蛋白質(zhì)分離純化的一般程序解析

1、蛋白質(zhì)分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：（一）材料的預處理及細胞破碎分離提純某一種蛋白質(zhì)時，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性。所以要采用適當?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有:1. 機械破碎法這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設(shè)備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。2. 滲透破碎法這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。3. 反復凍融法生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。4. 超聲波法使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。5. 酶法如用

2、溶菌酶破壞微生物細胞等。（二）蛋白質(zhì)的抽提通常選擇適當?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結(jié)構(gòu)破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過程中，應(yīng)注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。（三）蛋白質(zhì)粗制品的獲得選用適當?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：1. 等電點沉淀法不同蛋白質(zhì)的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互分離。2. 鹽析法不同蛋

3、白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性。3. 有機溶劑沉淀法中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質(zhì)。此外，有機溶劑會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質(zhì)變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。（四）樣品的進一步分離純化用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層

4、析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品純化方案是由幾種純化方法組成的，一般選擇的依據(jù)是從抽提液中有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)考慮的。如沉淀法是從溶解度的差異考慮的；離子交換層析、凝膠過濾、親和層析分別從電荷、分子量、對配體親和力的差異性考慮的。為純化某一有效成分，可選出由兩種或更多種方法組成的方案。一般先選粗放、快速、有利縮小樣品體積和后工序處理的方法；精確、費時、需樣品量少的方法后選。在每一純化方案中，切忌一種方法重復使用。你好!我也是位畢業(yè)的學生希望能給你提供參考以下是離子交換層析常見問題分析,希望能解決你的問題1. 純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)率低

5、可能原因及解決方法：樹脂上的蛋白質(zhì)未洗凈，可采用增強溶液離子強度，更換活性高的反荷離子或使用去垢劑等辦法解決；PH值不合適，若緩沖體系的PH值與目的蛋白的PI相差太遠，目的蛋白與樹脂的結(jié)合會過于牢固；蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，可能是因為緩沖體系PH值過于接近蛋白質(zhì)PI值，溶液離子強度過低或溶液過渡稀釋；蛋白質(zhì)在初步過濾的時候有損失；蛋白質(zhì)或者輔助因子在層析時有損失；蛋白質(zhì)水解酶破壞了目的蛋白；樹脂中有純化時蛋白質(zhì)失活可能原因及解決辦法：某個輔助因子或一部分蛋白質(zhì)有損失，混合部分收集液，測定活性；蛋白質(zhì)在現(xiàn)有層析液中不穩(wěn)定；樹脂中有微生物。微生物。3. 蛋白質(zhì)不與樹脂結(jié)合可能原因及解決方法：初上樣緩沖液離

6、子強度過大，降低初始上樣緩沖液離子強度；樹脂PH值因解析作用而發(fā)生變化，注意蛋白質(zhì)等電點的計算值往往與實驗值差別很大;樹脂未進行適當平衡；再生的樹脂未洗凈。4. 純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)率低可能原因及解決方法：樹脂上的蛋白質(zhì)未洗凈，可采用增強溶液離子強度，更換活性高的反荷離子或使用去垢劑等辦法解決；PH值不合適，若緩沖體系的PH值與目的蛋白的PI相差太遠，目的蛋白與樹脂的結(jié)合會過于牢固；蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，可能是因為緩沖體系PH值過于接近蛋白質(zhì)PI值，溶液離子強度過低或溶液過渡稀釋；蛋白質(zhì)在初步過濾的時候有損失；蛋白質(zhì)或者輔助因子在層析時有損失；蛋白質(zhì)水解酶破壞了目的蛋白；樹脂中有微生物。5. 蛋白質(zhì)分辨效

7、果差可能原因及解決辦法：層析時流速太快；層析柱過短；上柱蛋白過多；梯度洗脫時洗脫液濃度變化太快；蛋白質(zhì)可在脫離層析柱后再次混合，盡量減少樹脂支持物與部分收集期間的管道體積；不均勻的裝柱以至產(chǎn)生碎屑，上樣合洗脫時的錯誤操作；樹脂未進行適當平衡；樹脂中有微生物。蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學研究應(yīng)用中使用廣泛，是一項重要的操作技術(shù)。一個典型的真核細胞可以包含數(shù)以千計的不同蛋白質(zhì)，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個拷貝。為了研究某一個蛋白質(zhì)，必須首先將該蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來。用于分離蛋白質(zhì)的最重要特性有大小、電荷、疏水性和對其他分子的親和性。通常采用多種方法的組合來實現(xiàn)蛋白

8、質(zhì)的完全純化。其蛋白質(zhì)分離純化主要方法包括：（1）根據(jù)分子大小不同的分離方法：透析和超過濾（利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜）；密度梯度離心（蛋白質(zhì)在介質(zhì)中離心時質(zhì)量和密度較大的顆粒沉降較快）；凝膠過濾（一種柱層析）（2）利用溶解度差別分離：等電點沉淀法）由于蛋白質(zhì)分子在等電點時凈電荷為零，減少了分子間靜電斥力，因而容易聚集沉淀，此時溶解度最?。畸}溶與鹽析（利用一定濃度鹽溶液增大或減小蛋白質(zhì)的溶解度）（3）根據(jù)電荷不同的分離方法，主要包括電泳和離子交換層析分離；（4）蛋白質(zhì)的選擇吸附分離（利用顆粒吸附力的強弱不同達到分離目的）（5）根據(jù)配體特性的分離親和層析（利用蛋白質(zhì)分子與另一種稱為配體的分子

9、能夠特異而非共價地結(jié)合這一生物性質(zhì)）這是一門很深的學問，除了需要高科技還需要科研專用設(shè)備，只是簡介，希望對你有幫助,不要上當受騙：酶的分離純化方法簡介生物細胞產(chǎn)生的酶有兩類:一類由細胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到細胞外進行作用的酶，稱為細胞外酶。這類酶大都是水解酶，如酶法生產(chǎn)葡萄糖所用的兩種淀粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發(fā)酵過程中分泌的。這類酶一般含量較高，容易得到；另一類酶在細胞內(nèi)產(chǎn)生后并不分泌到細胞外，而在細胞內(nèi)起催化作用，稱為細胞內(nèi)酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發(fā)酵生產(chǎn)所進行的一系列化學反應(yīng)，就是在多種酶催化下在細胞內(nèi)進行的，在類酶在細胞內(nèi)往往與細胞結(jié)構(gòu)結(jié)合，有一定的分布區(qū)域，催化的反應(yīng)具有一定的順序性，

10、使許多反應(yīng)能有條不紊地進行。酶的來源多為生物細胞。生物細胞內(nèi)產(chǎn)生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別很大。因此，在提取某一種酶時，首先應(yīng)當根據(jù)需要，選擇含此酶最豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于從動物內(nèi)臟或植物果實中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來獲得大量的酶制劑。從微生物中來生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點有很多，既不受氣候地理條件限制，而且動植物體內(nèi)酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產(chǎn)酶量又豐富，還可以通過選育菌種來提高產(chǎn)量，用廉價原料

11、可以大量生產(chǎn)。由于在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)，因此為制取某酶制劑時，必須經(jīng)過分純化的手續(xù)。酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)很容易變性，所以在酶的提純過程中應(yīng)避免用強酸強堿，保持在較低的溫度下操作。在提純的過程中通過測定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在分離提純過程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標，在整個酶的分離純化過程中的每一步驟，始終要測定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經(jīng)過某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取舍。酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶或制劑。首先將所

12、需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質(zhì)，然后制成純化的酶制劑。下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹：一、預處理及固液分離技術(shù)1. 細胞破碎（celldisruption）高壓均質(zhì)器法：此法可用于破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑曲霉菌。將細胞懸浮液在高壓下通入一個孔徑可調(diào)的排放孔中，菌體從高壓環(huán)境轉(zhuǎn)到低壓環(huán)境，細胞就容易破碎。菌懸液一次通過均質(zhì)器的細胞破碎率在12%-67%。細胞破碎率與細胞的種類有關(guān)。要達到90%以上的細胞破碎率，起碼要將菌懸液通過均質(zhì)器兩次。最好是提高操作壓力，減少操作次數(shù)。但有人

13、報道，當操作壓力達到175Mpa時，破碎率可達100%。當壓力超過70Mpa時，細胞破碎率上升較為緩慢。高壓均質(zhì)器的閥門是影響細胞破碎率的重要因素。絲狀菌會堵塞均質(zhì)器的閥門，尤其高濃度菌體時更是如此。在豐富培養(yǎng)基上比在合成培養(yǎng)基上生長的大腸菌更難破碎。容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價格便宜，常用來裂解細胞。具體做法是：溶壁微球菌（micrococcuslysodeikticus）43kg,置于0.5%的氯化鈉溶液中，使細胞濃度為5%（干重），在35°C用0.68kg（干重）的蛋清處理20min,得到的細胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機將細胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)除去，再將乙醇濃

14、度提高到75%（體積分數(shù)），可以得到純度為5%的過氧化氫酶1500g。2.離心離心分離過程可分為離心過濾、離心沉淀、離心分離3種類型，所使用的設(shè)備有過濾式離心機、沉降式離心機和離心機。過濾式離心機的轉(zhuǎn)鼓壁上開有小孔，壁上有過濾介質(zhì)，一般可用于處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場合。沉降式離心機用于分離固體濃度較低的固液分離，如發(fā)酵液中的菌體，用鹽析法或有機溶劑處理過的蛋白質(zhì)等。分離機用于分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。在生物領(lǐng)域采用的離心機系統(tǒng)，除了應(yīng)具備離心機的一般要求外，還應(yīng)滿足生物生產(chǎn)的技術(shù)要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產(chǎn)品不受污染并不污染環(huán)境

15、?，F(xiàn)代哦離心機裝置包括以下三個步驟，并進行程序控制：離心、離心系統(tǒng)的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機產(chǎn)品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉(zhuǎn)筒主軸上下的碳化硅動環(huán)和固定環(huán)組成,密封由水連續(xù)冷卻和潤滑，可防止產(chǎn)品被污染，也可防止生產(chǎn)過程中排出的廢物對環(huán)境的污染。該離心機又如一個密閉的壓力容器，可在121r溫度下進行蒸汽滅菌，該離心設(shè)備設(shè)有環(huán)繞離心機轉(zhuǎn)筒的冷卻夾套，對懸浮液和濃縮的固體都能進行充分的冷卻，并能有效地控制溫度，這對于生物制品是非常重要的。如BTPX205型離心機可用于細胞收集、培養(yǎng)液的凈化和細胞碎片的分離，可用于疫苗、酶制劑等的提取。該機的其他輔助系統(tǒng)及控制系統(tǒng)也較為完善，如

16、設(shè)有壓力指示器、力量計、溫度傳感器和液面?zhèn)鞲衅鳌?膜分離技術(shù)在蛋白質(zhì)純化過程中主要用到的膜分離技術(shù)多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過孔徑非常小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質(zhì)透過薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多數(shù)超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結(jié)合在一起而組成的。功能膜決定了膜的孔徑，而支撐膜提供機械強度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優(yōu)點是：操作條件溫和，無相變化，對生物活性物質(zhì)沒有破壞。超濾系統(tǒng)主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過液收集罐組成，料液經(jīng)泵打入超濾器，水及低分子量物質(zhì)排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環(huán)。當料液濃縮至一定的倍數(shù)后即可作為進一步處理的濃縮料液。超

17、濾應(yīng)用于蛋白質(zhì)類物質(zhì)的濃縮和脫鹽過程中時應(yīng)注意以下問題:第一,在超濾循環(huán)過程中，由于泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的溫度會逐漸升高，會造成蛋白質(zhì)分子的損失。因此，料液貯罐應(yīng)加冷卻系統(tǒng)，并安裝自動測溫及控制系統(tǒng)。第二，某些酶的輔助因子散失為問題：一些酶含有輔助因子，其分子量小，超濾時易從透過液中排除掉，因而在超濾前或超濾后要添加一定濃度的的輔助因子。還可將超濾與親和層析相結(jié)合以提高分離純度。其工作原理是：當溶液中欲被分離的蛋白質(zhì)不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時，如果在膜的一側(cè)結(jié)合著親和配基，該蛋白質(zhì)就會與配基結(jié)合因而結(jié)聚在膜的這一側(cè)。不與配基結(jié)合的其他物質(zhì)就將穿過孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該

18、蛋白質(zhì)洗脫下來，洗脫液用于進一步的分離純化。4泡沫分離原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由于這些組分的表面活性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩(wěn)定性取決于操作條件及溶液的生物學特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分離。蛋白質(zhì)較易吸附與氣液界面，這有利于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。泡沫分離過程是：蛋白質(zhì)從主體溶液中擴散到氣液界面，該過程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發(fā)生重排，一般認為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會發(fā)生由多個分子聚集在一起的現(xiàn)象。在氣液界面形成的蛋白質(zhì)膜可以是單層的也可

19、以是多層的。膜的類型取決于主體溶液及氣液界面上蛋白質(zhì)的特性、結(jié)構(gòu)和濃度。泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質(zhì)的濃度/最初溶液中蛋白質(zhì)濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質(zhì)的提取率/最初的蛋白質(zhì)質(zhì)量），或使多組分混合物中某一組分的分配系數(shù)最大。二、抽提沉淀1. 鹽析常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價格便宜。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的能力很強，其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質(zhì)沉淀下來。對酶沒有破壞作用。pH的控制：應(yīng)從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個方面考慮，在酶等電點時其溶解度最小易沉淀，但有些酶再等電點時穩(wěn)定性較差，因此要選擇最佳pH值一般要求在酶最穩(wěn)定的pH值的前提下再考慮最適宜酶沉

20、淀的pH值。在操作中一旦確定最佳pH值后，在添加硫酸銨之前甲酸或堿調(diào)節(jié)好酶液的pH值，要盡量避免溶液pH值的波動以免破壞酶的穩(wěn)定性。在添加硫酸銨時要注意攪拌，并注意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細粉。溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好，可在常溫下進行鹽析操作，而對于大多數(shù)酶，盡可能在低溫下操作。酶液的凈置：加完硫酸銨后，酶液要靜置一段時間，使酶蛋白完全沉淀下來，酶靜置后，就不要再加以攪拌。2. 有機溶劑沉淀有機溶劑選擇：可用于酶蛋白沉淀的有機溶劑包括醇類物質(zhì)等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質(zhì)的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。有機溶

21、劑沉淀操作：有機溶劑一般都使蛋白質(zhì)變性，當溫度較高時變性蛋白質(zhì)分子就會變成永久失活。因此用有機溶劑處理時最好在0°C以下進行。用有機溶劑沉淀得到的酶蛋白不要放置過久，要盡快加水溶解。3聚合物絮凝劑沉淀聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭奪水分子，具有脫水作用使酶沉淀。聚乙二醇作為一種沉淀劑的優(yōu)點是在水溶液中，其濃度可達到50%,濃度為6%-12%的蛋白質(zhì)大都可以沉淀下來。這種試劑不需要低溫操作，而且對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定還有一定的保護作用。聚乙二醇不會被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。4. 用金屬離子和絡(luò)合物沉淀酶和其他蛋白質(zhì)都會形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉淀的缺點是酶與

22、金屬離子相互作用后，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結(jié)合的金屬離子會催化酶變性而失活。5用特殊試劑沉淀法用鏈霉素可選擇性去除核酸，從而使胞內(nèi)酶沉淀出來。鏈霉素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質(zhì)）對于選擇性沉淀核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活。6. 親和沉淀將親和反應(yīng)的高度選擇性、低處理量特性與沉淀操作的大處理量、地選擇性有機結(jié)合形成了親和沉淀技術(shù)。將配基與可溶性載體偶聯(lián)后形成載體-配基復合物，該復合物與生物分子結(jié)合后在一定條件下可以沉淀出來。配基-載體復合物可以選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，溶液中的pH值、離子強度及蛋白質(zhì)濃度等條件對親和結(jié)合的影響力并不大，只有競爭性的配基會降低產(chǎn)物與原

23、配基的親和結(jié)合力，甚至使親和結(jié)合發(fā)生逆轉(zhuǎn)。引導產(chǎn)生沉淀的方法有：離子交聯(lián)；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷的疏水基團;改變pH值，誘導產(chǎn)生疏水沉淀；溫度誘導產(chǎn)生沉淀。親和結(jié)合：將親和配基加入到含有目的物蛋白質(zhì)的溶液中，調(diào)節(jié)好有關(guān)沉淀的條件，使之有利于親和結(jié)合。洗滌：為經(jīng)過處理的粗制液中發(fā)生親和沉淀可能會發(fā)生非特異性結(jié)合，尤其是使用帶電的聚合物，離子交換的效應(yīng)將使其他蛋白質(zhì)共同沉淀，因此在分離目的物之前要洗滌沉淀物。其做法是：加入適當?shù)那逑磩┲匦氯芙獬恋恚俪恋?；或在專一性洗脫之前，徹底清洗沉淀。在上述過程中要始終保持目的蛋白質(zhì)與配基處于親和結(jié)合狀態(tài)。配基-載體復合物與目的蛋白質(zhì)的分離：分

24、離結(jié)束之后，要確?；厥漳康牡鞍踪|(zhì)和配基-載體復合物，目的蛋白質(zhì)要達到一定的純度，回收率要高。酶是蛋白質(zhì)，可以根據(jù)其特點選擇適當?shù)牡鞍踪|(zhì)提取純化方法！選擇材料及預處理以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認識生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達到分離目的，如電泳，超速

25、離心，超濾等。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、堿、高溫，劇烈機械作用而導致所提物質(zhì)生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個階段：選擇材料和預處理，細胞的破碎及細胞器的分離，提取和純化，濃細、干燥和保存。微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實驗目的來確定。對于微生物，應(yīng)注意它的生長期，在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時有兩種情況：（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼，脫脂并注意植物品種和生長發(fā)育狀況

26、不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等處理。另外，對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應(yīng)冷凍保存，對于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。蛋白質(zhì)的分離純化一，蛋白質(zhì)（包括酶）的提取大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。（一）水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的

27、溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。1、pH值蛋白質(zhì)，酶是具有等電點的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點兩側(cè)的pH范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時，應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團發(fā)生變化，從而導致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿

28、性的提取液。2、鹽濃度稀濃度可促進蛋白質(zhì)的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中加入少量NaCI等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。（二）有機溶劑提取法一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼

29、具親水性，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%，40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。二、蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的S04和NH4）有很強的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白

30、質(zhì)等電點則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。蛋白質(zhì)

31、鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外

32、也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。2、等電點沉淀法蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達到某一蛋白質(zhì)的等電點使之沉淀，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結(jié)合用。3、低溫有機溶劑沉淀法用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進行。（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇

33、不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。2、凝膠過濾法也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadexged）和瓊脂糖凝膠（agarosegel）。（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。1、電泳法各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用

34、于分析和制備各種蛋白質(zhì)。2、離子交換層析法離子交換劑有陽離子交換劑(如：羧甲基纖維素；CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONTFACE="宋體"LANG="ZH-CN"纖維素)，當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。(詳見層析技術(shù)章)(四) 根據(jù)配體特異性的分離方法一親和色譜法親和層析法(aflinitychromatography)是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復

35、雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價地結(jié)合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離(Separation),提純(Purification)和鑒定(Characterization)是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。細胞的破碎1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加

36、速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶,常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，

37、使細胞結(jié)構(gòu)破碎。5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。濃縮、干燥及保存一、樣品的濃縮生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀，

38、為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。2、空氣流動蒸發(fā)濃縮空氣的流動可使液體加速蒸發(fā)，鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室，用電扇對準吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發(fā)，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。3、冰凍法生物大分子在低溫結(jié)成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內(nèi)而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的