酶的催化機制

1、酶分子在一級結構的基礎上盤繞折疊成特定的空間結構（即三維結構）才具特定的催化功能。其中包括二級結構（主鏈碳原子局部空間排列，即a螺旋、B折疊和B轉角），三級結構（在三維空間中折疊成緊密的近球狀結構）和四級結構（寡聚酶的亞基之間的相互結合）。酶的高效率、高度專一性和酶活可調節(jié)等催化特性，都與酶蛋白本身的結構直接相關，酶蛋白的一級結構決定酶的空間構象，而酶的特定空間構象是其生物功能的結構基礎。人們只有更深入地認識酶、才能更好地控制酶和應用酶，即在不斷研究酶的結構和功能的具體關系和催化機理的基礎上，才能研制新的酶類，開發(fā)出更廣泛的用途。第一節(jié)酶的活性部位（活性中Yr）酶的活性部位是指酶分子中結合底物

2、并催化底物轉化成產物的區(qū)域?；钚圆课话ǖ孜锏慕Y合部位和催化部忍。參與底物結合的氨基酸殘基稱為結合基團，直接參與催化過程的基團稱為催化基團，這些氨基酸殘基在一級結構可能相距很遠，但在空間結構中卻相距很近，處于酶分子的表面并組成一個裂隙和流水口袋。一、活性部位在整個酶分子中只占很小一部分位的裂隙只占酶分子中很小的一部分。酶與其他蛋白質一樣,是一個結構極其復雜的大分子，而參與底物結合和催化的基團,則只是少數(shù)幾個氨基酸殘基。作為活性部二、活性部位是具有三維結構的裂隙一級結構上的不同部位,有的殘基相距上卻相距很近,例如溶菌酶分子中有129個氨基酸殘基,活性部位的重要基團則是由G1U35,Asp52,T

3、rp62,Trp63和AsplOl殘基提供的。三、底物與酶活性部位是通過次級鍵結合的酶與底物的復合物ES的平衡常數(shù)在10-2KHmol/L的范圍內，其相互作用的自由能變化相當于3-12kcal/mol的范圍。我們知道，共價鍵的自由能變化在50-HOkcal/mol的范圍內，相比之下,底物與酶的結合力是很弱的。四、活性部位的裂隙具有高度疏水性在已知結構的酶分子中，與底物分子結合的活性部位裂隙，通常水分子是進不去的,除非水分子本身是底物分子。裂隙中也含有幾個對結合和催化來說是必需的極性殘基，但并不影響整個裂隙的疏水性，因此有人將活性部位形象地稱之為“疏水口袋”，活性部位的疏水性增進了底物的結合，是

4、酶具有高效率的原因之一。參與底物結合的基團總和稱為結合部位，參與催化過程的基團總和稱為催化部位。實際上這兩個部位的幾何位置并不截然分開，采用這兩個名稱只是為了便于說明作用的機制。五、活性部位構象上的柔性酶催化的專一性取決于酶分子活性部位必需基團各原子的空間排布以及酶與底物之間的多點結合。1890年Fisher曾提出酶和底物相互作用的鎖一匙模,然而后來研究結果表明，酶的活性部位并不是剛性不變的，在結合底物時酶分子的活性部位構象發(fā)生了改變，這個過程是個動態(tài)的過程，稱為nO近年來，基于大量的在去折疊過程中失活與構象變化的比較研究的重要事實，我國科學家鄒承魯提出了酶分子的活性部位柔性的理論，并指出這種

5、柔性是酶催化作用所必需的。也就是說，酶分子的活性部位構象上相對的柔性是酶催化所必需的。一、發(fā)現(xiàn)與證實ChT（胰凝乳蛋白酶）241個氨基酸，分子量25700o此酶可水解芳香族氨基酸的竣基端形成的鍵；可水解芳香族氨基酸的竣基端形成的酯鍵。設計人造底物乙酰酪氨酸乙酯。由于底物很小，故它與酶只是點接觸，而酶又能使其水解，說明酶分子直接參與酶催化的部位只不過是一小部分。溶菌酶129個氨基酸，分子量14600o水解細胞壁（多糖）而溶菌酶直接接觸的只是六個六碳糖，也說明酶分子只有小部分參與作用。I(抑制劑)t二異丙基氟磷(DFP)ChT+DEP活性喪失ho2CHC-0EXH+II04e-coch3+蹤關&g

6、t;ly-Asp-Ser-<jly-Gly-ProLeucoch3經(jīng)測定DEP與ChT的195位Ser結合，而ChT有27個Ser,只與195-Ser結合，可見毗Ser號其它Ser性質不同，可能處于特殊部位。ChT酶原與ChT結構很相近，但DEP+ChT酶原不結合不結合者無酶活，可以推測抑制劑結合的部位可能是活栓審心二、活性部位含義酶的活性部位是酶分子的一小部分，是酶分子中與底物結合并催化反應的場所?；钚圆课皇怯蓭讉€氨基酸側鏈基團組成（包括輔酶、金屬離子等），它們在一級結構中位置可能很遠，但形成空間結構后位置很近,活性部位實質上是某一空間區(qū)域而不是一個點或面。酶的活性部位包括底物結合部位

7、、催化部位。竣肽酶A（全酶）活性部位：Tyr,Arg,Glu；Zn+o三、催化部位和結合部位催化部位是催化反應中直接參與電子授受關系的部位，經(jīng)研究ChT的催化部位已清楚，其電荷傳遞系統(tǒng)為ASP102His57Ser195（*一級結構較遠但空間位置較近）而T（胰蛋白酶）具有與ChT相同的催化部位。 ChTGly障礙小，故芳香族氨基酸易進入，因此水解芳香族氨基酸竣基形成的肽鍵 TAsp則易結合帶正電的氨基酸，故水解堿性氨基酸竣基形成的肽鍵酶活性部位的氨基酸組成直接影響其特異性，即二者結合部位不同。PhcTrp時JK簾氧蠱白聽(c)弾性董白四、酶活性部位的研究主要方法是化學修飾法，其它方法包括反應動

8、力學法、光譜法、X光衍射法（結果可靠，但必須是晶體）。化學修飾法：蛋白質+化學試劑反應引起某些氨基酸殘基或某些基團的共價的化學改變即化學修飾。此化學試劑叫化學修飾劑。水解定位（測一級結構）即可找出活性中心。如何確定修飾試劑是結合在活性部位的基團上，而不是結合到活性部位以外的基團上呢？首先要求加入修飾試劑后，酶計量失活（平行失活），其次還要根據(jù)不同的情況作進一步確定。計量失活：加入幾摩爾修飾劑就有幾摩爾的酶100%失活。特殊基團非特異性試劑使用此種試劑要求:0Y只能在活性部位中有，其它部位沒有。例：木瓜蛋白酶有7個Cys,其中6個形成S$；1Cys+碘乙酸計量失活故Cys在活性部位上。個Cys。

9、0活性部位Y,由于活性部位微環(huán)境的影響反應靈敏度極高，此時非活性中心的Y不與R結合。例：RNA酶活性部位Lys的&NH2活性特強，可被氟二硝基苯特異標記。+P選祈R具有上述二條件的酶極少，而我們要使用非特異性試劑就必須用差示標記法。差示標記法（加入保護劑）非特殊基團非特異性試劑RR R*連接的基團即活性部位。保護效果：在保護過程中要避免下述兩點： P要過量，防止剩余未被保護的Y；保護后構象變化導致YR解離。上述兩點可導致實驗誤差。前兩種標記均為共價標記。親和標記法非特殊基團親和試劑根據(jù)酶和底物的結合特性來設計底物即特異性試劑。底物+可與活性部位結合的活性基團一親和試劑（特異性較強）Ch

10、T：水解芳香族氨基酸竣基所形成的肽鍵或酯鍵，故親和試劑為甲苯磺酰-L-苯丙氨酸為基本結構。CH2CH-NHITPCK-coCH2C1ChT酶原+TPCK不結合ChT+8MjR+TPCK不結合ChT+TPCK結合TPCK結合部位必定是活性中心ChT：有兩個His殘基，一級結構的40,57位。ChT+TPCK酶水解分析氨基酸組成一只有一個His確定TPCK結合的是另一His。STPCK+ChT水解發(fā)現(xiàn)me存在于His57上,確定TPCK與第57位的His結合（即活性部位）nh2ch2ch2ch2ch2chcoch2ciNHo=s=oQch3T（胰蛋白酶）也有His,但不與TPCK結合，說明T與Ch

11、T有不同的底物專一性,T水解堿性氨基酸竣基所形成的酰胺鍵或酯鍵。它的底物是甲苯磺酰-L-賴氨酰胺（酯）TICKTLCK+T,最后找出與TLCK結合的氨基酸是His46即活性部位。其它方法：動力學分析法：若在不同的pH條件下，酶活力變化較大，而某個基團的解離程度也有較大程度的改變，則此基團是活性部位。光譜學法：最常用的紫外吸收光譜和熒光光譜。蛋白質分子中含有生色基團，當?shù)孜锝Y合時,位于結合部位的生色基團必然會發(fā)生某種變化，比較底物結合前后光譜學的變化，可推斷活性部位。X光衍射：X光衍射可直接看出活性部位（即底物結合部位），但必須是結晶。我們已經(jīng)了解到酶之所以能加速化學反應,、主要是酶能通過與底物

12、形成中間產物來降低反應的活化能。不同的酶其催化機制是有差別的，下面討論酶的催化機制和對酶高效催化有貢獻的主要因素。1、底物與酶的接近與定向效應底物的反應基團與酶活性中心的催化基團相互嚴格的定向，使得活性中心的底物濃度特別高從而使反應速度增高。研究發(fā)現(xiàn)提高酶反應速度的最主要方法是使底物分子進入酶的活性中心區(qū)域，亦即大大提高活性中心區(qū)域的底物有效濃度。除此之外，還需要使反應的基團在反應中彼此相互嚴格地“定向”，反應豔爲If煞誥速形成過渡態(tài)。見反應物的反應基團和催化劑的催化基團黔不站近.也不B兩個墓團靠近但不定向還不利于反應.彼此定向.C.兩個基團既靠近又定向.大大有利于底物形成轉變態(tài)加速反應.2、

13、底物分子的敏感鍵產生張力或變形許多酶的活性部位開始與底物并不相適應，但為了結合底物，酶的活性部位不得不發(fā)生相應變化（前面所提的誘導契合），以適應底物。一旦與底物結合，酶分子中某些基團可使底物分子的敏感鍵中電子云密度部分的增加或減少從而產生“電磁張力”使底物發(fā)生變形，使底物敏感鍵更敏感，更易于反應。下圖用一個示意圖說明酶與底物結合，使底物變形生成產物的過程。誘導契合使底物變形敏感鍵斷裂親核基Zi親電子的基3、共價催化作用某些酶能與底物形成一個反應活性很高的共價中間復合物。底物只需越過較低的活化能就可以形成產物。此既為共價催化作用。共價催化的最一般的形式是催化劑的親核基團對底物中親電子的碳原子進行

14、攻擊，親核基團含有多電子的原子，可以提供電子，它是十分有效的催化劑。酶反應中可以進行共價催化的、強有力的親核基團很多，酶蛋白分子上至少就有三種，圖中所指出的絲氨酸輕基、半胱氨酸毓基及組氨酸的咪哇基。此外對具輔酶的雙成分酶（復合蛋白質）來講,其輔酶中往往還含有另外一些親核中心。組氨酸味瞠基絲氮酸丸基半胱氨酸菰基4、酸堿催化這里指的是廣義的酸堿催化。它是一種質子供體及質子受體的催化，發(fā)生在細胞內許多類型的有機反應都是受廣義的酸堿催化的，如將水加到撥基上、酯的水解，從雙鍵上脫水、各種分子重排及許多取代反應等。酶活性中心的一些基團（氨基、竣基、酚輕基、毓基、咪哇基等）可作為質子供體或受體對底物進行催化

15、，從而加快反應速度。蛋白質中可作為廣義酸堿的功能基。其中組氨酸的咪醴基值得特別注意，因為它既是一個很強的親核基團，又是一個最有效、最活潑的廣義酸堿功能基。這是因為組氨酸的咪哇基的解離常數(shù)約為6.0,接近生物體的生理pH條件，此時它一半是酸形式、另一半是堿形式，既可以作為質子供體、也可作為質子受體，而且研究發(fā)現(xiàn)它供出和接受質子的速度十分迅速，在酶的酸堿催化中顯得特別活躍，而因其廣義堿的形式咪哇環(huán)中N原子上有未共享的電子對，所以也是親核基團，可進行共價催化作用。鑒于咪醴基有如此的優(yōu)點，雖然組氨酸在大多數(shù)蛋白質中含量很少，卻很重要。廣義酸基團（質子供體）-COOHC=CH/+HN、尹HH廣義堿基團（質子受體）-C00"-nh25、活性中心部位的微環(huán)境效應酶活性中心多半靠近位于疏水微環(huán)境的凹陷中，疏水環(huán)境中介電常數(shù)較低，故在疏水環(huán)境中兩個帶電物（底物、酶中心）之間的作用力顯著增加,從而使反應速度加快。處于低介電環(huán)境中的基團之間的反應之所以會得到加強，主要是因為