)性。保證柱的穩(wěn)定性和分離的重現(xiàn)性。(3) (3) 對(duì)試樣要有適宜的溶解度：對(duì)試樣要有適宜的溶解度：試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的試樣在流

23、動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。(4) (4) 溶劑的粘度小些為好：溶劑的粘度小些為好：否則，會(huì)降低試樣組分的擴(kuò)散系否則，會(huì)降低試樣組分的擴(kuò)散系數(shù)，造成傳質(zhì)速率緩慢，柱效下降。數(shù)，造成傳質(zhì)速率緩慢，柱效下降。(5) (5) 應(yīng)與檢測(cè)器相匹配：應(yīng)與檢測(cè)器相匹配：例如，當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)例如，當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。相不應(yīng)有紫外吸收。 （6 6）溶劑清洗和更換方便，溶劑清洗和更換方便，毒性小、純度高、價(jià)廉等，毒性小、純度高、價(jià)廉等，便于操作和安全。便于操作和安全。 在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。在選擇溶劑時(shí)，溶

24、劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 例如，采用正相液例如，采用正相液- -液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。時(shí)間縮短。 常用溶劑的極性順序：常用溶劑的極性順序： 水水( (最大最大) ) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六環(huán)二氧六環(huán) 四氫呋喃四氫呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 異丙醚異丙醚 二氯甲烷二

25、氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化二硫化碳碳 環(huán)己烷環(huán)己烷 己烷己烷 煤油煤油( (最小最小) ) 有時(shí)還需要選用二元或多元溶劑，以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相有時(shí)還需要選用二元或多元溶劑，以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。選擇選擇時(shí)要參閱有關(guān)手冊(cè)，并通過實(shí)驗(yàn)確定。時(shí)要參閱有關(guān)手冊(cè)，并通過實(shí)驗(yàn)確定。 1.高壓輸液泵 HPLC使用的高壓泵應(yīng)滿足下列條件：a. 流量恒定，無脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍（一般為110 mL/min）；b. 能抗溶劑腐蝕；c. 有較高的輸液壓力；對(duì)一般分離，60105Pa的壓力就滿足了

26、，對(duì)高效分離，要求達(dá)到150300105Pa。(1) 往復(fù)式柱塞泵 2. 梯度淋洗裝置 梯度洗提，就是載液中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。 梯度洗提可以分為兩種： a. 低壓梯度（也叫外梯度）：在常壓下，預(yù)先按一定程序?qū)煞N或多種不同極性的溶劑混合后，再用一臺(tái)高壓泵輸入色譜柱。 b.高壓梯度 ( 或稱內(nèi)梯度系統(tǒng) ) ：利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按按設(shè)定的比例送入梯度混合室，混合后，進(jìn)入色譜柱。3. 進(jìn)樣裝置(1).注射器進(jìn)樣裝置：進(jìn)樣所用微量注射器及進(jìn)樣方式

27、與 GC法一樣。進(jìn)樣壓力150105Pa時(shí)，必須采用停流進(jìn)樣。(2).高壓定量進(jìn)樣閥： 與GC法用的流通法相似，能在高壓下進(jìn)樣。其結(jié)構(gòu)如圖所示：4. 高效分離柱色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為 4.6 或 3.9mm ，長(zhǎng)度為 15 30cm 的直形不銹鋼柱。填料顆粒度 5 10m ，柱效以理論塔板數(shù)計(jì)大約

28、7000 10000 。 在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。 發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度及柱徑和柱長(zhǎng)，以提高分析速度和柱效；研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。 在液相色譜中，有兩種基本類型在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測(cè)器。一類是的檢測(cè)器。一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。另一類是另一類是總體檢測(cè)器總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的物理

29、或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等。現(xiàn)將常用的的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等。現(xiàn)將常用的檢測(cè)器介紹如下檢測(cè)器介紹如下: :5. 液相色譜檢測(cè)器液相色譜檢測(cè)器l. l. 光吸收檢測(cè)器：光吸收檢測(cè)器：紫外吸收檢測(cè)器紫外吸收檢測(cè)器，光二極，光二極管陣列檢測(cè)器，紅外吸收檢測(cè)器管陣列檢測(cè)器，紅外吸收檢測(cè)器2. 2. 熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器 3. 3. 示差折光率檢測(cè)器示差折光率檢測(cè)器4. 4. 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器5. 5. 電化學(xué)檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器 液相色譜檢測(cè)器液相色譜檢測(cè)器（1 1） 紫外吸收紫外吸收(UV) (UV) 檢測(cè)器檢測(cè)器 應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)

30、。應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。 特點(diǎn)：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很小特點(diǎn)：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm 1mm 10mm 10mm ，容積，容積 8L 8L）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。 光吸收檢測(cè)器光吸收檢測(cè)器 紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測(cè)器：光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。圖所示。

31、 光吸收檢測(cè)器光吸收檢測(cè)器 （3 3） 紅外吸收檢測(cè)器紅外吸收檢測(cè)器 與一般光吸收檢測(cè)器光路設(shè)計(jì)相似，其吸收池窗與一般光吸收檢測(cè)器光路設(shè)計(jì)相似，其吸收池窗口采用氯化鈉、氟化鈣等紅外透明材料，透過吸收池口采用氯化鈉、氟化鈣等紅外透明材料，透過吸收池的紅外光一般以熱電敏感元件接收。這種檢測(cè)器可提的紅外光一般以熱電敏感元件接收。這種檢測(cè)器可提供分子結(jié)構(gòu)信息，但由于大多數(shù)液相色譜流動(dòng)相溶劑供分子結(jié)構(gòu)信息，但由于大多數(shù)液相色譜流動(dòng)相溶劑都有紅外吸收及窗口材料限制，其應(yīng)用有限。都有紅外吸收及窗口材料限制，其應(yīng)用有限。 光吸收檢測(cè)器光吸收檢測(cè)器 對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng). 2. 熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器(Fluorescence Detector，F(xiàn)D) 除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器； 可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比； 通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫； 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種； 3. 示差折光檢測(cè)器（示差折光檢測(cè)器（Differential Refrative Index Detector, RI） . 示差折光檢測(cè)器（示差折光檢測(cè)器（Differe