綜述-單克隆抗體的研究進展

1、單克隆抗體的研究進展摘要：單克隆抗體近年來發(fā)展迅速，并廣泛應用于醫(yī)學，生物學，免疫學等多種學科。單抗藥物可用于治療腫瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病，尤其是用于治療腫瘤，已顯示出良好的前景。本文參閱近10年國內(nèi)外相關文獻，并進行整理，綜述單克隆抗體的研究進展，著重闡述用于治療腫瘤的單克隆抗體應用中存在的問題、解決方法以及研究的展望。關鍵詞：單克隆抗體；抗腫瘤藥物；治療單抗藥物治療疾病具有明確的靶向性，作用機制明確，因而具有起效快、療效好、副作用小等優(yōu)點。尤其是對腫瘤的治療，能克服化療藥物不能有效區(qū)分正常細胞和腫瘤細胞、副作用大等缺點。同時，單克隆抗體體積小，能更有效地透入腫瘤；分子小、消除

2、快、累積毒性?。凰鶖y帶的彈頭脫離后，可較快被清除；循環(huán)中免疫靶向結合物對靶細胞的競爭作用??；半衰期短；穿透性好；能穿過血腦屏障，因而還可以作為新一代靶向載體。與化學藥物、毒素、放射性核素、生物因子、基因、分化誘導劑、光敏劑、酶等物質(zhì)構成單克隆抗體靶向藥物，把殺傷腫瘤細胞的活性物質(zhì)特異的輸送到腫瘤部位，利用單抗對腫瘤表面相關抗原或特定的受體特異性識別，從而把藥物直接導向腫瘤細胞，提高藥物療效，降低藥物對循環(huán)系統(tǒng)及其他部位的毒性1。1作用機制目前，單抗的作用機制并不十分明確，通過研究，目前認為有阻斷作用、信號傳導作用以及靶向作用等三種作用機制1。1.1 阻斷作用現(xiàn)用于臨床的大部分未偶聯(lián)單抗主要用于

3、自身免疫和免疫抑制，是通過阻斷和調(diào)節(jié)作用完成的。幾乎在所有的單抗應用中，通常是通過阻斷免疫系統(tǒng)的一種重要的胞槳或受體-配體相互作用而實現(xiàn)的。另一種相類似的阻斷活性可能存在于單抗的抗病毒感染中，通過阻斷和抵消病原體的進入和擴散表現(xiàn)出對機體的防御功能，短期給予單抗后可取得長期療效。腫瘤細胞生長、擴增和分化，需要各種生長因子的持續(xù)性刺激，而這些生長因子也參與腫瘤的侵潤、轉(zhuǎn)移和血管生成，單克隆抗體與其受體結合，可抑制配體-受體的相互作用，從而使得這些腫瘤細胞得不到生長因子的刺激而自行死亡。貝伐單抗通過結合VEGF受體，阻斷VEGR與受體的結合，抑制內(nèi)皮細胞增殖或者血管生成，抑制病灶轉(zhuǎn)移2。Trastu

4、zumab而言,1.2 信號傳導作用許多抗癌單抗是通過恢復效應因子，直接啟動信號機制而獲得細胞毒效應的。對單抗結合可誘導一系列在腫瘤生長控制中起作用的信號傳遞，該抗原是生長因子受體家族的一個成員，能提供重要的有絲分裂信號，其單抗似乎能阻斷與促進腫瘤生長有關的重要的配體一受體相互作用31.3 靶向作用單抗靶向腫瘤細胞的首要目的是產(chǎn)生腫瘤特異性反應物，然后由免疫系統(tǒng)中的活化因子將其消滅。但現(xiàn)在對體內(nèi)的抗體一效應因子作用機制發(fā)揮程度還不清楚，也不清楚能否作用于大量腫瘤細胞。2單克隆抗體藥物應用現(xiàn)狀單抗藥物一般分為：治療疾?。ㄓ绕涫悄[瘤）的單抗藥劑、抗腫瘤單抗偶聯(lián)物、治療其他疾病的單抗。單抗藥劑針對的

5、靶點通常為細胞表面的疾病相關抗原或特定的受體。如：最早被美國FDA批準用于治療腫瘤的單抗藥物利妥昔單抗?？鼓[瘤單抗偶聯(lián)物，或稱免疫偶聯(lián)物（Immunoconjugate）由單抗與有治療作用的物質(zhì)（如：放射性核素、毒素和藥物等）兩部分構成，其中包括放射免疫偶聯(lián)物、免疫毒素、化學免疫偶聯(lián)物，此外還有酶結合單抗偶聯(lián)物、光敏劑結合單抗偶聯(lián)物等4?；瘜W藥物與單抗相結合的偶聯(lián)物，作用于病變區(qū)域，不但提高藥物的療效，而且還能降低藥物對各臟器組織的細胞毒性。單抗與放射性同位素的偶聯(lián)物，即放射免疫偶聯(lián)物，其與化學藥物連接在一起，起一種雙“彈頭”的靶向作用，從而增強對腫瘤細胞的殺傷效應、提高對腫瘤細胞的細胞毒性。

6、毒素與單抗的偶聯(lián)物，免疫毒素來源于植物或細胞毒素由于有強烈的毒性很難作為治療劑使用，但毒素與單抗的偶聯(lián)物可在動物模型中顯示療效。單抗由于具有諸多優(yōu)點，在疾病的治療中發(fā)揮了重要的作用。在惡性腫瘤治療方面，無論是單抗為主，還是單抗耦聯(lián)放射性物質(zhì)、化療藥物等的免疫治療，都取得了較好的效果。在其他疾?。ㄈ邕^敏性疾病、感染性疾病、炎癥性疾病、器官移植、自身免疫性疾病等）以及一些臨床上疑難病的治療上也取得了新的進展，使疾病的治療有了更廣的選擇性，不再局限于原有藥物的治療，特別是人源化程度較好的抗體的使用，已大大減少了異源性反應5。3單抗應用中存在的問題及解決途徑單抗藥物的臨床研究結果已展示出良好的前景，但

7、仍有些問題需要進一步研究解決。單抗藥物存在的問題主要涉及免疫學和藥理學兩方面：3.1 免疫學方面問題主要是人抗鼠抗體（HAMA）反應。因為多年來用于臨床研究的單抗藥物多數(shù)使用小鼠單抗制備，往往導致HAMA反應。此外，腫瘤細胞群體在抗原性方面的異質(zhì)性，可能影響單抗藥物的療效。MakiGoto等冏研究發(fā)現(xiàn)在單抗治療結直腸癌之前，患者的血清中就有HAMA相關反應，臨床醫(yī)師在使用抗體治療時應該警惕HAMA表達的可能性。對于免疫學方面的問題，仍有許多需要研究的地方，現(xiàn)在解決的方法一般是降低藥物的免疫原性，主要途徑是使鼠源性單抗人源化或研制完全的人源抗體。單抗人源化主要通過基因工程技術制備嵌合抗體或改形抗

8、體，嵌合抗體是將Fc段置換為人源性，其它部分仍為鼠源性。改形抗體是指除互補決定區(qū)（CDR）為鼠源性外，其它部分均為人源性。臨床研究表明，嵌合抗體的副反應輕，HAMA反應率較鼠源性單抗低，在血中半衰期也較長。3.2 藥理學方面的問題主要是到達作用部位的藥量不足。單抗藥物具有體內(nèi)分布特異性，但有研究表明，能到達作用部位的藥物量仍屬有限。據(jù)推算，腫瘤組織的單抗攝取量約為0.005%（注入劑量/克組織），說明可到達靶部位的藥物量甚少。單抗藥物在體內(nèi)運送過程受多種因素影響。由于它是異體蛋白，會被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，有相當數(shù)量將積聚于肝、脾和骨髓。單抗藥物是大分子物質(zhì)，通過毛細血管內(nèi)皮層以及穿透腫瘤細胞外間

9、隙均受到限制。此外，部分偶聯(lián)藥物分子質(zhì)量過大，難于透過毛細管內(nèi)皮層和穿過腫瘤細胞外間隙進入腫瘤深部滯留，也是一個急需解決的問題。解決方法主要是提高單抗藥物在作用部位的濃度。第一，為提高藥物在腫瘤的濃度，單抗藥物分子的小型化是研制的重要途徑。使用抗體片段，如Fab、雙特異性抗體（bsAbs）、單鏈可變區(qū)片段（scFvs）制備分子量較小的偶聯(lián)物，可能提高對細胞外間隙的穿透性，增加到達深部腫瘤細胞的藥物量7。第二，采用局部注射。據(jù)報道，JamersonSC等8采用玻璃體內(nèi)注射貝伐單抗，用于治療假性腦瘤，發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)壓下降，并且脈絡膜新生血管減少。此外，抗血管生成內(nèi)皮生長因子藥物（anti-VEGF）的玻

10、璃體內(nèi)注射廣泛用于治療年齡相關性黃斑病變（AMD）和其他疾病的脈絡膜新生血管，并且有良好的效果9。第三，利用藥物制劑新技術，研究增加藥物在作用部位的濃度。抗體藥物也是屬于蛋白類，注射給藥后，由于腎的濾過，抗體和細胞的識別，以及物理降解，使得藥物在體內(nèi)迅速清除掉。PEG與化合物相連，能夠增加血清半衰期，減少免疫原性并增加生物利用度。如果將PEG與抗體或者抗體片段連接，將有可能延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間。近年來，一些研究人員對scFv,Fab等抗體片段進行PEG化修飾，scFv的PEG化能降低mAbs的免疫原性，簡化單抗的生產(chǎn)的步驟，PEG-scFv共軻物具有與mAbs不同的清除速率和途徑10。基于

11、這點，新的可釋放的PEG化設計可能用于抗體藥物11。單抗藥物在體內(nèi)半衰期短，需要重復給藥，從而限制了它的使用，理想的釋放模型是，先快速釋藥，然后以一個比較穩(wěn)定的速率恒定釋藥。研究表明，脂質(zhì)體具有緩釋作用，能夠緩慢釋放，延緩腎排泄和代謝，從而延長作用時間；同時能夠降低藥物毒性，提高穩(wěn)定性，如可提高胰島素脂質(zhì)體、疫苗等的穩(wěn)定性。脂質(zhì)體已經(jīng)廣泛應用于蛋白多肽類的藥物，但是對單抗的給藥系統(tǒng)研究很少，目前報道的有MajidAbrishami等12用脂質(zhì)體包載貝伐單抗，用于玻璃體內(nèi)注射給藥，與市售制劑相比，使得半衰期延長，曲線下面積是后者的1.5倍，同時也降低了毒副作用。但是，使用脂質(zhì)體包載單抗的包封率很

12、低，只有40%左右，這將成為脂質(zhì)體用于單抗給藥系統(tǒng)的一個瓶頸，需要進一步地探索。4展望抗腫瘤單抗藥物研究經(jīng)歷了比較曲折的發(fā)展過程。80年代迅猛發(fā)展，90年代初期一度處于低谷，以至近年再度成為生物技術藥物領域研究的熱點。單抗藥物研究的發(fā)展趨勢具有以下特點:4.1 單抗的人源化及小型化1975年分子生物學家G.J.F.克勒和C.米爾斯坦在細胞雜交技術的基礎上，創(chuàng)建雜交瘤技術，實現(xiàn)了結構、氨基酸順序、特異性等都一致的單抗（McAb）大量地、高滴度地、均一地生產(chǎn)。這種單克隆抗體是用其他方法所不能得到的，從根本上解決了在抗體制備中長期存在的特異性和可重復性問題，使得單抗的在很多疾病的診斷和治療中，有著不

13、可替代的優(yōu)勢。但是第一代單抗（英文名后綴是：-momab,如Ibritumomab,Tositumomab）是鼠源的，會引發(fā)人體抗鼠單抗免疫反應（HAMA）,引起嚴重的安全性問題，并限制了單抗的藥效。為了克服這個缺點，人們制備了人鼠嵌合單抗（后綴：-ximab,如：Cetuximab）。它是鼠mAbs的恒定區(qū)基因被人Abs的恒定區(qū)基因通過基因重組技術所替換而編碼產(chǎn)生的單克隆抗體13。這樣既能保持鼠單抗的特性，又降低了單抗在人體內(nèi)的免疫反應。這種單抗大約有1/3是鼠源，仍有引起潛在的免疫原性的可能，因此，人源化的單抗（后綴：-zumab,如：trastuzumab,matuzumab）發(fā)展起來。

14、人源化單抗大概含有10%的鼠可變區(qū)片段，也能誘導免疫原性，但是并不會完全地排除。為了能使單克隆抗體大量的應用于疾病治療、臨床試驗和科研中，我們不僅要降低其免疫原性，還要對其親和力、質(zhì)量、治療能力強弱等方面提更高的要求。目前，研究人員已建立多種方法生產(chǎn)完全人源性抗體（后綴：-mumab,如:panitumumab,zalutumumab）,主要有噬菌體展示技術、轉(zhuǎn)基因小鼠技術和核糖體展示技術14。這種完全人源化的單抗具有最小的免疫原性或者根本沒有免疫原性15。近年來，隨著抗體基因結構的闡明，DNA重組及轉(zhuǎn)基因技術開始用于抗體的改造，抗體的研發(fā)進入了第3代，即基因工程抗體時代，如人源化抗體、單鏈抗

15、體、抗體片段（包括抗原結合片斷（Fab）、可變區(qū)片段（Fv）、單鏈可變區(qū)片段（ScFv）、小分子抗體、某些特殊類型抗體（雙特異抗體、免疫脂質(zhì)體）及抗體融合蛋白（免疫毒素、免疫粘連素）等。與第2代單抗相比，基因工程抗體免疫原性低、特異性高、穿透力強，并且可以大量表達，大大降低了生產(chǎn)成本16。4.2 偶聯(lián)物分子的小型化及修飾龐大的偶聯(lián)物分子難以通過毛細管內(nèi)皮層和細胞外間隙到達實體瘤深部的腫瘤細胞。因此，研制小型化單抗藥物對提高療效有重要意義。通過酶切方法可得到單抗（Fab）2或Fab片段，其相對分子質(zhì)量分別相當于原抗體的2/3和1/3左右。通過基因工程技術制備的Fv片段或單鏈抗體scFv,相對分子

16、質(zhì)量約相當于抗體的1/6。研究表明，F(xiàn)ab片段較易穿透細胞外間隙到達深部的腫瘤細胞17。使用上述小型化抗體制成的單抗藥物，在藥代動力學方面將具有新特點，并可能減少或推遲人體的抗體反應。分子的小型化無疑是研制高效單抗藥物的一條重要途徑。4.3 尋找新的靶點目前，在臨床應用和已進入臨床試驗階段的單克隆抗體抗腫瘤藥，根據(jù)其作用靶位不同被分成7類,分別為人類表皮生長因子受體（Humanepidermalgrowthfactorreceptor,HER）、細胞分化抗原（Clusterofdifferentiation,CD）20、血管內(nèi)皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfac

17、tor,VEGF）/VEGF受體（VEGFR）、胰島素樣生長激素T受體（Insulin-likegrowthfactor-Ireceptor,IGF-IR）、凋亡增強子、整合素、細胞生長因子受體（c-Met）等。其中，針對HER受體、CD20和VEGF/VEGFR的這3類單克隆抗體已有藥物被批準在臨床正式應用，另外4類也有藥物被批準進入臨床試驗階段，主要用于實體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療18o基因序列庫和細胞信號的廣泛研究，為抗體靶向治療提供了許多新的靶點，尤其在腫瘤治療的應用中。單抗對相應的抗原具有高度特異性，這是單抗藥物顯示靶向性抗腫瘤作用的基礎。尋求與腫瘤細胞相關的靶點是研制單抗藥物的關

18、鍵。特定的癌基因表達蛋白、生長因子受體等均可作為單抗藥物的分子靶點。例如，TRAIL受體和CEA,這兩個靶點很有可能成為未來抗體藥研究的重點。腫瘤壞死因子-凋亡相關-誘導配體受體（Tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligandreceptor,TRAIL-R）,對一些腫瘤組織細胞表達水平較高，一旦該受體被激活，可通過天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶（Caspase）誘導腫瘤細胞凋亡，使腫瘤縮小。另外，受體的激活還能增強細胞毒性抗腫瘤藥的作用。因此，以TRAIL-R為靶點，通過單克隆抗體激活，可起到抗腫瘤作用。目前，正在開發(fā)的此類單克隆抗

19、體抗腫瘤藥有Mapatumumab和Conatumumab19。前者是TRAIL-1R激動藥，后者是TRAIL-5R激動藥。TRAIL受體是相對比較新的研究靶點，癌胚抗原（carcinoembryonicantigen,CEA）是最早研究的抗體靶點之一，是很多癌癥細胞的標志物，但是并沒有被癌癥生物學廣泛研究。但是Stanners等20人在2006年提出了CEA在腫瘤形成中的主導地位，以及與腫瘤形成相關的CEACAM6蛋白，使用單價Fab抗體片段結合CEA的特異性亞域，細胞粘附功能被抑制，CEA的肌分化阻塞第二功能被釋放?？梢灶A測，CEA即將成為一種很有研究前景的抗體治療的新靶點。4.4 開發(fā)單

20、抗新的用途單抗廣泛地應用于生物界和醫(yī)學界，目前其主要用于以下幾方面：1作為親合層析的配體；2作為生物治療的導向武器；3作為免疫抑制劑；4作為研究工作中的探針；5增強抗原的免疫原性；6作為醫(yī)學檢驗試劑：（1）診斷各類病原體。這是單抗應用最多的領域，已有大量診斷試劑商品供選擇。如用于診斷乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒等。單抗所具有的靈敏度高、特異性好的特點，使其在鑒別菌種的型及亞型、病毒變異株，以及寄生蟲不同生活周期的抗原性等方面更具獨特優(yōu)勢。NalbantsoyA等21將抗D7單抗用于沙門氏菌引起的腸炎的診斷。（2）腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原的檢測。用于腫瘤的診斷、分型及定位。盡管目

21、前尚未制備出腫瘤特異性抗原的單抗，但對腫瘤相關抗原（如甲胎蛋白、腫瘤堿性蛋白和癌胚抗原）的單抗早就用于臨床檢驗。綜上所述，隨著研究的深入，單抗即將在科研，醫(yī)藥等領域占有舉足輕重的地位。參考文獻1 姜紅，段蓉.單克隆抗體治療腫瘤的研究進展J.中國醫(yī)院藥學雜志.2006,26(11):1407-14092 NapoleoneFerrara,KennethJ.Hillan,WilliamNovotny,etal.Bevacizumab(Avastin),ahumanizedanti-VEGFmonoclonalantibodyforcancertherapyJ.BiochemicalandBioph

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