Molecular Bio02

1、高度重復(fù)中度重復(fù)單一序列1、DNA分子在生物體內(nèi)的合成包括：分子在生物體內(nèi)的合成包括：DNA復(fù)制；修復(fù)合成；反轉(zhuǎn)錄合成。DNA復(fù)制方式？2、DNA復(fù)制的幾個(gè)問(wèn)題：復(fù)制的幾個(gè)問(wèn)題：1）實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)與細(xì)胞的DNA復(fù)制是否一致？2）原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的DNA復(fù)制比較？3）DNA復(fù)制如何解決其雙連的合成方向問(wèn)題？4）需要RNA引物？5）DNA復(fù)制如何解決末端問(wèn)題？6）DNA復(fù)制如何保證其忠實(shí)性？7) 為什么新鏈合成方向是5 -3？ 3、DNA復(fù)制過(guò)程、以及所涉及的酶和蛋白因子？復(fù)制過(guò)程、以及所涉及的酶和蛋白因子？4、基本概念：、基本概念：半保留復(fù)制，半不連續(xù)復(fù)制，復(fù)制叉，復(fù)制子，岡崎片段，前導(dǎo)鏈，后隨鏈，

2、端粒，端粒酶等。5、如何通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明、如何通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明DNA復(fù)制的半保留和半不連續(xù)性？復(fù)制的半保留和半不連續(xù)性？RNA引物的證據(jù)？引物的證據(jù)？半保留機(jī)制及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證半保留機(jī)制及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證復(fù)制的起點(diǎn)、方向和速度復(fù)制的起點(diǎn)、方向和速度DNA復(fù)制的方式復(fù)制的方式半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制3H-T，數(shù)秒3H-T，培養(yǎng)岡崎片段：原核10002000nt；真核100200ntRNA引導(dǎo)引導(dǎo)DNA的復(fù)制的復(fù)制DNA聚合酶所要求，忠實(shí)性所要求，轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制？；RNA引物的大小通常110個(gè)核苷酸。引物的堿基順序與其模板相匹配；引物由引發(fā)酶產(chǎn)生(后隨鏈)；RNA引物的證據(jù)：噬菌體M13復(fù)制對(duì)Rifalmpin敏感；Re

3、iji的實(shí)驗(yàn)。線狀線狀DNA復(fù)制的末端問(wèn)題復(fù)制的末端問(wèn)題（5端空缺）DNA復(fù)制實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)復(fù)制實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)174（為原核生物模型）；酵母、SV40 （真核生物模型）為什么為什么DNA新鏈形成方向是新鏈形成方向是 5 3？ 排斥1校正切除加焦磷酸集團(tuán)錯(cuò)配修復(fù)不經(jīng)濟(jì)2 四個(gè)四個(gè)9bp的重復(fù)序列的重復(fù)序列 dnaA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn) 三個(gè)三個(gè)13bp的重復(fù)序列的重復(fù)序列復(fù)制起始的遺傳基因座復(fù)制起始的遺傳基因座 OriC in E. coli chromosomal DNA基本步驟：基本步驟： * 轉(zhuǎn)錄激活 * DnaA 識(shí)別并結(jié)合復(fù)制起點(diǎn)，DnaBDnaC六聚體與oriC 形成預(yù)引發(fā)體 * DnaG加入形成引

4、發(fā)體（oriC引發(fā)體），合成引物RNA * 引物合成后，DNApol 組裝到引發(fā)的RNA上，完成復(fù)制體復(fù)制體的組裝延伸延伸DNApol 把第一個(gè)核苷酸加到引物的3OH端標(biāo)志著延伸開(kāi)始。Subunit structure of the E. coli DNA polymerase III holoenzyme. The structure formed by two b subunits of the E. coli DNA polymerase III . This structure can clamp a DNA molecule and slide with the core polym

5、erase along the DNA molecule. 終止與分離終止與分離終止位點(diǎn)結(jié)合tus基因產(chǎn)物（DnaB抑制劑）ter生物學(xué)功能生物學(xué)功能切除引物并填補(bǔ)空缺；修復(fù)損傷；校正錯(cuò)誤DNA復(fù)制；校正錯(cuò)誤不詳SOS應(yīng)答？DNA pol 1957 Arthur Kornberg 首次發(fā)現(xiàn) DNApol，曾經(jīng)誤以為是DNA復(fù)制酶。單鏈蛋白分子，400個(gè)/細(xì)胞，（pol 10個(gè)/細(xì)胞）可被水解成兩個(gè)片段小片段(N端)：具有53外切酶活性；大片段(C端)：具有聚合活性和35 外切酶活性片段也稱為，是生物技術(shù)常用的工具酶之一。DNA pol 功能是后隨鏈合成中將RNA引物替換成DNA； DNA損傷修

6、復(fù)。DNA pol 由10種22個(gè)亞基組成的不對(duì)稱聚合體前導(dǎo)鏈合成后隨鏈合成二聚體 “滑動(dòng)鉗”引物相關(guān)的酶引物相關(guān)的酶RNA pol:, 激發(fā)復(fù)制起始，生成RNA能否作為引物還不明確。引物酶引物酶(引發(fā)酶引發(fā)酶, DnaG): 生成RNA引物。DNA空間結(jié)構(gòu)相關(guān)的酶空間結(jié)構(gòu)相關(guān)的酶DNA回旋酶（回旋酶（Top，拓?fù)涿福?，拓?fù)涿福阂胴?fù)超螺旋以抵消復(fù)制叉移動(dòng)所產(chǎn)生的正超螺旋，不需要ATP。DNA解旋酶（解旋酶（DnaB）：利用ATP水解提供能量來(lái)解開(kāi)DNA雙鏈。DNA連接酶連接酶連接岡崎片斷。復(fù)制過(guò)程的重要蛋白質(zhì)復(fù)制過(guò)程的重要蛋白質(zhì)DnaA：第一個(gè)結(jié)合到復(fù)制子上的蛋白質(zhì)，與oriC形成九聚體。

7、單鏈結(jié)合蛋白（Ssb）：保持單鏈穩(wěn)定。（DanA和Ssb均有協(xié)同效應(yīng)）Tus：作用于DnaB，阻止復(fù)制叉移動(dòng)。復(fù)制中重要的復(fù)制中重要的DNA元件元件oriC：復(fù)制起點(diǎn)，245bp，含有三個(gè)13mer（13聚體）和四個(gè)9mer。TerA，TerB，TerC，TerD，TerE，TerF模式生物模式生物/實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)酵母、SV40、非洲爪蟾復(fù)制速度復(fù)制速度：50bp/s復(fù)制子復(fù)制子：大量（哺乳動(dòng)物50000100000）起始元件起始元件：11mer， 保證一個(gè)周期只復(fù)制一次：特許因子受核膜屏障，作用后即失效。DNA聚合酶聚合酶：端粒的復(fù)制端粒的復(fù)制：Synthesis of the lagging s

8、trand requires a short primer which will be removed. At the extreme end of a chromosome, there is no way to synthesize this region when the last primer is removed. Therefore, the lagging strand is always shorter than its template by at least the length of the primer. This is the so-called end-replic

9、ation problem.Bacteria do not have the end-replication problem, because its DNA is circular. In eukaryotes, the chromosome ends are called telomeres which have at least two functions:to protect chromosomes from fusing with each other. to solve the end-replication problem. 端端 粒粒 酶酶 解 決 末 端 復(fù) 制 問(wèn) 題 的

10、概 要 步 驟 。 端 粒 酶 先 延 伸 較 長(zhǎng) 的 一 股 （ 滯后鏈模板 ） 。 然 后 引 發(fā) 酶 及 DNA 聚 合 酶 再 依 照 合 成 落 后 股 的 方 式 由 5 至 3 的 方 向 延 伸 另 一 股 。 雖 然 落 后 股 仍 然 比 模 板 股 短 ， 但 整 個(gè) DNA 已 被 加 長(zhǎng) 。The mechanism of telomere extension by telomerase In a human chromosome, the telomere is about 10 to 15 kb in length, composed of the tandem

11、repeat sequence: TTAGGG. 原核細(xì)胞DNA復(fù)制的調(diào)控？但，真核細(xì)胞DNA復(fù)制受細(xì)胞周期調(diào)控DNA的復(fù)制調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程依賴于分散的控制點(diǎn)細(xì)胞周期進(jìn)程依賴于分散的控制點(diǎn)可能有兩個(gè)點(diǎn)決定是否進(jìn)入另一個(gè)細(xì)胞周期可能有兩個(gè)點(diǎn)決定是否進(jìn)入另一個(gè)細(xì)胞周期： 1、 在G1 期允許染色體復(fù)制開(kāi)始 如果通過(guò)“許可點(diǎn)許可點(diǎn)”的條件被滿足，將有一個(gè)遲滯期，然后細(xì)胞進(jìn)入S 期。許可點(diǎn)在酵母細(xì)胞中已被明確定義，稱為起始點(diǎn)起始點(diǎn)(Start) 。在動(dòng)物細(xì)胞中稱為限限制點(diǎn)制點(diǎn)(Restriction point)。2、在G2 末期允許有絲分裂開(kāi)始。 如果細(xì)胞在這個(gè)點(diǎn)沒(méi)有分裂，它將保持含有兩倍染色體狀態(tài)

12、。檢驗(yàn)點(diǎn)檢驗(yàn)點(diǎn)(checkpoint) ：細(xì)胞周期中可以終止周期進(jìn)程的那些點(diǎn)。A checkpoint is an event in the cell cycle that can only proceed if some earlier event has been completed. 檢驗(yàn)點(diǎn)通過(guò)直接作用于控制細(xì)胞周期途徑的因子起作用。磷酸化是調(diào)控細(xì)胞周期的主要機(jī)制磷酸化是調(diào)控細(xì)胞周期的主要機(jī)制依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶（CDK）原核與真核生物的復(fù)制對(duì)比原核與真核生物的復(fù)制對(duì)比共同點(diǎn)1. Semi-conservative replication2. Semi-discontinuous repliction3. DNA helicase, Ssb4. RNA priming5. Proofreading不同點(diǎn)1. 復(fù)制起點(diǎn)（單/多）2. 復(fù)制子（大小/多少）3. 復(fù)制起始的許可因子的控制 （復(fù)制周期的重疊與否）4. 復(fù)制叉移動(dòng)的速度 (900/50 nt/S)5. 岡崎片段的大小6. 末端復(fù)制7. DNA聚合酶PolymerasesDNA復(fù)制精度10-7 10-11；RNA轉(zhuǎn)錄精度10-4 1、起始時(shí)以、起始時(shí)以RNA作為引物作為引物：開(kāi)始幾個(gè)堿基堆積力弱，容易錯(cuò)配；開(kāi)始幾個(gè)堿基對(duì)沒(méi)有形成穩(wěn)定雙鏈，不能被DNApol校