第四章 酶蛋白的化學修飾

1、Enzyme Engineering酶工程酶工程第三章第三章 酶蛋白的化學修飾酶蛋白的化學修飾n第一節(jié)第一節(jié) 化學修飾的原理化學修飾的原理n第二節(jié)第二節(jié) 化學修飾的方法學化學修飾的方法學n第三節(jié)第三節(jié) 酶蛋白側(cè)鏈基團的修飾酶蛋白側(cè)鏈基團的修飾 n第四節(jié)第四節(jié) 酶的親和修飾酶的親和修飾 n第五節(jié)第五節(jié) 酶的化學交聯(lián)酶的化學交聯(lián)n第六節(jié)第六節(jié) 酶化學修飾的應用酶化學修飾的應用第一節(jié)第一節(jié) 化學修飾的原理化學修飾的原理 一、一、 酶的化學修飾原因酶的化學修飾原因1 1 穩(wěn)定性不夠，不能適應大量生產(chǎn)的需要。穩(wěn)定性不夠，不能適應大量生產(chǎn)的需要。2 2 作用的最適條件不符。作用的最適條件不符。3 3 酶的

2、主要動力學性質(zhì)的不適應。酶的主要動力學性質(zhì)的不適應。4 4 臨床應用的特殊要求。臨床應用的特殊要求。二、定義二、定義 酶分子的化學修飾就是在分子水平上對酶進行改造，以達酶分子的化學修飾就是在分子水平上對酶進行改造，以達到到改構(gòu)改構(gòu)和和改性改性的目的。即在體外將酶分子通過人工的方法與一的目的。即在體外將酶分子通過人工的方法與一些些化學基團化學基團( (物質(zhì)物質(zhì)) )，特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進行，特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進行共價共價連接連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。這種物質(zhì)被稱為，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。這種物質(zhì)被稱為修飾試劑修飾試劑?；瘜W修飾酶主要用于基礎酶學的研究和疾病治療?；瘜W修飾

3、酶主要用于基礎酶學的研究和疾病治療。三、酶化學修飾的基本原理三、酶化學修飾的基本原理1 1 如何增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性如何增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性2 2 如何保護酶活性部位與抗抑制劑如何保護酶活性部位與抗抑制劑3 3 如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶4 4 如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境影響酶化學修飾反應進程的因素主要有兩個：影響酶化學修飾反應進程的因素主要有兩個：|酶蛋白功能基的反應性酶蛋白功能基的反應性|修飾劑的反應性修飾劑的反應性影響酶化學修飾反應進程的因素：影響酶化學修飾反應進程的因素：

4、|酶蛋白功能基的反應性酶蛋白功能基的反應性F 微區(qū)的極性：是決定基團解離狀態(tài)的關鍵因素之一。微區(qū)的極性：是決定基團解離狀態(tài)的關鍵因素之一。F 氫鍵效應：蛋白質(zhì)或其離子通過氫鍵來維持穩(wěn)定性。氫鍵效應：蛋白質(zhì)或其離子通過氫鍵來維持穩(wěn)定性。 F 靜電效應：帶電基團之間的相互影響造成的。靜電效應：帶電基團之間的相互影響造成的。F 位阻效應：當烷基在空間上緊靠著蛋白的功能基，會使位阻效應：當烷基在空間上緊靠著蛋白的功能基，會使修飾劑不能與功能基接觸，這時會出現(xiàn)位阻效應。修飾劑不能與功能基接觸，這時會出現(xiàn)位阻效應。酶蛋白功能基的酶蛋白功能基的超反應性超反應性：蛋白質(zhì)的某個側(cè)鏈基團與：蛋白質(zhì)的某個側(cè)鏈基團與

5、個別試劑能發(fā)生非常迅速的反應。但不一定是酶的活個別試劑能發(fā)生非常迅速的反應。但不一定是酶的活性部位基團。性部位基團。影響酶化學修飾反應進程的因素：影響酶化學修飾反應進程的因素：|修飾劑的反應性修飾劑的反應性F選擇吸附選擇吸附 ：修飾劑根據(jù)各自特點，選擇性地吸附在低：修飾劑根據(jù)各自特點，選擇性地吸附在低極性區(qū)域或高極性區(qū)，形成極性區(qū)域或高極性區(qū)，形成蛋白質(zhì)修飾劑蛋白質(zhì)修飾劑復合物。復合物。F靜電相互作用：帶電修飾劑可以選擇性地吸引在蛋白靜電相互作用：帶電修飾劑可以選擇性地吸引在蛋白質(zhì)表面帶質(zhì)表面帶相反電荷相反電荷的部位。的部位。(碘乙酸和碘乙酰胺烷基碘乙酸和碘乙酰胺烷基化的速度化的速度)F位阻因

6、素：位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正位阻因素：位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應。常反應。(溴代酸的大小影響修飾）溴代酸的大小影響修飾）F催化因素：不同的修飾劑，其反應速度和反應部位有催化因素：不同的修飾劑，其反應速度和反應部位有明顯差異，較大程度上與酶的酸堿催化有關。明顯差異，較大程度上與酶的酸堿催化有關。F局部環(huán)境的極性：大多反應會與溶劑的極性有關，且局部環(huán)境的極性：大多反應會與溶劑的極性有關，且溶劑效應相當復雜。溶劑效應相當復雜。第二節(jié)第二節(jié) 化學修飾的方法學化學修飾的方法學 一、一、 修飾劑的要求修飾劑的要求二、二、 反應條件的選擇反應條件的選擇三、三、 酶性質(zhì)的了解酶性質(zhì)

7、的了解四、四、 酶修飾方法酶修飾方法一、一、 修飾劑的要求修飾劑的要求1 1 修飾劑的分子大小、修飾劑鏈的長度對蛋修飾劑的分子大小、修飾劑鏈的長度對蛋 白質(zhì)的吸附性。白質(zhì)的吸附性。2 2 修飾劑上反應基團的數(shù)目及位置。修飾劑上反應基團的數(shù)目及位置。3 3 修飾劑上反應基團的活化方法與條件。修飾劑上反應基團的活化方法與條件。 在酶蛋白不變性的條件下有選擇性地與氨在酶蛋白不變性的條件下有選擇性地與氨基酸殘基反應，易分離修飾后的衍生物以便進基酸殘基反應，易分離修飾后的衍生物以便進行測定。行測定。根據(jù)修飾目的、專一性而定根據(jù)修飾目的、專一性而定二、二、 反應條件的選擇反應條件的選擇 反應條件應盡可能保

8、證蛋白質(zhì)特定空間構(gòu)象不變反應條件應盡可能保證蛋白質(zhì)特定空間構(gòu)象不變或少變的情況下進行?；蛏僮兊那闆r下進行。 避免不可逆變性、有利于專一性修飾蛋白避免不可逆變性、有利于專一性修飾蛋白1 1 反應體系中酶與修飾劑的分子比例。反應體系中酶與修飾劑的分子比例。 酶與修飾試劑的比例可以控制酶分子的修飾程度。酶與修飾試劑的比例可以控制酶分子的修飾程度。2 2 反應體系的溶劑性質(zhì)，鹽濃度和反應體系的溶劑性質(zhì)，鹽濃度和pHpH條件。條件。 pHpH決定了酶蛋白分子中反應基團的解離狀態(tài)。由決定了酶蛋白分子中反應基團的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應性能也不同。于它們的解離狀態(tài)不同，反應性能也不同。3 3

9、反應溫度及時間。反應溫度及時間。 嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應。專一性的修飾反應。三、三、 酶性質(zhì)的了解酶性質(zhì)的了解1 1 酶活性部位情況。酶活性部位情況。 活性中心基團、輔因子等。其他如分子大活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。小、性狀、亞基數(shù)等。2 2 酶的穩(wěn)定條件、酶反應最適條件。酶的穩(wěn)定條件、酶反應最適條件。 熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pHpH、抑制劑等。抑制劑等。3 3 酶分子側(cè)鏈基團的化學性質(zhì)及反應活潑性酶分子側(cè)鏈基團的化學性質(zhì)及反應活潑性等。等。 修飾酶的

10、性質(zhì)及特點修飾酶的性質(zhì)及特點n熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性n抗原性抗原性n體內(nèi)半衰期體內(nèi)半衰期n酶學性質(zhì)的改變酶學性質(zhì)的改變n最適最適pHn對組織的分布能力變化對組織的分布能力變化熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性n熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性增加增加q修飾劑與酶多點交聯(lián)，固定了酶的分子構(gòu)象，增修飾劑與酶多點交聯(lián)，固定了酶的分子構(gòu)象，增強了酶的熱穩(wěn)定性。強了酶的熱穩(wěn)定性。q增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性減少了酶熱失活。增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性減少了酶熱失活。 抗原性抗原性q 部分可部分可消除消除。PEG、人血清白蛋白在消除酶抗原、人血清白蛋白在消除酶抗原 性上效果明顯。性上效果明顯。 修飾酶的性質(zhì)及特點修飾酶的性質(zhì)及特點體內(nèi)半衰期體內(nèi)半衰期q體

11、內(nèi)半衰期體內(nèi)半衰期延長延長 修飾酶的性質(zhì)及特點修飾酶的性質(zhì)及特點酶學性質(zhì)的改變酶學性質(zhì)的改變q絕大多數(shù)酶經(jīng)過修飾后，最大反應速度沒有改變，絕大多數(shù)酶經(jīng)過修飾后，最大反應速度沒有改變，但有些酶在修飾后，米氏常數(shù)會但有些酶在修飾后，米氏常數(shù)會增大增大。修飾酶的性質(zhì)及特點修飾酶的性質(zhì)及特點 對組織的分布能力變化對組織的分布能力變化q對組織的分布能力有所改變，能在血液中被對組織的分布能力有所改變，能在血液中被靶器官選擇性地吸收。靶器官選擇性地吸收。最適最適pHq 有些酶經(jīng)過化學修飾后，最適有些酶經(jīng)過化學修飾后，最適pH發(fā)生變化。發(fā)生變化。修飾酶的性質(zhì)及特點修飾酶的性質(zhì)及特點四、四、 酶修飾方法酶修飾方

12、法n 酶分子側(cè)鏈基團的化學修飾酶分子側(cè)鏈基團的化學修飾 n 有機大分子對酶的化學修飾有機大分子對酶的化學修飾n 蛋白質(zhì)類及其他對酶的化學修飾蛋白質(zhì)類及其他對酶的化學修飾第三節(jié)第三節(jié) 酶蛋白側(cè)鏈的修飾酶蛋白側(cè)鏈的修飾 一、幾種重要的修飾反應一、幾種重要的修飾反應 酰化反應?；磻?烷基化反應烷基化反應 氧化和還原反應氧化和還原反應 芳香環(huán)取代反應芳香環(huán)取代反應二、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團的化學修飾二、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團的化學修飾三、研究新熱點三、研究新熱點一、幾種重要的修飾反應一、幾種重要的修飾反應1 1酰化及其相關反應?；捌湎嚓P反應2 2烷基化反應烷基化反應 3 3氧化和還原反應氧化和還原

13、反應 4 4芳香環(huán)取代反應芳香環(huán)取代反應 二、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團的化學修飾二、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團的化學修飾 1 1巰基的化學修飾巰基的化學修飾|巰基具有很強的親核性，采用巰基化學巰基具有很強的親核性，采用巰基化學修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈上的巰基結(jié)合，使巰修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈上的巰基結(jié)合，使巰基發(fā)生改變，從而改變酶的空間構(gòu)象、特基發(fā)生改變，從而改變酶的空間構(gòu)象、特性和功能。性和功能。|常用修飾劑：烷基化劑、酰化基、常用修飾劑：烷基化劑、?；?、 馬來酰亞胺馬來酰亞胺2 2氨基的化學修飾氨基的化學修飾|氨基容易被選擇性修飾，氨基烷基化已氨基容易被選擇性修飾，氨基烷基化已成為重要的賴氨酸修飾方法，化

14、學修飾也成為重要的賴氨酸修飾方法，化學修飾也常用于蛋白質(zhì)序列分析（多肽鏈的常用于蛋白質(zhì)序列分析（多肽鏈的N N端分端分析）析）。|常用修飾劑：鹵代乙酸、芳香鹵、磷酸常用修飾劑：鹵代乙酸、芳香鹵、磷酸 吡哆醛、吡哆醛、2 2，4 4二硝基氟二硝基氟 苯苯DNFBDNFB、丹磺酰氯、丹磺酰氯DNSDNS3 3羧基的化學修飾羧基的化學修飾 4 4咪唑基的化學修飾咪唑基的化學修飾 |組氨酸殘基位于許多酶的活性中心，修組氨酸殘基位于許多酶的活性中心，修飾劑焦碳酸二乙酯飾劑焦碳酸二乙酯DPCDPC對其有較好的專一性，對其有較好的專一性，修飾產(chǎn)物在修飾產(chǎn)物在240nm240nm處有最大吸收。處有最大吸收。|

15、常用修飾劑：碘代乙酸、焦碳酸二乙酯常用修飾劑：碘代乙酸、焦碳酸二乙酯DPCDPC（均能修飾咪唑環(huán)上的兩個氮原子）（均能修飾咪唑環(huán)上的兩個氮原子）5 5胍基的化學修飾胍基的化學修飾 |精氨酸殘基的胍基在中性或弱堿性條件精氨酸殘基的胍基在中性或弱堿性條件下能與修飾劑發(fā)生反應。下能與修飾劑發(fā)生反應。|常用修飾劑：具有兩個臨位羰基的化合常用修飾劑：具有兩個臨位羰基的化合物物丁二酮、苯乙二醛、丁二酮、苯乙二醛、1 1，2 2環(huán)己二環(huán)己二酮等。酮等。6. 6. 酚羥基的化學修飾酚羥基的化學修飾 |酪氨酸殘基的酚羥基可被修飾。蘇氨酸酪氨酸殘基的酚羥基可被修飾。蘇氨酸和絲氨酸殘基的羥基也可被該類修飾劑修和絲氨

16、酸殘基的羥基也可被該類修飾劑修飾，且產(chǎn)物更為穩(wěn)定，但反應條件嚴格。飾，且產(chǎn)物更為穩(wěn)定，但反應條件嚴格。四硝基甲烷四硝基甲烷TNMTNM在溫和條件下高度專一性地在溫和條件下高度專一性地硝化，生成可電離的發(fā)色物質(zhì)，可用于氨硝化，生成可電離的發(fā)色物質(zhì)，可用于氨基酸定量分析?；岫糠治?。|常用修飾劑：四硝基甲烷常用修飾劑：四硝基甲烷TNMTNM、碘、二異、碘、二異丙基氟磷酸酯丙基氟磷酸酯DFPDFP7. 7. 色氨酸吲哚基的化學修飾色氨酸吲哚基的化學修飾 |色氨酸殘基的吲哚基比巰基、氨基反應色氨酸殘基的吲哚基比巰基、氨基反應性差，性差，HNBB HNBB 和和4 4硝基苯硫氯對吲哚基修硝基苯硫氯對吲

17、哚基修飾比較專一。飾比較專一。KoshlandKoshland試劑試劑二甲基二甲基（2 2羥基羥基5 5硝基芐基）溴化锍硝基芐基）溴化锍,水溶水溶性好，有利于修飾酶，修飾色氨酸時應對性好，有利于修飾酶，修飾色氨酸時應對巰基進行保護。巰基進行保護。|常用修飾劑：常用修飾劑：N N溴代琥珀酰亞胺溴代琥珀酰亞胺NBSNBS、2 2羥基羥基5 5硝基芐溴硝基芐溴HNBBHNBB、4 4硝基苯硫硝基苯硫氯、氯、KoshlandKoshland試劑試劑三、研究熱點三、研究熱點- -核酸類酶的修飾核酸類酶的修飾 nRNARNA酶的側(cè)鏈基團：指組成酶的側(cè)鏈基團：指組成RNARNA的核苷酸殘的核苷酸殘基上的功能

18、團。主要是核糖基上的功能團。主要是核糖2-2-位置上的位置上的羥基和嘌呤、嘧啶堿基上的氨基和羥基。羥基和嘌呤、嘧啶堿基上的氨基和羥基。第四節(jié)第四節(jié) 酶的親和修飾酶的親和修飾 酶的位點專一性修飾是根據(jù)酶和底物的酶的位點專一性修飾是根據(jù)酶和底物的親和性，試劑作用于親和性，試劑作用于被作用部位的某一基團被作用部位的某一基團，而不與被作用部位以外的同類基團發(fā)生作用，而不與被作用部位以外的同類基團發(fā)生作用，這類修飾劑也稱為位點專一性抑制劑。這類修飾劑也稱為位點專一性抑制劑。具有具有與底物類似的結(jié)構(gòu)，對酶活性部位有高度的與底物類似的結(jié)構(gòu)，對酶活性部位有高度的親和性，對活性部位的氨基酸殘基可進行共親和性，對

19、活性部位的氨基酸殘基可進行共價標記。價標記。因此這類專一性化學修飾也稱為因此這類專一性化學修飾也稱為親親和標記或?qū)Ｒ恍缘牟豢赡嬉种?。和標記或?qū)Ｒ恍缘牟豢赡嬉种?。一、親和標記一、親和標記 用于親和標記的親和試劑應符合如下用于親和標記的親和試劑應符合如下條件條件：v 在使酶不可逆失活之前，親和試劑要與酶形在使酶不可逆失活之前，親和試劑要與酶形 成可逆復合物；成可逆復合物；v親和試劑的修飾程度是有限的；親和試劑的修飾程度是有限的；v沒有反應性的競爭性配體的存在應減弱親和沒有反應性的競爭性配體的存在應減弱親和 試劑的反應速度；試劑的反應速度；v親和試劑體積不能太大，否則會產(chǎn)生空間障親和試劑體積不能太大

20、，否則會產(chǎn)生空間障礙；礙；v修飾產(chǎn)物應當穩(wěn)定，便于表征和定量。修飾產(chǎn)物應當穩(wěn)定，便于表征和定量。n親和標記分類親和標記分類 K Ks s型不可逆抑制：型不可逆抑制：底物、競爭性抑制劑底物、競爭性抑制劑 對修飾有保護作用，反應定量定點進行。對修飾有保護作用，反應定量定點進行。 K Kcatcat型不可逆抑制：型不可逆抑制：專一性很高專一性很高二、外生親和試劑與光親和標記二、外生親和試劑與光親和標記 內(nèi)生親和試劑內(nèi)生親和試劑：試劑本身的某部分通過化學方法轉(zhuǎn)：試劑本身的某部分通過化學方法轉(zhuǎn) 化為所需要的反應基團，而對試化為所需要的反應基團，而對試 劑的結(jié)構(gòu)沒有大的擾動。劑的結(jié)構(gòu)沒有大的擾動。親和試劑

21、親和試劑 外生親和試劑外生親和試劑：把反應性基團加入到試劑中去。：把反應性基團加入到試劑中去。|光親和試劑光親和試劑是一類特殊的外生親和試劑，它在結(jié)構(gòu)上除是一類特殊的外生親和試劑，它在結(jié)構(gòu)上除了有一般親和試劑的特點外，還具有一個光反應基團。這種了有一般親和試劑的特點外，還具有一個光反應基團。這種試劑先與酶活性部位在暗反應條件下發(fā)生特異性結(jié)合，然后試劑先與酶活性部位在暗反應條件下發(fā)生特異性結(jié)合，然后被光照激活，產(chǎn)生一個非?；顫姷墓δ芑鶊F能與它們附近幾被光照激活，產(chǎn)生一個非?；顫姷墓δ芑鶊F能與它們附近幾乎所有基團反應，形成一個共價的標記物。乎所有基團反應，形成一個共價的標記物。第五節(jié)第五節(jié) 酶的化

22、學交聯(lián)酶的化學交聯(lián)n定義：定義：酶的化學交聯(lián)是一類重要的化學修酶的化學交聯(lián)是一類重要的化學修飾。交聯(lián)劑有兩個反應活性部位的飾。交聯(lián)劑有兩個反應活性部位的雙功能雙功能基團基團可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基之可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基之間，或酶與其他分子之間發(fā)生交聯(lián)反應。間，或酶與其他分子之間發(fā)生交聯(lián)反應。n分類：分類：交聯(lián)劑分為交聯(lián)劑分為同型雙功能試劑、異型同型雙功能試劑、異型雙功能試劑和可被光活化試劑雙功能試劑和可被光活化試劑三種類型，三種類型，每類又每類又可分為可裂解型可分為可裂解型和和不可裂解型不可裂解型。n同型雙功能交聯(lián)劑同型雙功能交聯(lián)劑兩端具有相同的活性反應基團。兩端具有相同的活性反應基團。n異型雙功能交聯(lián)劑異型雙功能交聯(lián)劑的一端與氨基作用，另一端一的一端與氨基作用，另一端一般與巰基作用（羧基）。般與巰基作用（羧基）。n可被光活化的高交聯(lián)劑可被光活化的高交聯(lián)劑一端與酶反應，經(jīng)光照，一端與酶反應，經(jīng)光照，另一端產(chǎn)生一個活性反應基團（自由基）。它們另一端產(chǎn)生一個活性反應基團（自由基）。它們具有高反應性，沒有