瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)的原理和方法學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)(jsh)的原理和方的原理和方法法第一頁，共21頁。第1頁/共21頁第二頁，共21頁。（1）某物質(zhì)在電場作用）某物質(zhì)在電場作用(zuyng)下的遷移速度叫做電泳的速率，電泳的速率與下的遷移速度叫做電泳的速率，電泳的速率與核酸分子大小和構(gòu)型有關(guān)。核酸分子大小和構(gòu)型有關(guān)。 DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用(zuyng)下向正極泳動(dòng)。下向正極泳動(dòng)。分子質(zhì)量越小跑得越快，緊密構(gòu)型快于松散型開環(huán)分子或線性分子，從而可以分子質(zhì)量越小跑得越快，緊密構(gòu)型快于松散型開環(huán)分子或線性分子，從而可以分離大小不同的分離

2、大小不同的DNA或或RNA分子。分子。（2 2）瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，可以形成）瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，可以形成(xngchng)(xngchng)具有剛性的濾孔，具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。就越強(qiáng)。第2頁/共21頁第三頁，共21頁。 配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNADNA分子大小來確定。瓊脂糖是一種分子大小來確定。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨(

3、fnbin)(fnbin)能力就越強(qiáng)。能力就越強(qiáng)。（3 3）溴化乙錠為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。）溴化乙錠為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EBEB可與可與DNADNA分子形成分子形成EB-DNAEB-DNA復(fù)合物，其熒光強(qiáng)度與復(fù)合物，其熒光強(qiáng)度與DNADNA的含量成正比。據(jù)此可判斷的含量成正比。據(jù)此可判斷DNADNA分子量大小分子量大小(dxio)(dxio)和粗略估計(jì)樣品和粗略估計(jì)樣品DNADNA濃度。濃度。 表表1 1 瓊脂糖凝膠的濃度瓊脂糖凝膠的濃度(nngd)(nngd)與與DNADNA分子大小的關(guān)系分子大小的關(guān)系第3頁/共21頁第四頁，共21頁。第4頁/共21頁第五頁

4、，共21頁。DYY-6CDYY-6C型型 雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源（北京雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源（北京(bi jn)(bi jn)六一）六一） 輸出范圍（顯示分辨率）：輸出范圍（顯示分辨率）：6-600V(1V) 4-400mA(1mA)240W6-600V(1V) 4-400mA(1mA)240W美國美國Bio-radBio-rad伯樂伯樂 小型小型(xioxng)(xioxng)水平電泳槽水平電泳槽Mini-Sub Cell GT Cell Mini-Sub Cell GT Cell 第5頁/共21頁第六頁，共21頁。第6頁/共21頁第七頁，共21頁。一個(gè)已知分子質(zhì)量的一個(gè)已知分子質(zhì)量的DNADNA樣

5、品做最對(duì)照樣品做最對(duì)照(duzho)(duzho)，用，用來確定待測(cè)樣品的相對(duì)分來確定待測(cè)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。子質(zhì)量。第7頁/共21頁第八頁，共21頁。4.4.常用常用(chn (chn yn)yn)電泳緩沖液電泳緩沖液高度復(fù)雜高度復(fù)雜DNADNA混混合物；超螺旋合物；超螺旋DNADNA 電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般(ybn)(ybn)與蔗糖、甘油或聚蔗糖與蔗糖、甘油或聚蔗糖400400組成上樣組成上樣緩沖液。作用：緩沖液。作用：增加樣品比重，以確保增加樣品比重，以確保DNADNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。均勻沉入加樣孔內(nèi)。形成肉眼可見的指示帶，

6、預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。使樣品呈色，使加樣操作更方便。使樣品呈色，使加樣操作更方便。5.上樣緩沖液上樣緩沖液第8頁/共21頁第九頁，共21頁。4.4.常用核酸常用核酸(h sun)(h sun)染料染料名稱名稱優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn) EB （溴化乙錠）（溴化乙錠）染色操作簡便，快速，室溫下染色操作簡便，快速，室溫下15-2015-20minmin；不會(huì)使核酸斷裂；不會(huì)使核酸斷裂；靈敏度高，靈敏度高，1010ngng或更少的或更少的DNADNA即可檢出；可以加到樣品中或即可檢出；可以加到樣品中或膠中。膠中。 EB EB是誘變劑，使用時(shí)是誘變劑，使用時(shí)一

7、定要戴手套。一定要戴手套。 EBEB廢廢液要經(jīng)過處理才能丟棄。液要經(jīng)過處理才能丟棄。Gldview 低毒，靈敏度較高的染料；低毒，靈敏度較高的染料；可以加入樣品中?？梢约尤霕悠分?。dsDNAdsDNA呈現(xiàn)呈現(xiàn)綠色熒光綠色熒光, ,而而ssDNAssDNA呈紅色熒光呈紅色熒光, ,能較好地區(qū)分能較好地區(qū)分dsDNAdsDNA與與ssDNAssDNA。 價(jià)格稍高，靈敏度價(jià)格稍高，靈敏度 較較低。背景強(qiáng)烈。低。背景強(qiáng)烈。SYBR新型低毒，高靈敏度染料，可新型低毒，高靈敏度染料，可以加入樣品中。以加入樣品中。 價(jià)格昂貴。對(duì)小于價(jià)格昂貴。對(duì)小于50 bp染色缺失，小于染色缺失，小于100的染色效果較差。

8、穩(wěn)定的染色效果較差。穩(wěn)定性差性差GenefinderGenefinder 花青類染料花青類染料,毒性很低；最大吸收毒性很低；最大吸收峰為峰為 470nm。具有安全、靈敏、。具有安全、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn) 重復(fù)性較差。能引起重復(fù)性較差。能引起有機(jī)體突變。有機(jī)體突變。第9頁/共21頁第十頁，共21頁。第10頁/共21頁第十一頁，共21頁。1.1.制備瓊脂糖制備瓊脂糖凝膠（凝膠（1%1%）2.2.制備凝膠板制備凝膠板3.3.加樣加樣4.4.電泳電泳 5.5.染色染色(rns)(rns)6.6.結(jié)果觀察結(jié)果觀察 四四. .實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)步驟步驟第11頁/共21頁第十二頁，共21

9、頁。膠板設(shè)計(jì)膠板設(shè)計(jì)(shj)（27人）：人）：每每11孔膠板（孔膠板（4人：人：2樣品樣品+1marker）。）。第12頁/共21頁第十三頁，共21頁。5l質(zhì)粒質(zhì)粒DNA+1l loading buffer 混混勻；勻；15lPCR產(chǎn)物產(chǎn)物(chnw)+3l loading buffer，混勻；，混勻；10l酶切產(chǎn)物酶切產(chǎn)物(chnw)+2l load- ingbuffer混勻；混勻；5l DNA Marker(每板膠一孔）每板膠一孔）2.加樣加樣第13頁/共21頁第十四頁，共21頁。3.電泳電泳(din yn)電壓電壓3-5V/cm，約，約80-90V，注意電極，注意電極(dinj)方向方

10、向第14頁/共21頁第十五頁，共21頁。4.觀察觀察(gunch)紫外透射紫外透射(tu sh)分析儀下觀察。分析儀下觀察。第15頁/共21頁第十六頁，共21頁。第16頁/共21頁第十七頁，共21頁。第17頁/共21頁第十八頁，共21頁。 瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂糖鏈依分子瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂糖鏈依分子(fnz)(fnz)內(nèi)和分子內(nèi)和分子(fnz)(fnz)間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。 瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)(ji

11、gu)(jigu)形成形成過程過程 瓊脂糖單糖瓊脂糖單糖(dn tn)(dn tn)分子分子結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 瓊脂糖粉形成瓊脂糖凝膠的過程瓊脂糖粉形成瓊脂糖凝膠的過程第18頁/共21頁第十九頁，共21頁。 DNA DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNADNA分子在高于等電點(diǎn)的分子在高于等電點(diǎn)的pHpH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。在一定溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。在一定(ydng)(ydng)的電場強(qiáng)度下，的電場強(qiáng)度下，DNADNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNADNA分子本身的大小和構(gòu)型。當(dāng)分子本身的大小和構(gòu)型。當(dāng)DNADNA分子大小超過分子大小超過20kb20kb時(shí)，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開，此時(shí)電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳分離時(shí)，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開，此時(shí)電泳的遷移率